楊柳清 李 亮 王思梅 黃蘇萍 王志塔 衡先培△

胰島素抵抗是糖脂代謝紊亂的中心環(huán)節(jié)，其中肝臟胰島素抵抗最為關(guān)鍵。HepG2細(xì)胞來源于人肝胚胎瘤細(xì)胞，保留了正常肝細(xì)胞的基本生物特性，其表面表達(dá)高親和力的胰島素受體調(diào)控葡萄糖攝取、糖原合成酶的活性、脂類生成等[1]，能較理想地模擬體內(nèi)葡萄糖代謝環(huán)境，是研究胰島素抵抗的理想細(xì)胞模型。LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路在糖脂代謝中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。前期研究表明，痰瘀同治的丹瓜方，具有改善糖脂代謝、改善胰島素抵抗，消除高糖的細(xì)胞毒性，恢復(fù)高糖中細(xì)胞生長的正常周期等作用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂誘導(dǎo)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，建立胰島素抵抗模型，予不同濃度的丹瓜方含藥血清干預(yù)，并以二甲雙胍含藥血清作為陽性對(duì)照，探討丹瓜方對(duì)LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，雄性，12周齡，體質(zhì)量：(220±10)g(購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)。環(huán)境溫度：(22±1)℃；濕度：50%±5%；12/12 h明暗周期。適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)1周，飲食、飲水、活動(dòng)正常。

1.2 藥物及試劑丹瓜方藥液由丹參、瓜蔞、赤芍、薤白、法半夏、郁金、川芎等組成。制劑由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥劑科配制，批號(hào)：120928，每毫升含原生藥含量3 g/ml。二甲雙胍藥液：上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H31022081。含藥血清的制備：取健康雄性SD大鼠15只，隨機(jī)分為丹瓜方組、二甲雙胍組和空白組，分別以6.67 ml/kg丹瓜方藥液、10 ml/kg二甲雙胍藥液及同體積生理鹽水灌胃，于第8天處死，腹主動(dòng)脈取血。HepG2細(xì)胞株(ATCC，USA)。雙抗(Hyclone公司)。軟脂酸(Sigma-Aldrich，USA)。牛血清白蛋白(不含脂肪酸)(北京索萊寶科技有限公司)。BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)。預(yù)染蛋白(Marker Thermo，Scientific，USA)。PVDF膜轉(zhuǎn)印膜(Merck Millipore)。牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備倒置顯微鏡(TS-100F，日本尼康)。自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar IC 1000，Countstar)。凝膠成像分析系統(tǒng)(721BR04812，BIORAD公司)。全自動(dòng)酶標(biāo)儀，ELX800，美國BioTek公司。凝膠成像分析系統(tǒng)，721BR04812，BIORAD公司。

2 方法

2.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)將HepG2細(xì)胞凍存管37 ℃水浴并融化，將凍存細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含新鮮完全培養(yǎng)液的離心管，吹打成細(xì)胞懸液后，離心，棄上清，加入培養(yǎng)液重懸，吸取懸液至培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，并觀察細(xì)胞貼壁情況。當(dāng)細(xì)胞貼壁至80%～90%時(shí)傳代，倒置顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞間隙增大、回縮近圓形且開始脫落時(shí)，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液于離心管中，離心5 min后棄去上清，加新鮮的培養(yǎng)液并吹打成細(xì)胞懸液，按1∶3傳代至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立及模型鑒定

根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[5,6]，本實(shí)驗(yàn)利用0.25 mmol/L PA濃度與4 g/L糖濃度共同體外培養(yǎng)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后成功建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型。用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖攝取能力鑒定HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型。

2.3 含藥血清實(shí)驗(yàn)濃度的篩選將HepG2細(xì)胞用胰酶消化后，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入不同濃度的丹瓜方含藥血清、二甲雙胍含藥血清和空白血清(2.5%，5%，10%，15%)分別干預(yù)12 h、24 h、36 h、48 h。與完全培養(yǎng)基組做對(duì)照，完全培養(yǎng)基組培養(yǎng)液為89%低糖DMEM培養(yǎng)液、10%FBS和1%雙抗。用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光值。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(完全培養(yǎng)基組OD-空白組OD)×100%。篩選出本實(shí)驗(yàn)各含藥血清干預(yù)HepG2細(xì)胞的適合濃度和適合作用時(shí)間。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)合分組如下：正常組：HepG2細(xì)胞+5%空白血清；溶劑組：HepG2細(xì)胞+溶劑溶液+5%空白血清；模型組：HepG2細(xì)胞+誘導(dǎo)液+5%空白血清；二甲雙胍組：HepG2細(xì)胞+誘導(dǎo)液+5%二甲雙胍含藥血清；5%丹瓜方組：HepG2細(xì)胞+誘導(dǎo)液+5%丹瓜方含藥血清；10%丹瓜方組：HepG2細(xì)胞+誘導(dǎo)液+10%丹瓜方含藥血清。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.5 檢測指標(biāo)及方法

2.5.1 測定各組葡萄糖消耗量及計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)用葡萄糖氧化酶法檢測上清液中葡萄糖殘留量。在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度，比較各組殘存糖濃度，計(jì)算出各組糖耗量和胰島素敏感性指數(shù)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，胰島素敏感性指數(shù)(%)=(葡萄糖消耗量實(shí)驗(yàn)組胰島素+-葡萄糖消耗量實(shí)驗(yàn)組胰島素-)/(葡萄糖消耗量正常組胰島素+-葡萄糖消耗量正常組胰島素-) ×100%。

2.5.2 測定各組三酰甘油(TG)按上述2.4實(shí)驗(yàn)分組加入含0.25 mmol/L PA與不同含藥血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)干預(yù)24 h后，用三酰甘油測試盒測定TG含量。

2.5.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)各組LKB1 P-AMPK AMPK P-ACC ACC蛋白表達(dá)藥物干預(yù)24 h后的HepG2細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解后提取總蛋白，檢測蛋白濃度。取等量蛋白樣品40 μg，最后加預(yù)染蛋白Marker 5 μl。經(jīng)緩沖液處理、蛋白變性、SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶顯影及儲(chǔ)存。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度大鼠血清對(duì)HepG2細(xì)胞活力影響10%空白血清、丹瓜方含藥血清和二甲雙胍含藥血清干預(yù)36 h、48 h細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，12 h、24 h細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；15%、20%空白血清、丹瓜方含藥血清和二甲雙胍含藥血清干預(yù)12 h、24 h、36 h、48 h細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.01)?？紤]干預(yù)后效果的明顯度，選用5%丹瓜方含藥血清作為干預(yù)濃度，10%丹瓜方含藥血清作為梯度對(duì)比濃度。見表1～表3。

表1 各組小鼠不同濃度空白血清對(duì)HepG2細(xì)胞生長活性影響比較

表2 各組小鼠不同濃度丹瓜方含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞生長活性影響比較

表3 各組小鼠不同濃度二甲雙胍含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞生長活性影響比較

3.2 各組含藥血清對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量 胰島素敏感指數(shù) TG含量影響模型組不含胰島素與含胰島素的糖耗量、胰島素敏感指數(shù)明顯下降(P<0.01)，TG含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，二甲雙胍組，5%丹瓜方組、10%丹瓜方組不含胰島素與含胰島素的糖耗量、胰島素敏感指數(shù)明顯升高(P<0.01)，TG含量明顯下降(P<0.01)。與二甲雙胍組比較，5%丹瓜方組含胰島素的糖耗量、胰島素敏感性指數(shù)下降(P<0.05)，5%丹瓜方組不含胰島素的糖耗量、TG含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；10%丹瓜方組不含胰島素與含胰島素的糖耗量、胰島素敏感性指數(shù)、TG含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠含藥血清對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量 胰島素敏感指數(shù) TG含量影響比較

3.3 含藥血清對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中LKB1 P-AMPKα AMPKα P-ACC ACC蛋白表達(dá)影響與正常組相比，模型組LKB1、AMPKα、P-AMPKα、P-ACC蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，ACC蛋白表達(dá)增多(P<0.01)；與模型組相比，二甲雙胍組、5%丹瓜方組、10%丹瓜方組LKB1、P-AMPKα、P-ACC蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，ACC蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，AMPKα蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05；##P<0.01。圖1 含藥血清對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中LKB1 P-AMPKα AMPKα P-ACC ACC蛋白表達(dá)影響

4 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化等臨床疾病的共同危險(xiǎn)因素。LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路與胰島素抵抗密切相關(guān)。AMPK是一種重要的蛋白激酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的感受器，最重要的功能是調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪代謝，它可以增強(qiáng)胰島素的敏感性，減少肝糖的輸出[8]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK基因剔除可誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗，AMPK過表達(dá)或AMPK特異性激活劑均具有胰島素增敏效應(yīng)[9]。LKB1是AMPK的上游激酶之一[10]，研究證實(shí)肝細(xì)胞中的LKB1有助于磷酸化AMPK，LKB1缺失可使AMPK功能下調(diào)。這說明在糖異生過程中，LKB1是AMPK信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵的靶分子，誘導(dǎo)的LKB1能夠通過控制AMPK在組織中的表達(dá)影響AMPK下游的通路。ACC是AMPK的下游靶點(diǎn)之一，是脂肪酸合成的限速酶，AMPKα的磷酸化對(duì)ACC活性的調(diào)節(jié)起重要作用，AMPKα的活化促進(jìn)ACC磷酸化，從而抑制ACC，ACC被AMPK磷酸化后失去活性，增強(qiáng)了脂肪酸氧化作用，使脂肪酸及TG合成減少，因此，細(xì)胞內(nèi)ACC磷酸化水平上調(diào)則被作為AMPKα活化的標(biāo)志[11-13]。因此本研究以LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討丹瓜方改善糖脂代謝和胰島素抵抗的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與正常組相比，模型組LKB1、AMPKα、P-AMPKα、P-ACC蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，ACC蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.01)，提示LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路在HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型表達(dá)異常，進(jìn)而影響葡萄糖和脂肪的代謝。二甲雙胍是臨床上常用的降糖藥物，研究表明，二甲雙胍調(diào)節(jié)糖脂代謝的分子機(jī)制與AMPK信號(hào)通路密切相關(guān)。二甲雙胍通過LKB1顯著增加AMPKα1亞基的磷酸化。文獻(xiàn)報(bào)道在LKB1基因敲除高脂飲食胰島素抵抗的小鼠中，二甲雙胍不降低血糖[10]，說明二甲雙胍通過激活LKB1-AMPK信號(hào)通路，使AMPK磷酸化，參與多個(gè)體內(nèi)能量代謝途徑，包括后續(xù)使ACC磷酸化后失活而促進(jìn)脂肪酸氧化，減少脂肪的合成[14，15]，繼而抑制肝臟的糖異生，改善胰島素敏感性，降低血糖水平[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5%丹瓜方組、10%丹瓜方組與二甲雙胍組相比，LKB1、P-AMPKα、P-ACC、ACC蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示丹瓜方顯著增加LKB1、P-AMPKα蛋白的表達(dá)，上調(diào)ACC的磷酸化水平，抑制ACC蛋白的表達(dá)，丹瓜方改善胰島素的敏感性的機(jī)制與二甲雙胍相似，都與調(diào)控LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路有關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為痰濁、瘀血既是胰島素抵抗的病理產(chǎn)物，也是進(jìn)一步導(dǎo)致“變證”“壞證”的病因。因此，解決痰瘀互結(jié)對(duì)改善胰島素抵抗有著至關(guān)重要的作用。丹瓜方是基于痰瘀互結(jié)的基本病機(jī)，立足于痰瘀同治的方劑。本研究結(jié)果表明，丹瓜方含藥血清可以增加高糖高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞抵抗模型的葡萄糖攝取能力，改善胰島素敏感指數(shù)，降低細(xì)胞內(nèi)TG含量，其中10%丹瓜方組與二甲雙胍組作用效果相當(dāng)，優(yōu)于5%丹瓜方組。由此可以看出，以活血化瘀祛痰之法組成丹瓜方復(fù)方，其作用相互協(xié)同，共同起到增加葡萄糖消耗量，提高胰島素敏感性，降低細(xì)胞內(nèi)TG沉積，從而起到改善胰島素抵抗的作用，且其作用存在劑量依賴關(guān)系。

綜上所述，丹瓜方可改善HepG2胰島素抵抗模型細(xì)胞糖脂代謝和胰島素抵抗，其調(diào)控的糖脂代謝的分子機(jī)制為調(diào)控LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路。但是丹瓜方調(diào)控LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路的機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步的深入研究。