闞鵬，顧家燁，芮敏，惠宇堅(jiān)，沈建國

（東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院 骨科，江蘇 無錫 214400）

創(chuàng)傷、燒傷、癌性潰瘍、糖尿病足等各種原因?qū)е碌能浗M織缺損創(chuàng)面是一類常見病，容易造成膿毒癥、截肢等嚴(yán)重后果，給患者帶來巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。皮膚移植是修復(fù)此類創(chuàng)面的常用方法，但存在缺少供區(qū)、造成新?lián)p傷和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)［2］。近年來，促進(jìn)軟組織重建的生物材料獲得臨床應(yīng)用。這些材料通過特定的空間結(jié)構(gòu)、生物信號和生物力學(xué)刺激引導(dǎo)組織重建，可避免組織移植或減少自體組織的用量［3］。一些研究顯示，脫細(xì)胞基質(zhì)能顯著促進(jìn)組織原位重建［4］，但存在制備工藝難以控制、疾病傳播、核酸殘留等缺點(diǎn)。而合成支架材料因原料性質(zhì)穩(wěn)定、制備工藝易于控制等優(yōu)點(diǎn)能有效避免上述不足。臨床現(xiàn)有的合成支架材料如膠原蛋白支架能為修復(fù)細(xì)胞提供三維生長空間，但由于缺乏對修復(fù)細(xì)胞的趨化活性以及誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的功能，合成支架材料促進(jìn)組織重建的速度緩慢，在嚴(yán)重軟組織缺損創(chuàng)面如肌腱外露創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用受到限制［5］。臨床聯(lián)合應(yīng)用負(fù)壓封閉引流系統(tǒng)和膠原蛋白支架，以促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞長入支架，從而加速組織新生。因此，具有對修復(fù)細(xì)胞的趨化活性和誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的合成支架材料成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

本研究的目的是構(gòu)建體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源細(xì)胞外基質(zhì)（bone-marrow mesenchymal stem cell-derived ECM,BM-ECM）和Ⅰ型膠原蛋白的復(fù)合支架（BM-ECM/膠原蛋白支架），通過引入BM-ECM，賦予膠原蛋白支架對修復(fù)細(xì)胞的趨化活性，以及促進(jìn)細(xì)胞遷移和長入支架內(nèi)部的功能。通過掃描電子顯微鏡觀察材料的微觀結(jié)構(gòu)，并測試了材料的傅里葉紅外吸收光譜。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)檢測在BM-ECM/膠原蛋白支架影響下成纖維細(xì)胞的過膜率，并檢測了在BM-ECM/膠原蛋白支架作用下成纖維細(xì)胞劃痕傷口愈合率。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過小鼠皮下埋植模型，檢測了長入BM-ECM/膠原蛋白支架的細(xì)胞密度并觀察了細(xì)胞在支架中的分布情況，并通過免疫組織化學(xué)觀察了成纖維細(xì)胞在支架中的分布。本研究構(gòu)建了一種對修復(fù)細(xì)胞具有趨化活性并增強(qiáng)細(xì)胞遷移的復(fù)合支架，為軟組織缺損修復(fù)提供新材料，也為新型軟組織缺損創(chuàng)面修復(fù)材料的設(shè)計(jì)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原代細(xì)胞取自6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，6只，體重（18.2±0.9）g。動物實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠為6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，12 只，體重（18.5±1.4）g。所有動物均購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)均遵循東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院和國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用的規(guī)定。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物）；鼠尾Ⅰ型膠原蛋白、2 500 u/mg 胃蛋白酶（上海Sigma-Aldrich 公司）；蘇木精-伊紅染色試劑盒、抗ER-TR7 抗體［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］；其他試劑均由國藥集團(tuán)和賽默飛中國有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SU-1510 型掃描電子顯微鏡（日本株式會社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所）；CX23 生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Ti2 激光共聚焦顯微鏡［尼康儀器（上海）有限公司］。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 支架的制備 按文獻(xiàn)［6］所述方法分離和培養(yǎng)6 周齡C57BL/6J 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，待傳至第4 代時(shí)，將生長至100% 融合的細(xì)胞在含有50 mmol/L 抗壞血酸的DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 周，PBS 潤洗，加入含20 mmol/L 氫氧化銨的1% 曲拉通PBS 溶液，常溫孵育5 min 將細(xì)胞裂解；用細(xì)胞鏟刮離培養(yǎng)物，然后用100 IU/mL 的DNase Ⅰ常溫處理1 h，以除去培養(yǎng)物中的DNA；30 000 g 離心20 min，獲得BM-ECM，并用生理鹽水潤洗和離心，重復(fù)3 次；用含0.1%胃蛋白酶的0.01 mol/L 鹽酸溶液（3 mL/75 cm2培養(yǎng)瓶）常溫下消化BM-ECM，過夜；加入333 μL 的10×PBS 溶液中和消化液，并用PBS 進(jìn)行透析（截留分子量15 kD），獲得BM-ECM 溶液，采用Pierce BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定終溶液的蛋白水平為（0.29±0.04）mg/mL。BM-ECM/膠原蛋白支架的制備：取含0.5%I 型膠原蛋的乙酸溶液8 mL，加入2 mL 上述BM-ECM 溶液，用勻漿機(jī)在冰浴條件下混勻，離心除去氣泡；將所得溶液按500 μL/孔加入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置在-80℃冰箱冷凍凝固；冷凍干燥后，在飽和戊二醛蒸汽環(huán)境中放置15 min 后取出，放于常溫真空干燥箱中1 h，除去多余的戊二醛分子，得到交聯(lián)的BM-ECM/膠原蛋白支架；用生理鹽水代替BM-ECM 溶液且不改變其他支架制備過程和條件，獲得膠原蛋白支架。

1.3.2 FT-IR 和SEM 采用NicoletiS10 衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀測試BM-ECM/膠原蛋白支架和單純膠原蛋白支架的紅外吸收光譜，檢測范圍4 000～500 cm-1，溫度為室溫，分辨率為4 cm-1。將支架裁成5 mm×5 mm×2 mm 的正方體，用導(dǎo)電膠粘貼在掃描電子顯微鏡臺上，支架內(nèi)部切片朝上，經(jīng)干燥和噴金處理后，觀察支架內(nèi)部微觀形貌。

1.3.3 支架皮下埋植動物實(shí)驗(yàn) 將12 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，行異氟烷吸入性麻醉，用脫毛膏脫除小鼠背部毛發(fā)，用乙醇和碘伏消毒手術(shù)區(qū)域，在消毒區(qū)域中線兩側(cè)各制作長度5 mm 的縱向切口，切口距離大于1 cm；用組織剪撐開切口肉膜和筋膜，將直徑為5 mm、厚度為1.5 mm 的BM-ECM/膠原蛋白支架和單純膠原蛋白支架植入肉膜和筋膜之間的口袋，左側(cè)植入BM-ECM/膠原蛋白支架，右側(cè)植入單純膠原蛋白支架，縫合切口，消毒。術(shù)后5 d、10 d，隨機(jī)取6 只小鼠，經(jīng)二氧化碳安樂死后，切取埋植支架及相鄰皮膚組織，用40 g/L 多聚甲醛固定12 h，一半進(jìn)行冰凍切片，切片厚度5 μm，剩余一半進(jìn)行脫水、石蠟包埋和切片，切片厚度為4 μm。石蠟切片按生產(chǎn)廠家說明書行蘇木精-伊紅染色；冰凍切片行抗ER-TR7 免疫化學(xué)染色，行ER-TR7 抗體（1∶100）和山羊抗兔Alexa Fluor 647 標(biāo)記二抗（1∶200）孵育，并用DAPI 復(fù)染。采用正置顯微鏡觀察蘇木精-伊紅染色切片，激光共聚焦顯微鏡觀察ER-TR7 染色切片。使用Image J 軟件進(jìn)行圖像處理和細(xì)胞計(jì)數(shù)，選取H&E 圖像中距離支架上緣約0.1 mm、邊長為0.1 mm 的正方形區(qū)域，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算細(xì)胞密度。。

1.3.4 纖維細(xì)胞趨化和劃痕愈合體外實(shí)驗(yàn) 將第3 代人真皮成纖維細(xì)胞（Sigma-Aldrich，美國）復(fù)蘇12 h 后，用含1%牛血清白蛋白的DMEM 培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，胰酶消化，用含10%牛血清白蛋白的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×105/mL；在Transwell 上室中加入200 μL 人真皮成纖維細(xì)胞懸液，下室分別加入500 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（空白）或含BM-ECM/Col 支架或Col支架（約5 mg 干質(zhì)量）的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育12 h、24 h 后，取上室，用棉簽徹底擦除濾膜上表面細(xì)胞，然后用結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照，并按下列公式計(jì)算過膜細(xì)胞密度：細(xì)胞密度（/mm2）=視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量÷視野面積（mm2）。復(fù)蘇、消化和重懸細(xì)胞同趨化實(shí)驗(yàn)。將重懸的細(xì)胞接種于24 孔板，接種密度5.0×104/cm2，細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)兩三天，細(xì)胞長至80% 融合，用200 μL 移液器槍頭在孔中央畫1 條劃痕，吸除培養(yǎng)基，加入1 mL DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（空白）或含BM-ECM/Col 支架或含Col 支架（約5 mg 干質(zhì)量）的DMEM 培養(yǎng)基，在0 h、24 h、48 h 時(shí)，于100 倍鏡下拍照并計(jì)算細(xì)胞向劃痕中央遷移距離與初始距離的百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗(yàn)或方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架微觀結(jié)構(gòu)

掃描電鏡觀察顯示，BM-ECM/膠原蛋白支架和單純膠原蛋白支架內(nèi)部均呈相互連通多孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布在100 μm 左右，見圖1。兩種支架的多孔結(jié)構(gòu)和孔徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.396,P=0.703）。

圖1 兩種支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖片

2.2 傅里葉紅外吸收光譜

兩種支架都存在膠原蛋白肽鍵Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ特征吸收峰，分布在1 300～1 700 cm-1區(qū)間。相比單純膠原蛋白支架，BM-ECM/膠原蛋白支架在1 235 cm-1出現(xiàn)特征峰，提示磺酸基團(tuán)（S=O 伸縮震動）的存在；在1 200 cm-1的吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，提示糖環(huán)（異頭C-O-C 伸縮振動）的存在，見圖2?；撬峄鶊F(tuán)和糖環(huán)的特征吸收峰表明BM-ECM/膠原蛋白支架中存在糖胺聚糖、低聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)分子。

圖2 兩種支架的傅里葉紅外吸收光譜

2.3 小鼠皮下埋植支架中遷入細(xì)胞的密度

蘇木精-伊紅染色顯示，術(shù)后5 d 時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)在兩種支架的淺部區(qū)域，并有少量細(xì)胞散布于深部區(qū)域；術(shù)后10 d 時(shí)，BM-ECM/膠原蛋白支架深部區(qū)域出現(xiàn)大量細(xì)胞，單純膠原蛋白支架的深部區(qū)域分布的細(xì)胞較少，見圖3。定量結(jié)果顯示，BM-ECM/膠原蛋白支架內(nèi)部的代表性區(qū)域的細(xì)胞密度為（2.86±0.34）×103/mm2，高于單純膠原蛋白支架（1.33±0.21）×103/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.581,P＜0.001）。

圖3 小鼠皮下埋植支架中的細(xì)胞遷入和分布情況（蘇木精-伊紅染色）

2.4 成纖維細(xì)胞在支架中的分布

通過抗小鼠ER-TR7 免疫染色顯示了成纖維細(xì)胞在支架中的分布。術(shù)后10 d，BM-ECM/膠原蛋白支架內(nèi)部的細(xì)胞大部分為ER-TR7 陽性，這些細(xì)胞在支架內(nèi)部均勻分布。而單純膠原蛋白支架中，ER-TR 陽性細(xì)胞集中分布于淺部區(qū)域，見圖4。上述結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞遷入BM-ECM/膠原蛋白支架的能力顯著高于單純膠原蛋白支架。

圖4 小鼠皮下埋植支架中的成纖維細(xì)胞分布情況（抗ER-TR7 免疫染色和DAPI 細(xì)胞核染色）

2.5 支架對成纖維細(xì)胞趨化作用

孵育12 h 后，與單純膠原蛋白支架和無支架相比，下室放置BM-ECM/膠原蛋白支架條件下，穿過Transwell 膜的人真皮成纖維細(xì)胞明顯較多，見圖5A；孵育24 h 后，BM-ECM/膠原蛋白支架、單純膠原蛋白支架、無支架3 種條件下，相比12 h 時(shí)，過膜細(xì)胞均有所增多。定量分析結(jié)果顯示，孵育12 h、24 h 后，相比單純膠原蛋白支架或空白支架，BM-ECM/膠原蛋白支架作用下穿過Transwell 嵌套膜的細(xì)胞數(shù)均著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.96,P＜0.001），見圖5B。

圖5 支架對人成纖維細(xì)胞的趨化作用

2.6 支架對成纖維細(xì)胞遷移的影響

為了明確支架成分對細(xì)胞遷移運(yùn)動的影響，評價(jià)了支架存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中時(shí)人真皮成纖維細(xì)胞劃痕愈合情況。結(jié)果表明，BM-ECM/膠原蛋白支架存在于培養(yǎng)基中時(shí)，人真皮成纖維細(xì)胞劃痕的愈合相比單純膠原蛋白支架和無支架存在時(shí)明顯增快，見圖6A；24 h、48 h 后，BM-ECM/膠原蛋白支架作用下劃痕愈合率均高于單純膠原蛋白支架和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=158.4,P＜0.001），見圖6B。

圖6 人成纖維細(xì)胞的劃痕傷口愈合情況

3 討論

缺乏誘導(dǎo)內(nèi)源細(xì)胞遷移和遷入支架的調(diào)控活性是膠原蛋白支架有限促組織重建能力的關(guān)鍵原因。該研究的目的是建立一種增強(qiáng)膠原蛋白支架促進(jìn)組織重建功能的方法，即通過引入體外培養(yǎng)和獲取的BM-ECM 賦予膠原蛋白支架調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動以及遷入支架的活性。研究結(jié)果表明，BMECM/膠原蛋白支架為連通多孔結(jié)構(gòu)，與膠原蛋白支架相似，BM-ECM 膠原蛋白支架促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動和遷入支架的能力相比單純膠原蛋白支架顯著增強(qiáng)。

為提高膠原蛋白支架促進(jìn)細(xì)胞遷入的功能，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）等生物活性因子被引入支架中以增強(qiáng)細(xì)胞在支架中的黏附和形成聚集態(tài)［7-8］。此外，有關(guān)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或其外泌體提高合成支架材料促組織修復(fù)性能的研究較多［9-11］。利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或其外泌體誘導(dǎo)內(nèi)源細(xì)胞遷入膠原蛋白支架，實(shí)現(xiàn)支架重塑和大鼠創(chuàng)面愈合［12］。這些方法廣泛證實(shí)了通過引入生物活性因子改善膠原蛋白支架提高細(xì)胞遷入功能的可行性。但上述方法存在生物活性因子易失活、細(xì)胞存活率低、制備方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。

BM-ECM 是以I 型膠原蛋白為主要成分且包含生長因子、趨化因子和蛋白聚糖等微量分子的混合物，因此，其提取過程簡單且易于控制，并且BM-ECM/膠原蛋白支架的制備條件簡單，具有與膠原蛋白支架相似的多孔結(jié)構(gòu)。通過傅里葉紅外吸收光譜檢測糖胺聚糖的特征吸收峰能簡便、快速確證BM-ECM 的引入。制備BM-ECM/膠原蛋白支架，在提高材料生物活性的同時(shí)，有望解決復(fù)雜制備工藝的問題。

組織缺損后募集內(nèi)源細(xì)胞是組織重建的基礎(chǔ)，利用生物材料為這些細(xì)胞提供三維空間是發(fā)揮細(xì)胞自身修復(fù)功能的基礎(chǔ)，其前提是細(xì)胞遷入。引入膠原蛋白支架后，BM-ECM 顯著增強(qiáng)內(nèi)源性細(xì)胞遷入支架的能力，大部分細(xì)胞為間質(zhì)細(xì)胞如ERTR7+成纖維細(xì)胞。與臨床現(xiàn)有合成材料相比，部分異種組織脫細(xì)胞基質(zhì)如膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)［13］、小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)［14］、羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)等組織細(xì)胞外基質(zhì)具有顯著提高組織重建細(xì)胞遷入的活性［15］。組織細(xì)胞外基質(zhì)來源水凝膠也顯示了對軟組織缺損修復(fù)能力以及對成血管細(xì)胞的促遷移活性［16］。BM-ECM 與上述細(xì)胞外基質(zhì)在結(jié)構(gòu)、組成上具有相似性［17］，除了I 型膠原蛋白，還含有糖胺聚糖、生物活性因子等調(diào)控細(xì)胞行為的生物大分子，是BM-ECM 促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷入膠原蛋白支架的關(guān)鍵成分。另外，相比通過加載生物活性因子如趨化因子和生長因子使膠原蛋白支架產(chǎn)生對成纖維細(xì)胞趨化活性和促進(jìn)這些細(xì)胞遷入支架和促進(jìn)組織新生活性的方法，本研究采用的BM-ECM 不僅制備方法簡單，是天然的生物活性分子的螯合基質(zhì)，有利于提高這些分子的生物利用度，產(chǎn)生優(yōu)異的促組織新生效果。

細(xì)胞運(yùn)動是軟組織重建細(xì)胞遷入支架的關(guān)鍵過程，受到生物活性因子的調(diào)控。研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白、血小板衍生生長因子-BB等生物活性因子的存在增強(qiáng)了成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞等細(xì)胞的趨化性和趨觸性［18-20］。BM-ECM 不僅含有血小板衍生生長因子-BB、等生物活性因子［21］，還含有基底膜蛋白多糖等蛋白糖，其能提高生物活性因子的生物利用度［22-23］，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動和遷移能力，這可能是BM-ECM 提高膠原蛋白支架促細(xì)胞遷入功能改善的重要機(jī)制。通過引入BM-ECM 使膠原蛋白支架具有促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動和遷入的活性，其中的關(guān)鍵生物活性因子及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，為BM-ECM/膠原蛋白支架的優(yōu)化及其在軟組織缺損創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

綜上所述，本研究建立了一種增強(qiáng)膠原蛋白支架促進(jìn)細(xì)胞遷入活性的方法，通過引入BMECM 使膠原蛋白支架產(chǎn)生誘導(dǎo)組織重建細(xì)胞遷入支架的活性，并且顯著增強(qiáng)人真皮成纖維細(xì)胞的運(yùn)動、遷移能力；構(gòu)建的BM-ECM/膠原蛋白支架新材料具有在軟組織缺損創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用潛力。