郭閆葵,盧文文,張曉燕

(1.濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250012；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

非癡呆性血管性認(rèn)知障礙(VCIND)是血管性認(rèn)知障礙的早期階段,多項(xiàng)研究證實(shí)高同型半胱氨酸(Hcy)是VCIND的獨(dú)立危險因素[1-2],且Hcy水平與認(rèn)知功能障礙程度呈正相關(guān)[3],故對其監(jiān)測及干預(yù)有重要研究價值。醒神健腦方具有補(bǔ)腎泄?jié)岬墓π?，已在臨床應(yīng)用多年。為進(jìn)一步揭示醒神健腦方的具體作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)Hcy由蛋氨酸代謝產(chǎn)生的機(jī)制,通過蛋氨酸飼料喂養(yǎng)建立大鼠高Hcy血癥模型,再篩選產(chǎn)生VCIND動物模型，觀察大鼠行為學(xué)及血Hcy、氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，探討該方改善認(rèn)知功能的作用機(jī)制，從而為VCIND的臨床防治提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 60只SD雄性大鼠,體重約250 g,7周齡,購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司,許可證號:SCXK(魯)20190003。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物中心清潔級動物房內(nèi),飼養(yǎng)溫度20～25 ℃,濕度維持在50%～60%,晝夜節(jié)律正常,自由進(jìn)食飲水,每周更換1～2次墊料。在正式實(shí)驗(yàn)前普通飼料喂養(yǎng)1周,并且所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動物倫理要求。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 3%蛋氨酸飼料由北京科奧協(xié)力公司生產(chǎn)。醒神健腦方(由制首烏12 g、女貞子12 g、當(dāng)歸10 g、膽南星10 g、川芎15 g、菖蒲10 g、遠(yuǎn)志6 g、郁金10 g、赤芍12 g、丹參15 g、地龍10 g、黃芩10 g、陳皮6 g組成)由濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備為丸劑,制備方法：制首烏、女貞子加水2 000 mL,浸泡60 min,煎煮60 min,取煎液,備用，其余12味藥粉碎至100目。起模,用上藥煎液作為賦型劑,泛制法制丸,干燥,滅菌,包裝。實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水將丸劑制備成0.3 g/mL(4.5 g/kg)的混懸液,約為成人(70 kg)用量的1.25倍。

1.3試劑和儀器 滅菌毛細(xì)管(濟(jì)南凱博)，EP管(濟(jì)南凱博)，水合氯醛(濟(jì)南凱博)，大鼠Hcy ELISA試劑盒(上?？祈?，超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法,南京建成)，丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法,南京建成)，一氧化氮(NO)測定試劑盒(酶法/比色法,南京建成)，96孔酶標(biāo)板(南京建成)；臺式冷凍離心機(jī)(eppenddorf 5424R/5810R)，水浴恒溫振蕩器(上海龍躍)，恒溫孵育箱(上海龍躍)，全波長酶標(biāo)儀(BioTek Cytation 5)，漩渦混合器(VORTEX-5)，微量移液器(eppenddorf)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將60只大鼠隨機(jī)分為3組,每組20只。空白組喂普通飼料，模型組和醒神健腦方組喂3%蛋氨酸飼料,連續(xù)3個月，剔除Hcy<12.94 μmol/L大鼠,然后進(jìn)行水迷宮檢測排除肢體殘疾、視力障礙及先天愚笨大鼠，以空白組大鼠的平均逃避潛伏期為標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行篩選,超過其20%的視為造模成功。最終空白組7只、模型組12只、醒神健腦方組11只納入研究。之后醒神健腦方組大鼠給予醒神健腦方混懸液4.5 g/kg(1 mL/100 g)灌胃,模型組、空白組給予等量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃14 d。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1行為及認(rèn)知功能 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：水迷宮測試前將大鼠提前30 min搬運(yùn)至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以適應(yīng)環(huán)境,并確保每日在固定時間測試。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:將平臺(直徑約12 cm)放置于水池(直徑約120 cm,深度約50 cm)第四象限內(nèi),水池內(nèi)蓄水,水溫保持在20～22 ℃,水面在平臺上方2～3 cm,幾何圖形懸掛在水池周圍的簾子上作為空間參考。在SuperMaze軟件上設(shè)置相關(guān)參數(shù)及標(biāo)記平臺位置后,在水中放入食用黑色素以隱蔽平臺。操作過程中開紅光照射,并以簾子遮擋光線,期間保持周圍環(huán)境安靜,避免光線和聲音對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。實(shí)驗(yàn)共歷時6 d。①定位航行實(shí)驗(yàn):共5 d，訓(xùn)練時間設(shè)置為120 s，測量指標(biāo)為逃避潛伏期。測試時選取Morris水迷宮任意象限任意一點(diǎn)，將大鼠面朝池壁扔入水中,追蹤并記錄其找到平臺所花費(fèi)的時間,記為逃避潛伏期。若大鼠在120 s內(nèi)成功尋上平臺,則在臺上停留10 s；若超過120 s，將其拎上平臺并保持15 s(潛伏期記為120 s)。每個入水點(diǎn)視為一次訓(xùn)練，每日訓(xùn)練2次，2次訓(xùn)練之間間隔15～20 min，取2次訓(xùn)練數(shù)據(jù)均值作為當(dāng)天學(xué)習(xí)成績。②空間探索實(shí)驗(yàn):第6天,將水中平臺撤去,記錄大鼠在120 s內(nèi)進(jìn)入第四象限(目標(biāo)象限)的次數(shù)及停留時間。

1.5.2血液學(xué)指標(biāo) 采血前禁食12 h,自由飲水。使用10%水合氯醛麻醉大鼠,待其四肢癱軟后,剪去胡須以防止溶血,左手固定并壓迫大鼠頸部,使靜脈充盈,出現(xiàn)眼球突出征象后,右手持滅菌毛細(xì)管,45°旋轉(zhuǎn)刺入大鼠內(nèi)眥眼眶后壁,感到阻力后,將毛細(xì)管略往后退,血液即流入毛細(xì)管內(nèi),以EP管接放血液。血液在室溫下靜置1～2 h后，放入4 ℃冰箱凝固過夜，次日將血液以2 000～3 000 r/min離心15～20 min，然后分離血清。按說明書檢測血清Hcy、SOD、MDA、NO水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠逃避潛伏期比較 各組大鼠的逃避潛伏期均逐漸縮短,除第4天外,空白組和醒神健腦方組大鼠的逃避潛伏期均明顯短于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組及非癡呆性血管認(rèn)知障礙各組大鼠逃避潛伏期比較

2.2各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 空白組和醒神健腦方組大鼠進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)均明顯多于模型組(P均<0.05),目標(biāo)象限停留時間均明顯長于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 空白組及非癡呆性血管認(rèn)知障礙各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3各組大鼠血清Hcy水平比較 灌胃結(jié)束后，空白組血清Hcy水平無明顯變化(P>0.05),模型組、醒神健腦方組血清Hcy水平均有不同程度的下降(P均<0.05),且醒神健腦方組明顯低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 空白組及非癡呆性血管認(rèn)知障礙各組大鼠血清Hcy水平比較

2.4各組大鼠血清SOD、MDA、NO水平比較 與空白組比較,模型組大鼠血清SOD、NO水平均明顯降低(P均<0.05)，血清MDA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較,醒神健腦方組大鼠血清SOD、NO水平均明顯升高(P均<0.05)，血清MDA水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

3 討 論

食物中的蛋氨酸攝入體內(nèi)之后,先合成S-腺苷蛋氨酸(SAM),SAM的甲基高度活化,在相關(guān)酶作用下,把甲基轉(zhuǎn)移到DNA、腎上腺素和神經(jīng)遞質(zhì)上,然后自身變成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),最后進(jìn)一步脫腺苷生成Hcy[4]。維生素B12和葉酸由食物攝入，充當(dāng)人體內(nèi)催化反應(yīng)的酶和輔助因子。在正常情況下，Hcy、酶和輔助因子處于相互調(diào)節(jié)的平衡中，若大量攝入含有蛋氨酸的食物或是因?yàn)檫z傳、性別、年齡、藥物等影響打破此平衡，輔助因子相對減少，超出代謝負(fù)荷的Hcy累積，表現(xiàn)為高Hcy血癥。目前動物實(shí)驗(yàn)中多采用高濃度蛋氨酸來制備高Hcy模型,喂養(yǎng)方式以灌胃、飲水、普通飼料+蛋氨酸為主,濃度多采用1%，1.5%，2%，3%等[5-7]。結(jié)合文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)要求,本實(shí)驗(yàn)采用3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)大鼠，使大鼠體內(nèi)蛋氨酸代謝負(fù)荷而出現(xiàn)Hcy蓄積,建立高Hcy血癥模型。高Hcy可通過抑制體內(nèi)抗氧化酶活性、促進(jìn)氧自由基的過度生成和阻礙脂質(zhì)代謝等作用,引起血管內(nèi)皮損傷,導(dǎo)致氧化應(yīng)激、平滑肌增生、凝血機(jī)制失衡等一系列反應(yīng),使血液循環(huán)障礙,腦部供血不足，認(rèn)知受損[8]。另外，高Hcy可阻礙SAH正常代謝，引起SAH增高，而SAH具有強(qiáng)效抑制甲基轉(zhuǎn)移酶活性的作用,可阻礙腦組織內(nèi)的甲基化過程,引起神經(jīng)元損傷及細(xì)胞凋亡[9]；過量的Hcy代謝反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，大量ROS使機(jī)體的抗氧化能力處于超負(fù)荷狀態(tài)，繼而引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，即氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。當(dāng)ROS氧化作用發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞的膜通透性增加，細(xì)胞凋亡，勢必會影響血管的循環(huán)運(yùn)輸作用，大腦灌注不足，氧氣與能量缺乏，加劇神經(jīng)元功能的缺失和不足；高Hcy的高反應(yīng)性可過度激活N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體,產(chǎn)生興奮性毒性,引起氧自由基產(chǎn)生和Ca2+超載,進(jìn)而破壞神經(jīng)元突觸可塑性,加速神經(jīng)元功能退化[11]；高Hcy還可抑制SAM生成,導(dǎo)致體內(nèi)甲基提供不足,影響神經(jīng)遞質(zhì)和DNA等物質(zhì)生成，增強(qiáng)β淀粉樣蛋白毒性[12]；當(dāng)體內(nèi)的Hcy(SAH水解產(chǎn)生)超出代謝負(fù)荷而大量堆積時，作為甲基供體的SAM就會減少，進(jìn)而引起神經(jīng)遞質(zhì)合成減少，神經(jīng)信號傳遞受阻，引起認(rèn)知功能障礙[12]。有動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高Hcy可改變海馬基因表達(dá),導(dǎo)致與認(rèn)知相關(guān)的神經(jīng)活動配體-受體神經(jīng)通路甲基化水平下降,引起大鼠認(rèn)知功能下降[13]；亦可通過影響突觸可塑性,損傷海馬認(rèn)知區(qū)域及降低內(nèi)源性營養(yǎng)因子等作用導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能下降[14]。由此可見，利用高Hcy制備VCIND模型具有實(shí)操可能性。

在正常情況下,體內(nèi)的氧化和抗氧化作用保持動態(tài)平衡,以維持機(jī)體的正常功能。氧化應(yīng)激反應(yīng)可通過損傷血管和神經(jīng)元等多種途徑引起認(rèn)知障礙。Hcy濃度過高時可抑制體內(nèi)抗氧化酶的活性,使ROS異常蓄積，導(dǎo)致內(nèi)皮活性物質(zhì)NO失活，促進(jìn)炎癥因子黏附,影響血管內(nèi)皮功能,導(dǎo)致血液循環(huán)受阻,腦組織灌注不足,出現(xiàn)認(rèn)知障礙[15-16]。ROS還能以生物膜為靶點(diǎn),不斷攻擊膜上的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化,破壞神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能；攻擊DNA等核酸大分子,可引起DNA突變,引起神經(jīng)退行性病變[17]。另外ROS攻擊脂質(zhì)所產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物MDA還能反作用于線粒體呼吸鏈,引起能量循環(huán)障礙,進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激損傷[18],引起神經(jīng)元凋亡。氧化應(yīng)激參與認(rèn)知障礙病理機(jī)制的多個環(huán)節(jié),對其干預(yù)治療有助于改善認(rèn)知功能。SOD是人體內(nèi)主要的抗氧化酶之一,可催化超氧陰離子,引起歧化反應(yīng),抑制體內(nèi)氧自由基的過度氧化[19-20]；MDA是脂質(zhì)氧化的最終代謝產(chǎn)物,可體現(xiàn)脂質(zhì)出現(xiàn)氧化損傷的程度[21]；NO是血管內(nèi)皮釋放的重要活性物質(zhì),具有舒張血管、抗血小板聚集等作用,自由基產(chǎn)生過多時可導(dǎo)致其氧化失活,含量降低,可反映血管內(nèi)皮功能[22],并側(cè)面反映氧化應(yīng)激損傷程度。

本課題組在查閱大量文獻(xiàn)和前期研究的基礎(chǔ)上，提出腎陰虧虛是VCIND發(fā)生與發(fā)展的根本原因，痰濁瘀血內(nèi)蘊(yùn)、釀生濁毒為發(fā)病過程中的基本環(huán)節(jié)，據(jù)此制訂了補(bǔ)腎泄?jié)岬闹委熢瓌t，創(chuàng)立醒神健腦方用于VCIND的治療。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長,大鼠進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時間短，血清Hcy、MDA水平明顯升高,SOD、NO水平明顯降低，證實(shí)高Hcy可破壞體內(nèi)氧化與抗氧化平衡,引起氧化應(yīng)激反應(yīng),影響大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。與模型組比較，醒神健腦方組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，大鼠進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)增多，目標(biāo)象限停留時間延長，血清Hcy、MDA水平明顯降低,SOD、NO水平明顯升高，說明醒神健腦方可通過增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活性,抑制自由基過度生成,減輕氧化應(yīng)激損傷,改善大鼠認(rèn)知功能。

綜上所述，醒神健腦方可提高VCIND大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制與降低血清Hcy水平,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。但模型組大鼠未進(jìn)行藥物干預(yù)血清Hcy有一定降低，考慮模型存在些微不穩(wěn)定性，另外本實(shí)驗(yàn)樣本量少,有待擴(kuò)大樣本量、延長觀察時間進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。