劉慧娟，莊 蘇，張佳琦，周斌斌，熊 瑋，王 恬，王 超

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095)

在高度集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖模式下，熱應(yīng)激是影響動物生產(chǎn)的重要因素之一，特別是在我國南方地區(qū)，熱應(yīng)激可導(dǎo)致動物采食量與免疫力下降，嚴重影響動物生長發(fā)育和繁殖性能。熱應(yīng)激的作用機制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，它誘導(dǎo)機體組織中活性氧(ROS)過量聚積，導(dǎo)致氧化與抗氧化狀態(tài)失衡，脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸氧化，進而引起組織損傷，影響動物健康與生長。當機體組織中核因子E2相關(guān)因子2(2)被激活后可上調(diào)下游抗氧化酶基因的表達，提高抗氧化酶活性，有助于提高機體抗氧化能力，緩解機體熱應(yīng)激。熱應(yīng)激誘發(fā)氧化應(yīng)激是造成畜禽機體損傷的關(guān)鍵因素，氧化應(yīng)激是由于機體抗氧化調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致氧化中間產(chǎn)物過多，體內(nèi)自由基物質(zhì)大量堆積從而引起機體氧化損傷。在畜牧生產(chǎn)中，熱應(yīng)激對雄性動物生殖系統(tǒng)的影響更加突出，有研究指出，熱應(yīng)激可引起小鼠睪丸組織損傷，造成生精細胞凋亡。因此，熱應(yīng)激已成為動物生產(chǎn)過程中所面臨的重要挑戰(zhàn)之一，尋找緩解動物熱應(yīng)激的新型安全高效抗氧化劑已迫在眉睫。蘆丁(rutin)又稱蕓香甙，是主要來源于蕓香葉的一種黃酮類化合物，廣泛存在于多種藥用植物和食物中，為淡黃色或淡綠色針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，它具有抗氧化、抗炎、抗病毒等多種生物學功能。研究證明，日糧添加蘆丁可改善肥胖誘導(dǎo)的小鼠睪丸細胞結(jié)構(gòu)異常、精子數(shù)量下降現(xiàn)象，緩解小鼠睪丸損傷，同時還具有提高睪丸生精功能的潛力。因此推測，日糧添加蘆丁是一種潛在的緩解由熱應(yīng)激誘導(dǎo)的睪丸組織功能障礙的營養(yǎng)調(diào)控方式。所以，本試驗在構(gòu)建了熱應(yīng)激小鼠模型基礎(chǔ)上，進一步從組織形態(tài)、抗氧化、炎癥、增殖凋亡等方面系統(tǒng)評估日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸組織的影響，并初步探討其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及設(shè)計

將30只5周齡體重相近ICR系雄性小鼠(20～22 g，購于蘇州大學)隨機分為5組，各組小鼠分別飼喂基礎(chǔ)日糧添加0(CON組)、0(HS組)、250(HS+R250)、500(HS+R500)和1 000 mg·kg(HS+R1000)蘆丁的日糧(蘆丁購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司，純度 95%)，于清潔級動物房(溫度控制在(22±2)℃，相對濕度為55%～60%)飼養(yǎng)10 d 后，除對照組外，所有小鼠在每天10:00至14:00 之間禁食并置于42 ℃恒溫箱中連續(xù)處理8 d，具 體方法參照以往報道進行。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后稱重、腹腔注射5%水合氯醛(按體重計算用量，每10 g體重0.1 mL)麻醉后，眼球采血，脫頸致死，取睪丸稱重，并將左側(cè)睪丸置于4%多聚甲醛中固定，右側(cè)睪丸置凍存管內(nèi)，液氮迅速冷凍后置于-80 ℃ 低溫冰柜儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測定指標與方法

1.2.1 睪丸指數(shù) 睪丸指數(shù)=睪丸重(g)/空腹活體重(kg)

1.2.2 睪丸形態(tài)組織觀察 睪丸組織于4%多聚甲醛中固定48 h后，通過酒精、二甲苯處理，石蠟包埋、切片、伊紅和蘇木精(HE)染色后置于顯微鏡(ECLIPSE 80i型，尼康 日本)下觀察，采用Image J軟件參照Li等的研究報道測定生精小管直徑、橫截面積以及生精細胞脫落比率。

1.2.3 睪丸組織抗氧化酶活測定 取睪丸組織樣本(約100 mg)，按1∶9(質(zhì)量g/體積mL)的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴條件下勻漿，3 000 r·min離心15 min，取上清采用南京建成生物工程研究所(中國，南京)提供的試劑盒測定總蛋白(A045-3-1)、還原型谷胱甘肽(GSH，A006-1-1)與丙二醛(MDA，A003-1-1)含量，同時測定總超氧化物歧化酶(T-SOD，A001-1-1)活性和總抗氧化能力(T-AOC，A015-1-2)。

1.2.4 mRNA相對表達量測定 從-80 ℃冰箱中取0.1 g左右的睪丸組織樣品，使用TRIzol試劑(TaKaRa，大連)提取總RNA，通過qRT-PCR檢測目的基因mRNA表達，具體操作參照Zhang等進行。以-作為內(nèi)參基因，使用2方法計算各基因mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步整理后，使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析處理組間差異，并用Tukey法進行多重比較, 采用多項式中的線性和二次分析對不同濃度蘆丁的效果進行分析。結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 日糧添加不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸指數(shù)的影響

如圖1所示，HS組小鼠睪丸指數(shù)與CON組無顯著差異(>0.05)，與HS組相比，HS+R250組小鼠睪丸指數(shù)顯著增加(<0.05)，添加蘆丁組與CON組相比小鼠睪丸指數(shù)無顯著差異(>0.05)。

CON. 未經(jīng)高溫處理的對照組；HS. 熱應(yīng)激組；HS+R250. 日糧添加250 mg·kg-1蘆丁的熱應(yīng)激處理組；HS+R500. 日糧添加500 mg·kg-1蘆丁的熱應(yīng)激處理組；HS+R1000. 日糧添加1 000 mg·kg-1蘆丁的熱應(yīng)激處理組。柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同CON. Control group without high temperature treatment; HS. Heat stress group; HS+R250. Heat stress treatment group supplemented with 250 mg·kg-1 rutin; HS+R500. Heat stress treatment group supplemented with 500 mg·kg-1 rutin; HS+R1000. Heat stress treatment group supplemented with 1 000 mg·kg-1 rutin. Different lowercase letters on the column indicate significant difference (P<0.05), the same as below圖1 不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different doses of rutin on testis index of heat-stressed mice

2.2 日糧添加不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸形態(tài)的影響

由圖2可知，與CON組相比，HS組小鼠生精小管橫截面積和生精小管直徑顯著降低(<0.05)，生精細胞脫落比率顯著增加(<0.05)；與HS組相比，HS+R250組小鼠生精小管橫截面積顯著增加(<0.05)，生精細胞脫落比率顯著降低(<0.05)，生精小管直徑無顯著性差異(>0.05)，而HS+R500組生精細胞脫落比率顯著降低(<0.05)，HS+R1000組小鼠生精小管直徑顯著增加(<0.05)；蘆丁處理組小鼠睪丸生精小管直徑及生精小管脫落比率與CON組無顯著差異(>0.05)， 但HS+R250組小鼠睪丸生精小管橫截面積顯著高于CON組(<0.05)。

A. HE染色的小鼠睪丸組織，下排圖為相應(yīng)上圖矩形框內(nèi)結(jié)構(gòu)的放大，黑色箭頭指示的是生精細胞脫落情況；B. 生精小管橫截面積; C. 生精小管直徑; D. 生精細胞脫落比率A. HE stained mouse testicular tissue, the lower line of pictures are the enlargement of the structure in the corresponding rectangular box above， and the black arrow indicates the spermatogenic cells shed; B. Spermatogenic tubule cross-sectional area; C. Diameter of spermatogenic tubule; D. Spermatogenic cell shedding rate圖2 不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸組織形態(tài)的影響(HE染色)Fig.2 The effect of different doses of rutin on the morphology of heat-stressed mice testis (HE staining)

2.3 日糧添加不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸抗氧化功能的影響

如表2所示， HS組小鼠睪丸中MDA含量較CON組顯著增加(<0.05)，T-AOC活性與GSH含量顯著降低(<0.05)，T-SOD活性無顯著性差異(>0.05)；與HS組相比，HS+R250組MDA含量顯著降低(<0.05)，T-AOC與GSH含量顯著增加(<0.05)，HS+R500和HS+R1000組小鼠睪丸組織GSH含量顯著高于HS組(<0.05)，而蘆丁處理熱應(yīng)激小鼠睪丸組織中MDA、GSH含量以及T-AOC和T-SOD活性與CON組相比均無顯著性差異(>0.05)。

表2 不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸抗氧化功能的影響

2.4 日糧添加不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸抗氧化相關(guān)基因表達的影響

如圖3可知， HS組小鼠睪丸中-1 mRNA的表達量與CON組相比顯著降低(<0.05)；與HS組相比，HS+R250組2、-1、-基因的相對表達量顯著增加(<0.05)，HS+R500組2表達量顯著升高(<0.05)，HS+R1000組2表達量無顯著性差異(<0.05)。與CON組相比，HS+R250組2 mRNA表達量顯著增加(<0.05)，2與1 mRNA表達量在各組之間均無顯著性差異(>0.05)。

圖3 不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸抗氧化相關(guān)基因表達的影響Fig.3 The effect of different doses of rutin on the expression of antioxidant-related genes in the testis of heat-stressed mice

2.5 日糧添加不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸炎癥相關(guān)基因表達的影響

如圖4可知，與CON組相比，HS組小鼠睪丸-和-4表達量顯著增加(<0.05)，88、-1、-和-mRNA表達量無顯著性差異(>0.05)；與HS組相比，HS+R250組-、-4、88與-1mRNA表達量顯著降低(<0.05)，HS+R500組-和-4的mRNA表達量顯著下降(<0.05)，HS+R1000組中-mRNA的表達量也顯著低于HS組(>0.05)；日糧添加250～1 000 mg·kg蘆丁處理熱應(yīng)激小鼠睪丸組織中炎癥相關(guān)基因表達量與CON組之間未見顯著差異(>0.05)。

圖4 不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸炎癥相關(guān)基因表達的影響Fig.4 Effects of different doses of rutin on the expression of inflammation-related genes in the testis of heat-stressed mice

2.6 日糧添加不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸增殖與凋亡基因表達的影響

由圖5可知，與CON組相比，HS組基因的相對表達量顯著增加(<0.05)，-2表達量顯著降低(<0.05)；與HS組相比，HS+R250組mRNA表達量顯著降低(<0.05)，-2表達量顯著升高(<0.05)，HS+R1000組-2 mRNA表達量也顯著高于HS組(<0.05)，HS+R500組無顯著性變化(>0.05)；日糧添加250～1 000 mg·kg蘆丁處理熱應(yīng)激小鼠睪丸組織中增殖與凋亡相關(guān)基因表達量與CON組之間未見顯著差異(>0.05)。

圖5 不同劑量蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸增殖與凋亡基因表達的影響Fig.5 Effects of different doses of rutin on testis proliferation and apoptosis genes expression in heat-stressed mice

3 討 論

3.1 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸指數(shù)及睪丸形態(tài)的影響

睪丸是具有高度增殖能力的組織，大多數(shù)哺乳動物的睪丸位于低于體溫2～ 8 ℃的陰囊內(nèi)，對溫度非常敏感。溫度過高(如42 ℃)可使睪丸溫度升高，導(dǎo)致睪丸組織形態(tài)異常，抑制精子發(fā)生，影響精子成熟與存活。睪丸組織形態(tài)是反映睪丸組織功能與生殖能力的重要指標之一。吳璟等研究發(fā)現(xiàn)，將ICR小鼠下腹部連續(xù)7 d置于43 ℃ 恒溫水浴鍋中熱應(yīng)激處理15 min后可顯著降低小鼠睪丸系數(shù)，減少生精細胞數(shù)量，使小鼠睪丸生精上皮空泡變性及萎縮，從而改變睪丸形態(tài)，導(dǎo)致小鼠睪丸組織損傷誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。而本試驗結(jié)果顯示，HS組小鼠置于42 ℃恒溫箱中(4 h·d)連續(xù)熱處理8 d后睪丸指數(shù)與正常組無明顯變化，這可能與熱處理的方式和時間有關(guān)；但本試驗中熱處理小鼠睪丸組織生精小管直徑和橫截面積顯著降低，生精細胞脫落比率顯著增加，提示高溫處理可改變小鼠睪丸形態(tài)，引起睪丸組織損傷。Mehfooz等研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加蘆丁對束縛應(yīng)激引起的小鼠睪丸損傷、細胞凋亡以及精子形態(tài)具有一定的保護作用。在本試驗中日糧添加250 mg·kg蘆丁可使熱應(yīng)激小鼠睪丸指數(shù)和生精小管橫截面積顯著提高，添加1 000 mg·kg蘆丁顯著增加了熱應(yīng)激小鼠生精小管直徑，且添加250和500 mg·kg蘆丁均可顯著降低熱應(yīng)激小鼠生精細胞脫落比率，提示蘆丁可改變小鼠睪丸形態(tài)緩解睪丸損傷，這可能與蘆丁具有較好的抗氧化能力，緩解動物氧化應(yīng)激和促進睪丸生精功能密切相關(guān)，而添加1 000 mg·kg蘆丁對熱應(yīng)激小鼠生精細胞脫落比率無顯著性差異，提示蘆丁添加量過高對機體可能會產(chǎn)生一定的負面影響，但長期添加高劑量蘆丁對機體的影響及作用機制尚有待進一步研究。

3.2 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸抗氧化功能的影響

抗氧化酶是一種存在于細胞環(huán)境中的蛋白質(zhì)，它能通過調(diào)控抗氧化酶活性及數(shù)量來清除體內(nèi)自由基。GSH作為一種內(nèi)源性活性肽，能夠清除或中和體內(nèi)過氧化物質(zhì)和自由基，緩解機體氧化應(yīng)激。研究表明，日糧添加蘆丁對大鼠睪丸免受缺血再灌注損傷具有保護作用，這可能與蘆丁可提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性并增強GSH含量緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。與之相似，本試驗發(fā)現(xiàn)日糧中添加250、500和1 000 mg·kg蘆丁均能顯著提高熱應(yīng)激小鼠睪丸組織中GSH含量，發(fā)揮其抗氧化功能。此外，日糧添加250 mg·kg的蘆丁可顯著提高HS組小鼠睪丸組織T-AOC活性，顯著降低MDA含量。MDA是機體內(nèi)評價脂質(zhì)氧化損傷的重要指標，故本試驗結(jié)果提示，日糧添加250 mg·kg能夠有效抑制小鼠睪丸脂質(zhì)過氧化，緩解氧化應(yīng)激。在本試驗中日糧添加250、500和1 000 mg·kg蘆丁均未對睪丸組織中T-SOD活性產(chǎn)生顯著性影響，但韓雨薇等研究發(fā)現(xiàn)，對蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)大鼠給藥50 mg·kg蘆丁后可通過增加T-SOD與GSH-Px活性緩解SAH大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，此兩者結(jié)果不同的原因可能與蘆丁處理的劑量、方式或檢測組織不同有關(guān)。

2是一個與抗氧化功能密切相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)相關(guān)抗氧化基因表達影響抗氧化防御系統(tǒng)，如-1。-1作為一種抗氧化酶在應(yīng)激狀態(tài)下能夠保持機體細胞穩(wěn)定性，表達上調(diào)時可有助于增強機體抗氧化功能，緩解組織氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激小鼠睪丸組織中-1 mRNA的表達量顯著降低，而日糧添加250 mg·kg蘆丁可提高熱應(yīng)激小鼠睪丸2 mRNA表達量，上調(diào)-1和-mRNA的表達，且-1表達水平與對照組小鼠無顯著性差異。因此推測，日糧添加蘆丁緩解熱應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠睪丸氧化損傷功能可能與2/-1信號通路有關(guān)，這與王斌等研究發(fā)現(xiàn)灌胃蘆丁(每天100 mg·kg) 可通過2/-1信號通路緩解小鼠腎氧化應(yīng)激損傷的結(jié)果一致。蘆丁是從植物中提取的一種天然黃酮類物質(zhì)，多被認為是一種安全性物質(zhì)，但天然類物質(zhì)也可對機體造成不良影響。Féres等發(fā)現(xiàn)，添加2 000 mg·kg蕓香苷(dimorphandra mollis，蘆丁含量為(76±3)%)可對機體產(chǎn)生一定毒副作用。本研究也發(fā)現(xiàn)與250 mg·kg蘆丁組相比，日糧添加1 000 mg·kg蘆丁顯著降低了睪丸組織中2 mRNA表達量，提示日糧添加高劑量蘆丁并未線性提高其抗氧化功能，這可能與高劑量蘆丁可對機體產(chǎn)生一定副作用有關(guān)，但其具體機制尚需要進一步研究。

3.3 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸炎癥因子相關(guān)基因表達的影響

熱應(yīng)激可以導(dǎo)致炎癥因子增加、抗炎因子下降，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。-介導(dǎo)的信號通路參與體內(nèi)多種反應(yīng)，-4可激活-通路介導(dǎo)下游炎癥因子表達。有研究表明，-4/-信號通路與抗炎免疫機制密切相關(guān)，被認為是經(jīng)典的炎癥相關(guān)信號通路。88是一種髓樣蛋白分子，處于-4信號通路的下游，參與-4基因所介導(dǎo)的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，-4通過88途徑使-信號通路被激活,合成并釋放-、-1等相關(guān)促炎癥因子，完成炎癥反應(yīng)信號的傳遞。本試驗結(jié)果表明，熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠睪丸組織中-4/-信號通路被激活，88和-1基因表達顯著增強，這與鞏棟梁研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激狀態(tài)下豬腸道組織中-4/-信號通路被激活后上調(diào)-6等相關(guān)促炎癥因子表達，從而導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)的結(jié)果一致。大量研究表明，蘆丁在增強機體免疫的同時也可抑制多個促炎因子基因表達，并對大鼠腎組織具有較強的抗炎作用。Yeh等研究表明,蘆丁能顯著抑制-表達，降低-1、-、-6等多種促炎癥因子的水平，具有較強的抗炎作用。本試驗結(jié)果顯示，日糧添加250、500和1 000 mg·kg蘆丁均顯著抑制了小鼠睪丸組織-mRNA的表達量，同時添加250和500 mg·kg蘆丁可使-4表達量顯著降低，且當添加劑量為250 mg·kg時，HS組小鼠睪丸中88與-1mRNA表達量也顯著下降，故推測熱應(yīng)激小鼠日糧中添加250 mg·kg蘆丁可能通過抑制-4/-信號通路下調(diào)相關(guān)炎癥因子的表達發(fā)揮抗炎作用。

3.4 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激小鼠睪丸增殖與凋亡基因表達的影響

-2是一個重要細胞凋亡基因，能夠抑制細胞凋亡、參與細胞增殖調(diào)控，在組織器官生長發(fā)育及正常功能發(fā)揮方面具有重要作用。是-2的同源基因，當表達過量可自身結(jié)合成同源二聚體, 促進凋亡發(fā)生。何萌萌等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在43 ℃環(huán)境中水浴 20 min可引起睪丸生精細胞凋亡，導(dǎo)致生殖障礙?？诜?5和150 mg·kg蘆丁可抑制小鼠腎炎癥和細胞凋亡。本試驗結(jié)果顯示，連續(xù)熱處理8 d(42 ℃，4 h·d)后使小鼠睪丸組織中基因表達量顯著增加，而日糧添加250 mg·kg蘆丁顯著抑制熱應(yīng)激小鼠睪丸mRNA的表達；添加250和1 000 mg·kg蘆丁顯著增加-2 mRNA的表達量，這與添加250 mg·kg蘆丁可降低熱應(yīng)激小鼠睪丸生精細胞脫落比率的結(jié)果相吻合，提示日糧添加適宜劑量蘆丁對改善熱應(yīng)激小鼠睪丸組織損傷及抑制細胞凋亡具有重要作用。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果提示，日糧添加適宜劑量蘆丁具有改善熱應(yīng)激小鼠睪丸組織形態(tài)及功能的效果，其機制可能與蘆丁通過2信號通路緩解氧化應(yīng)激，通過-4/-信號通路抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)控/-2 mRNA表達密切相關(guān)。本試驗條件下日糧添加250 mg·kg蘆丁效果較好。