郭麗娟

（河南省新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院 兒科，河南 新鄉(xiāng) 457300）

支氣管哮喘是兒科常見慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，有報道顯示14 歲以下人群發(fā)病率約為3%～4%；目前該病已成為影響兒童生長發(fā)育重要疾病，給家庭及社會和帶來極大負擔［1］。目前有關(guān)支氣管哮喘病因及發(fā)病機制仍存在爭議，大部分學者認為支氣管哮喘發(fā)生受多種因素綜合影響，除環(huán)境因素外遺傳因素亦在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［2］。核轉(zhuǎn)錄因子STAT3 已被證實可參與到人體正常生理、感染及腫瘤病理生理改變；有報道證實不同免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生可由相同基因多態(tài)性介導并能夠相互影響疾病通路調(diào)節(jié)［3］；而STAT3 基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎易感性有關(guān)［4］?；谝陨献C據(jù)，本次研究納入河南省新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院2018 年1 月至2020 年1 月收治的小兒支氣管哮喘患兒260 例和體檢健康兒童290例，采用SSP-PCR 法檢測核轉(zhuǎn)錄因子STAT3 基因單核苷酸多態(tài)性（SNP），探討本地區(qū)小兒支氣管哮喘發(fā)病與相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子等位基因間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究納入河南省新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院2018 年1 月至2020 年1 月收治的小兒支氣管哮喘患兒260 例和體檢健康兒童290 例；支氣管哮喘患兒中男148 例，女112 例，年齡4～9 歲，平均（6.27±2.40）歲；體檢健康兒童中男158 例，女132 例，年齡4～8 歲，平均（6.09±2.27）歲。兩組性別和年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標準

支氣管哮喘組：均符合兒童變應性哮喘診斷及分度標準［5］，年齡≤14 歲，同時排除川崎病、炎癥性腸病及其他免疫系統(tǒng)疾病；體檢健康組：年齡≤14 歲，近4 周無感染或發(fā)熱，排除近4 周使用激素或免疫抑制劑，既往過敏或其他免疫系統(tǒng)疾病史。研究方案經(jīng)河南省新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準，且患兒家長知情同意。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取和引物設計 抽取外周靜脈血2 mL 加入EDTA 抗凝管，取200 μL 采用DNA 提取試劑盒（Qiagen）完成目標DNA 提取，置入-80℃冰箱待檢。引物設計合成由英濰捷基公司完成，根據(jù)已知STAT3 基因組序列設計SNP 位點正向引物，包含SNP 位點質(zhì)控正向引物和通用反向引物。具體引物情況：rs2293152 特異正向引物為AACGCGCCTACTTCTTTCCTGCCC，特異反向引物為TAAGTTCCTCTCCTGGCTGTTCCG；rs957970 特異正向引物為CTTATGACATTCTCCAGGTTCATC；特異反向引物為TCTCGTCACGTTTACAAGTAATGCT。

1.3.2 SSP-PCR 反應和瓊脂糖凝膠電泳 采用25 μL 反應體系，包括特異性引物0.5 μL、質(zhì)控正向引物0.5 μL、通用反向引物1 μL、2×PowerTaq Master Mix 12.5μL、DNA 模板2μL，最后加入ddH2O 補足25 μL。rs2293152 反應條件設置：95℃預變性5 min，95℃變性30 s 共8 個循環(huán)，60℃退火45 s，72℃延伸45 s；95℃變性30 s 共25 個循環(huán)，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。rs957970 反應條件設置：95℃預變性5 min，95℃變性30 s 共35 個循環(huán)，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL PCR 產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠（15 g/L），電泳儀電壓設定110 V，電泳35 min，采用耶拿UVP Gelstudio touch 凝膠成像儀顯像。

1.3.4 質(zhì)控PCR 產(chǎn)物測序及驗證 每個位點隨機抽樣選取3 分樣本采用質(zhì)控正向引物和通用反向引物擴增，擴增產(chǎn)物包含SNP 位點，產(chǎn)物送至英濰捷基完成直接測序，將測序SNP 位點基因型結(jié)果和SSP-PCR 檢測結(jié)果對比驗證。

1.4 統(tǒng)計學方法

選擇SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗；相對危險度評估采用優(yōu)勢比法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H-W 遺傳平衡檢驗分析

H-W 遺傳平衡檢驗分析顯示，對照組STAT3基因兩個SNP 位點基因型分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示納入研究對象具有群體代表性。

2.2 PCR 產(chǎn)物測序質(zhì)控結(jié)果分析

隨機抽取樣本采用質(zhì)控引物擴增后含SNP 位點產(chǎn)物直接測序基因型結(jié)果與SSP-PCR 法檢判定基因型相同，證實SSP-PCR 法檢測基因位點準確。

2.3 兩組基因型和等位基因分布差異分析

支氣管哮喘組rs2293152 位點CC 基因型比例高于體檢健康組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；支氣管哮喘組rs2293152C/G 位點C 等位基因比例高于體檢健康組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C 等位基因兒童發(fā)生支氣管哮喘風險為G 等位基因1.57 倍（=1.57，95%CI：1.07～2.33）。兩組rs957970 位點基因型和等位基因比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組基因型和等位基因分布差異分析 ［n(%)］

3 討論

支氣管哮喘目前已成為全球性疾病，在發(fā)達國家和發(fā)展中國家發(fā)病率均較高，同時發(fā)病率、致死致殘率和病死率均呈逐年增高趨勢；而小兒支氣管哮喘患兒往往會對生長發(fā)育及身心健康產(chǎn)生不利影響［6］。如何進一步探索明確支氣管哮喘病因及發(fā)病機制以實現(xiàn)疾病早期預防對于改善兒童生活質(zhì)量及遠期預后越來越受到醫(yī)學界的關(guān)注。

喘息是學齡前兒童呼系統(tǒng)常見癥狀之一，根據(jù)病情進展情況可分為早期一過性喘息、早期持續(xù)性喘息及遲發(fā)性喘息或哮喘［7］。一般僅存在特應性因素的遲發(fā)性喘息患兒可進展形成支氣管哮喘；對于此類患兒早期診斷早期干預理論上可降低小兒支氣管哮喘發(fā)病風險，但目前臨床仍沒有具有較高準確性和特異性預測指標［4］。支氣管哮喘已被證實屬于多基因遺傳性疾病，直系親屬發(fā)病比例可達35%～75%［8］。近年來探索支氣管哮喘致病基因等分子遺傳學研究不斷深入，候選基因定位克隆是目前疾病易感基因主要遺傳學分析方法，目前200 個以上支氣管哮喘發(fā)病候選基因已被篩選，參與到機體炎性反應、免疫識別及細胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)到等多種生物學活動，如人類白細胞抗原Ⅱ（HLA II）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、Toll樣受體及白細胞介素（IL）等，基因型均與支氣管哮喘有關(guān)［9-10］。

核轉(zhuǎn)錄因子STAT3 可在人體內(nèi)多種組織及細胞中表達，作為一種DNA 結(jié)合蛋白，其在無功能狀態(tài)下被胞外信號激活，磷酸化后在細胞核內(nèi)與特異DNA 片段結(jié)合，進而調(diào)控相應基因轉(zhuǎn)錄表達，發(fā)揮調(diào)解細胞增殖分化、腫瘤發(fā)生及感染進展等多方面［11-12］。已有研究［13］顯示，支氣管哮喘模型小鼠呼吸道上皮平滑肌細胞STAT3 基因敲除后，塵螨抗原激發(fā)呼吸道反應性顯著下降，推測STAT3 可能參與到支氣管哮喘病情進展過程中。另有報道［14］提示，支氣管哮喘患兒血清STAT3 表達水平可見顯著提高。此外SSP-PCR 法檢測基因多態(tài)性位點與直接測序法檢測結(jié)果具有較高一致性，檢測快速且價格相對低廉［2］，故本研究采用SSP-PCR 法分析STAT3 基因多態(tài)性與小兒支氣管哮喘間關(guān)系。

本次研究采用SSP-PCR 法檢測本地區(qū)STAT3基因，結(jié)果顯示本地區(qū)STAT3 基因rs2293152 和rs957970 均存在SNP，其中rs2293152 位點基因型分布頻率與國外報道存在差異［15］，筆者認為這可能與納入人群種族和地區(qū)差異有關(guān)。同時支氣管哮喘組rs2293152 位點CC 基因型比例高于體檢健康組（P＜0.05）；支氣管哮喘組rs2293152C/G 位點C 等位基因比例高于體檢健康組（P＜0.05）；C 等位基因兒童發(fā)生支氣管哮喘風險為G 等位基因1.57 倍（=1.57，95%CI：1.07～2.33），證實表明rs2293152C/G 位點C等位基因可能與小兒支氣管哮喘發(fā)生有關(guān)，屬于易感基因，故可針對此類人群可能早期干預。但兩組rs957970 位點基因型和等位基因比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），則說明rs957970 位點SNP 與小兒支氣管哮喘發(fā)生無關(guān)。以上結(jié)果為明確小兒支氣管哮喘致病基因提供更為充足證據(jù)。

本次研究亦存在一定不足：①作為小樣本單中心回顧性報道，所得結(jié)論無法完全排除混雜因素影響；②因臨床資料不全無法進一步分析rs2293152 位點多態(tài)性與小兒支氣管哮喘疾病嚴重程度相關(guān)性，而是否可影響STAT3 基因表達及生理功能仍需后續(xù)研究確證。

綜上所述，本地區(qū)小兒支氣管哮喘發(fā)病與STAT3 基因rs2293152C/G 位點有關(guān)，其中C 等位基因可能為常見易感基因。