張佳旭，儲(chǔ)子儀，吳振華，石家福

（天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

功能糖是一類(lèi)糖類(lèi)碳水化合物，具有一系列獨(dú)特的功效，包括低熱量、降血糖、抗齲齒、改善腸道菌群等，在醫(yī)藥與食品安全領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[1-2]。作為蔗糖的重要取代物，功能糖具有巨大的市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿Α９δ芴枪I(yè)化生產(chǎn)已成為新型生物制造產(chǎn)業(yè)鏈之一。大力發(fā)展綠色生物制造，應(yīng)堅(jiān)持綠色、交叉、創(chuàng)新、協(xié)調(diào)發(fā)展。基于酶催化和細(xì)胞催化的生物法合成功能糖路徑契合綠色生物制造的基本內(nèi)涵。為解決生物法中酶或細(xì)胞不能重復(fù)利用、穩(wěn)定性差的問(wèn)題，越來(lái)越多的固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于功能糖生物制造。本文對(duì)用于功能糖生物制造的固定化酶或固定化細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為功能糖的綠色生物制造提供一定的參考。

1 功能糖

功能糖主要包括功能性單糖、功能性低聚糖、功能性糖醇等。功能性單糖是一類(lèi)具有獨(dú)特功效的單糖，包括甘露糖、阿洛酮糖、塔格糖、氨基葡萄糖等。一些單糖例如果糖，可通過(guò)腸壁吸收進(jìn)身體，進(jìn)入血流并儲(chǔ)存起來(lái)。如果儲(chǔ)存的時(shí)間足夠長(zhǎng)，某些碳水化合物將會(huì)轉(zhuǎn)變成脂肪。而功能性單糖如D-阿洛酮糖，對(duì)脂肪肝酶有抑制作用，可阻止體內(nèi)脂肪的堆積，對(duì)腸道α-糖苷酶有抑制作用，可抑制血糖濃度的升高。功能性低聚糖是指通過(guò)糖苷鍵將2個(gè)～10個(gè)單糖連接形成的直鏈或支鏈的低度聚合糖，包括異麥芽低聚糖、低聚果糖等。功能性低聚糖在進(jìn)入大腸后會(huì)直接被雙歧桿菌所利用，不會(huì)在人體腸胃道內(nèi)被消化吸收[3]。功能性糖醇是含有2個(gè)以上羥基的多元醇類(lèi)甜味劑，由相應(yīng)糖分子上的醛基或酮基還原成羥基可得到糖醇，包括甘露醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚糖醇等。

目前功能糖的合成方法主要有化學(xué)法和生物法。較為常見(jiàn)的化學(xué)法為關(guān)環(huán)轉(zhuǎn)換合成法和兩步合成法，其存在反應(yīng)條件苛刻、副產(chǎn)物多、產(chǎn)率較低、環(huán)境污染等問(wèn)題。生物法通過(guò)酶催化轉(zhuǎn)化合成功能糖。由于具有反應(yīng)條件溫和、特異性高、可持續(xù)性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[4]，近年來(lái)，越來(lái)越多基于生物法合成功能糖的路徑被開(kāi)發(fā)并投入工業(yè)應(yīng)用。

2 功能糖的合成路徑

基于生物法合成功能糖的路徑主要分為單酶/多酶催化合成路徑和全細(xì)胞催化合成路徑兩類(lèi)。單酶催化合成路徑的底物與產(chǎn)物單一，而多酶催化合成路徑通過(guò)級(jí)聯(lián)方式控制多個(gè)酶發(fā)生一系列反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)由低價(jià)值化學(xué)品到高價(jià)值功能糖的定向、高效、連續(xù)轉(zhuǎn)換[5]。全細(xì)胞催化合成路徑將全細(xì)胞、組織甚至個(gè)體作為催化劑，利用胞內(nèi)酶進(jìn)行催化。與酶催化相比，全細(xì)胞催化省去酶的純化操作，從而降低經(jīng)濟(jì)成本。功能糖的合成路徑?jīng)Q定了后續(xù)固定化技術(shù)中涂層的設(shè)計(jì)和制備。固定化酶材料的設(shè)計(jì)與制備需要考慮催化酶自身性質(zhì)，如酶的尺寸、酶的最適溫度、最適pH值等。固定化細(xì)胞材料的設(shè)計(jì)與制備需要考慮細(xì)胞自身性質(zhì)，如細(xì)胞膜/壁的組成成分、細(xì)胞的最適溫度、最適pH值等。

常用功能糖的單酶/多酶催化合成路徑見(jiàn)表1。

表1 常用功能糖的單酶/多酶催化合成路徑Table 1 Single-enzyme/multi-enzyme catalyzed synthetic pathways for commonly used functional sugars

目前功能糖的合成路徑傾向于選擇廉價(jià)易得、安全無(wú)毒的淀粉、葡萄糖、果糖等作為底物，選擇轉(zhuǎn)化率高的催化反應(yīng)路徑用于功能糖生物制造。常用功能糖的全細(xì)胞催化合成路徑見(jiàn)表2。

表2 常用功能糖的全細(xì)胞催化合成路徑Table 2 Whole-cell catalyzed synthetic pathway for commonly used functional sugars

作為常見(jiàn)的構(gòu)建酶表達(dá)重組細(xì)胞，大腸桿菌具備易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、重組體穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但含有內(nèi)毒素，不能用于食品生產(chǎn)。與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌由于無(wú)外膜，其分泌的蛋白質(zhì)可以直接擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，且枯草芽孢桿菌為食品級(jí)，不含內(nèi)毒素。釀酒酵母也具有易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，但其存在基因表達(dá)低、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)等不足。與其他微生物相比，谷氨酸棒桿菌可以同時(shí)利用多種碳源，且對(duì)芳香族化合物的耐受性更高[39]。

2.1 D-阿洛酮糖的合成路徑

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體，甜度約為蔗糖的70%[40]，熱量值為0.007 kcal/g，能量為蔗糖的0.3%[41-42]。2014年，D-阿洛酮糖被正式批準(zhǔn)為一般公認(rèn)安全，可添加在食品、膳食補(bǔ)充劑以及醫(yī)藥制劑中[43]。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族是一種催化酮單糖C-3位置使其發(fā)生異構(gòu)化的酶，能夠催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖，包括D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶[44]，D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶[45]，酮糖3-差向異構(gòu)酶[46]。其中，D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的反應(yīng)中具有最高的效率，在2006年由Kim等[47]首次發(fā)現(xiàn)。通過(guò)使用D-葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來(lái)源于瘤胃菌），可從520 g/L的D-葡萄糖和380 g/L的D-果糖中獲得135 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為15%[7]。通過(guò)使用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌），可從700 g/L的D-果糖中獲得230 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為32.9%[8]。D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來(lái)源于珀氏解黃酮菌）在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)。通過(guò)使用經(jīng)過(guò)透化處理的重組谷氨酸棒桿菌，可從750 g/L的D-果糖中獲得235 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為31% 、353 g/（L·h）[28]。此外，最新的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)的磷酸化/去磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使用幾種嗜熱酶可從10、50 g/L的麥芽糊精（淀粉衍生物）中分別獲得48.5、217.8 mmol/L的D-阿洛酮糖，產(chǎn)率分別為88.2% 和79.2%[10]。

2.2 D-甘露糖的合成路徑

D-甘露糖是D-葡萄糖的C-2差向異構(gòu)體，甜度約為蔗糖的60%[48]。D-甘露糖異構(gòu)酶[11]、D-來(lái)蘇糖異構(gòu)酶[12，49]、D-甘露糖 2-差向異構(gòu)酶[13]和纖維二糖 2-差向異構(gòu)酶[14]可將D-葡萄糖或D-果糖轉(zhuǎn)化為D-甘露糖，具有實(shí)現(xiàn)D-甘露糖大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。通過(guò)使用纖維二糖2-差向異構(gòu)酶（來(lái)源于極端嗜熱纖維素降解菌），可從500 g/L的D-葡萄糖中獲得75 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為15% 、25 g/（L·h）[14]。通過(guò)使用來(lái)蘇糖異構(gòu)酶（來(lái)源于斯氏普魯菲登菌），可從600 g/L的D-果糖中獲得150 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為25% 、75 g/（L·h）[49]。與來(lái)蘇糖異構(gòu)酶（來(lái)源于斯氏普魯菲登菌）相比，甘露糖異構(gòu)酶（來(lái)源于大腸桿菌）可得到相同的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率[11]。通過(guò)使用來(lái)蘇糖異構(gòu)酶（來(lái)源于海洋嗜熱桿菌），可從400 g/L的D-果糖中獲得101.6 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為25.4% 、11.28 g/（L·h）[12]。通過(guò)兩種D-甘露糖2-差向異構(gòu)酶（分別來(lái)源于飄軟古字狀菌和雙歧桿菌），可從500 g/L的D-葡萄糖中分別獲得122、114 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率分別為24.4% 、22.8% ，產(chǎn)率分別為2.54、2.38 g/（L·h）[13]。

2.3 D-塔格糖的合成路徑

D-塔格糖甜度約為蔗糖的92% ，熱量為蔗糖的38%[50]。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶能夠催化D-山梨糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，在20世紀(jì)90年代由Saburi等[20]首次發(fā)表。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶也可用于催化D-半乳糖合成D-塔格糖[51]。D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)中通常使用乳糖作為廉價(jià)原料，在偏酸性條件下水解為D-半乳糖，進(jìn)而酶法合成D-塔格糖。通過(guò)使用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（來(lái)源于植物乳桿菌）可兩步法催化牛奶乳清粉中的乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，從140 g/L乳糖的牛奶乳清粉中獲得51.5 g/L的D-塔格糖，產(chǎn)率為0.54 g/（L·h）[17]。通過(guò)使用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（來(lái)源于植物乳桿菌WU14）生產(chǎn)D-塔格糖，轉(zhuǎn)化率為69.6%[18]。

3 固定化技術(shù)

酶自身存在最適pH值、最適溫度等約束條件，這對(duì)于實(shí)際工業(yè)操作是不利的。固定化酶/細(xì)胞后可提高酶的耐用性，擴(kuò)大酶/細(xì)胞的適用范圍。高溫可抑制細(xì)菌的外來(lái)污染，提高反應(yīng)速率，但對(duì)于游離酶，高溫會(huì)直接降低酶活，影響酶的催化效率，對(duì)于細(xì)胞，高溫會(huì)引起細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的通透性發(fā)生變化，進(jìn)而發(fā)生酶損壞或酶泄露，最終導(dǎo)致全細(xì)胞催化效率降低。固定化技術(shù)解決了這一問(wèn)題，通常在固定化酶或固定化細(xì)胞后，酶的熱穩(wěn)定性提高，即可以在更高溫度下保持活性，有利于功能糖的連續(xù)高效生產(chǎn)[52]。

3.1 固定化酶

酶固定化技術(shù)指將酶限制在不同于底物和產(chǎn)物存在的固體載體或基質(zhì)上[53]。固定化酶的方法可分為吸附法（將酶吸附在載體上）、包埋法（將酶在載體內(nèi)部封裝）、交聯(lián)法（酶不額外使用載體自固定）和共價(jià)法（載體上活潑的反應(yīng)基團(tuán)和酶形成共價(jià)鍵）[54]。相比游離酶，固定化酶可以循環(huán)使用，易于從反應(yīng)體系中分離，因此生產(chǎn)成本降低。另外，固定化酶的穩(wěn)定性通常高于游離酶，比如能夠耐受一定高溫，pH值耐受范圍變廣。但在固定化過(guò)程中可能存在一定的問(wèn)題，如酶活損失，還有某些酶經(jīng)固定化后底物特異性發(fā)生改變，這可能與底物結(jié)合口袋的變化有關(guān)[55]。為了解決這些問(wèn)題，應(yīng)針對(duì)不同種類(lèi)酶的反應(yīng)條件選擇合適的載體和固定化方法，調(diào)控優(yōu)化固定化條件。用于合成功能糖的固定化酶載體主要為天然高分子材料（海藻酸鈉[16，56]、殼聚糖[26，57-59]等）、合成高分子材料（離子交換樹(shù)脂[49，60-61]、環(huán)氧樹(shù)脂[62-63]、聚丙烯腈[64]、聚乙烯醇[27，65]等）、納米材料（有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化納米花[66]、氧化石墨烯[67-68]、納米纖維素[69-70]、磁性納米粒子[23，61]等）。

3.1.1 天然高分子材料

海藻酸鈉是一種天然高分子多糖，成本低廉且具有良好的生物相容性，常被用于固定化酶領(lǐng)域。通過(guò)滴加法或乳化法，海藻酸鈉分子鏈段中的羧基可以與多價(jià)陽(yáng)離子（通常為鈣離子）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使溶膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)。海藻酸鈉通常與戊二醛共固定化酶，防止包埋在海藻酸鈣微球中的酶泄漏。戊二醛作為交聯(lián)劑，可用于連接酶和載體，但其戊二醛對(duì)酶蛋白具有一定的毒性，需控制戊二醛用量，減少對(duì)酶活的抑制作用。通過(guò)海藻酸鈉與戊二醛的包埋-交聯(lián)法，孫玉英等[56]對(duì)殼聚糖酶和β-D-氨基葡萄糖苷酶混合液進(jìn)行固定，用于從殼聚糖中獲得D-氨基葡萄糖，固定化酶的酶活為38.5% 。Rai等[16]通過(guò)同樣方法對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定，用于生產(chǎn)D-塔格糖。在40℃～60℃下，固定化酶的酶活能保留在80% 以上。在填充床反應(yīng)器中循環(huán)使用6次后，轉(zhuǎn)化率可達(dá)90% 以上，第7次轉(zhuǎn)化率降低至63% ，第8次轉(zhuǎn)化率降低至44% 。

殼聚糖由甲殼素形成，甲殼素作為地球上存量最多的氨基多糖，主要分布于甲殼動(dòng)物的殼中、真菌細(xì)胞壁等地方。殼聚糖帶有大量活性氨基，屬于陽(yáng)離子聚電解質(zhì)，可通過(guò)靜電吸附作用與陰離子聚電解質(zhì)發(fā)生聚集現(xiàn)象[71]。李曉波等[57]通過(guò)殼聚糖固定D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，并在填充床中利用固定化酶持續(xù)轉(zhuǎn)化D-果糖為D-阿洛酮糖。固定化酶的酶活回收率可達(dá)45% ，且在填充床中反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為24% 、6.7 g/（L·h），在反應(yīng)168 h后，轉(zhuǎn)化率仍然能保留13% 以上。將吸附與交聯(lián)法相結(jié)合，耿夢(mèng)華等[58]通過(guò)殼聚糖與戊二醛的吸附-交聯(lián)法固定蔗糖異構(gòu)酶（來(lái)源于重組短小芽孢桿菌）。固定化酶的酶活回收率最高可達(dá)70.3% ，異麥芽酮糖的產(chǎn)率達(dá)到87.8% 。固定化酶循環(huán)使用16次后，產(chǎn)率仍能保留87.52% 。Chen等[26]通過(guò)同樣方法固定α-葡萄糖苷酶（來(lái)源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌），該固定化酶可與其他成本相對(duì)較低的游離酶和淀粉共同作為底物用于生產(chǎn)異麥芽低聚糖。納米二氧化硅比表面積大，富含羥基基團(tuán)，可由正硅酸乙酯的溶膠-凝膠過(guò)程形成，用于固定化酶領(lǐng)域[72]。納米二氧化硅形成過(guò)程中，正硅酸乙酯水解生成硅羥基，硅氧基團(tuán)之間會(huì)發(fā)生縮聚反應(yīng)最終形成高度網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)。王艷君等[59]通過(guò)殼聚糖與正硅酸乙酯形成的溶膠-凝膠雜化載體與戊二醛固定殼聚糖酶，用于生產(chǎn)氨基葡萄糖。固定化酶在4℃條件下，酶半衰期約為28 d，循環(huán)使用10次后，酶活損失小于30% 。

3.1.2 合成高分子材料

常用于固定化酶的樹(shù)脂主要為離子交換樹(shù)脂和環(huán)氧樹(shù)脂。離子交換樹(shù)脂具備較高的機(jī)械強(qiáng)度，且樹(shù)脂的粒徑基本在 300 μm～800 μm，適合裝柱，利于固定化酶與反應(yīng)液的后續(xù)分離，但是固定化基本依賴(lài)于離子交換作用，酶負(fù)載少且在不利環(huán)境中易解吸。Li等[60]通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂D301固定D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來(lái)源于重組短小芽孢桿菌），用于從D-果糖中獲得D-阿洛酮糖。固定化酶的酶活為（24.06±0.80）U/g載體，產(chǎn)率為（90.0±2.8）% ，將其循環(huán)使用10次后，酶活仍能保留約70% 。Park等[49]通過(guò)使用Duolite樹(shù)脂A568固定D-來(lái)蘇糖異構(gòu)酶（來(lái)源于斯氏普魯菲登菌），可從300 g/L的D-果糖中獲得75 g/L的D-甘露糖，23個(gè)周期后轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為25% 、75g/（L·h）。金輝[61]通過(guò)強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂Amberlite FPA90 Cl固定D-甘露糖異構(gòu)酶，固定化酶的酶活為19.21 U/g載體，將其循環(huán)使用8次后，酶活保留80.8% 。

環(huán)氧樹(shù)脂不僅具有機(jī)械強(qiáng)度高、固定化酶易于從反應(yīng)體系中分離的優(yōu)點(diǎn)，也解決了離子交換樹(shù)脂易解吸的問(wèn)題。環(huán)氧樹(shù)脂中的環(huán)氧基可與酶蛋白表面的基團(tuán)（如氨基、巰基）反應(yīng)會(huì)形成牢固的共價(jià)鍵，酶穩(wěn)定不易解吸。Torres等[62]將β-半乳糖苷酶、L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和D-葡萄糖異構(gòu)酶單獨(dú)固定并共同固定在環(huán)氧樹(shù)脂Eupergit C和Eupergit C 250 L上，用于生產(chǎn)塔格糖。具有共固定化穩(wěn)定三酶系統(tǒng)的單反應(yīng)器工藝可實(shí)現(xiàn)完全乳解，產(chǎn)生45% 的D-塔格糖和39% 的D-果糖，D-塔格糖產(chǎn)率為9.5 g/（L·h）～10 g/（L·h），可循環(huán)使用至少12次。Bu等[63]采用離子交換、共價(jià)結(jié)合、戊二醛交聯(lián)法，將D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶固定在環(huán)氧樹(shù)脂Reli Zyme HFA403/M上，固定化酶的酶活為103.48 U/g載體。引入甘氨酸使甘氨酸的氨基與固定化酶殘余的環(huán)氧基、醛基發(fā)生反應(yīng)，可阻斷殘余基團(tuán)與酶蛋白的進(jìn)一步結(jié)合，控制過(guò)度共價(jià)結(jié)合。在循環(huán)使用8次后，未經(jīng)甘氨酸阻斷和經(jīng)甘氨酸阻斷的固定化酶的酶活分別保留89.98% 和105.43% 。

聚丙烯腈是一種由85% 以上丙烯腈與第二、第三單體聚合而成的高分子聚合物[73]，穩(wěn)定性好、膜易形成、成本低廉，常用于工業(yè)化生產(chǎn)的分離過(guò)程。婁倩芳等[64]通過(guò)聚丙烯腈吸附將海藻糖合酶固定，可用于生產(chǎn)海藻糖。在40℃、pH7.4和底物濃度為200 g/L條件下生產(chǎn)海藻糖，固定化酶在循環(huán)使用6次后，酶活仍保留64.4% 。聚乙烯醇作為另一種水溶性高分子聚合物，由于其可生物降解性、高機(jī)械穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)被應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域[74]。聚乙烯醇與海藻酸鈉共固定化酶可彌補(bǔ)海藻酸鈉強(qiáng)度較低、熱穩(wěn)定性差、酶泄漏率大的缺點(diǎn)。通過(guò)聚乙烯醇-海藻酸鈉固定重組蔗糖異構(gòu)酶，固定化酶的酶活回收率為82.4% ，可催化蔗糖產(chǎn)生620.7 g/L的異麥芽酮糖，反應(yīng)13個(gè)批次后轉(zhuǎn)化率仍能保持90% 以上[65]。蔗糖異構(gòu)酶固定在聚乙烯醇-海藻酸鈉上，也可用于催化甜菜糖蜜生產(chǎn)異麥芽酮糖。固定化酶的酶活回收率為82.4% ，反應(yīng)8個(gè)批次后轉(zhuǎn)化率仍能保留97.5% ，異麥芽酮糖濃度為（446.4±5.5）g/L（純度 85.8% ）[27]。

3.1.3 納米材料

納米材料作為一種新型的固定化酶載體，因其比表面積大、表面易于修飾、與酶分子尺寸相近等優(yōu)點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[75]。納米材料可通過(guò)是否具有磁性來(lái)分類(lèi)。用于合成功能糖的非磁性納米材料種類(lèi)較多，Zheng等[66]使用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶作為有機(jī)成分，磷酸鈷作為無(wú)機(jī)成分，制備有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化納米花，用于從D-果糖中獲得D-阿洛酮糖。在60℃和pH8.5條件下，納米花的酶活為36.2 U/mg，比游離酶高約7.2倍，在循環(huán)使用6次后酶活仍能保留90% 。氧化石墨烯作為基于石墨烯的納米材料，具有高比表面積、出色的熱穩(wěn)定性和機(jī)械性能[76]。Zhang等[67]通過(guò)氧化石墨烯固定蔗糖異構(gòu)酶（來(lái)源于歐文氏菌屬），用于從蔗糖中獲得異麥芽酮糖。在40℃和pH6.0條件下反應(yīng)180 min后，轉(zhuǎn)化率為95.3% ，在循環(huán)反應(yīng)10個(gè)批次后，酶活仍能保留80% 左右。通過(guò)氧化石墨烯固定D-阿洛酮3-差向異構(gòu)酶（來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌），在60℃條件下固定化酶的半衰期為720 min，約是游離酶的180倍，且可循環(huán)使用10次[68]。Gennari等[69]分別使用微晶纖維素、堿性納米纖維素和酸性納米纖維素對(duì)β-半乳糖苷酶進(jìn)行固定，用于合成低聚半乳糖。3種固定化酶的酶活分別達(dá)到 106.88、115.03、108.47 IU/g載體。通過(guò)物理吸附將β-半乳糖苷酶固定在埃洛石（一種鋁硅酸鹽納米材料）上[70]，將埃洛石吸附酶包裹在硫酸化細(xì)菌纖維素納米晶體的多孔基質(zhì)中，進(jìn)一步提高穩(wěn)定性。在25℃條件下，固定化酶在反應(yīng)60 d后，酶活仍能保留75.8% ，而游離酶的酶活僅保留29.2% 。Ran等[77]通過(guò)功能化聚羥基脂肪酸納米粒子固定D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶（來(lái)源于重組無(wú)內(nèi)毒素大腸桿菌），用于從D-果糖中獲得D-阿洛酮糖。固定化酶的酶活高達(dá)649.3 U/g載體，但粒徑僅為50 nm～200 nm，需要依賴(lài)離心的方式將固定化酶從反應(yīng)體系中分離。

磁性納米材料通過(guò)共價(jià)結(jié)合法固定化酶，在外部磁場(chǎng)的作用下解決了后續(xù)操作中酶難以分離回收的問(wèn)題。Panek等[23]通過(guò)戊二醛活化的硅烷化磁性氧化亞鐵將重組海藻糖合酶固定，用于從麥芽糖中獲得海藻糖。固定化酶在循環(huán)反應(yīng)12次后，酶活仍能保留82% 。金輝[61]通過(guò)殼聚糖改性的磁性四氧化三鐵納米粒子將D-甘露糖異構(gòu)酶固定，用于從D-果糖中獲得D-甘露糖。固定化酶在循環(huán)反應(yīng)6個(gè)批次后，酶活保留26.19% 。反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行11 h后，D-甘露糖的濃度達(dá)到最大值76.64 g/L。

3.2 固定化細(xì)胞

不同于化學(xué)法和傳統(tǒng)酶催化法，全細(xì)胞催化法合成功能糖無(wú)需補(bǔ)充昂貴的輔因子，也無(wú)需酶的純化和分離，可大大降低成本，具有底物來(lái)源廣、反應(yīng)無(wú)污染、產(chǎn)物純度高的優(yōu)點(diǎn)。固定化細(xì)胞是指利用物理或化學(xué)的方法（吸附法、包埋法、共價(jià)法和交聯(lián)法）將細(xì)胞固定在一定材料中，從而促進(jìn)細(xì)胞回收和再循環(huán)[78]。20世紀(jì)90年代，固定化細(xì)胞被首次用于工業(yè)生產(chǎn)，固定化大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了L-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)[79]。固定化細(xì)胞載體有無(wú)機(jī)載體（硅藻土[80]、多孔玻璃[81]等）、有機(jī)載體（海藻酸鈉[82]、殼聚糖[52]、晶膠介質(zhì)[83]等）、復(fù)合載體（聚乙烯醇-海藻酸鈉[84]、硅藻土-海藻酸鈉[85]、海藻酸鈉-二氧化鈦[86]等），其中復(fù)合載體為兩種固定方法共同作用，例如吸附-交聯(lián)法、吸附-包埋法[87]。

作為常用的細(xì)胞固定方法，基于海藻酸鈉的包埋法操作較為簡(jiǎn)便。將菌懸液與海藻酸鈉溶液混合后，向溶液中滴入氯化鈣溶液，即得到含有菌體的海藻酸鈣微球，這種方法得到的固定化細(xì)胞再利用率提高了37.3%[88]。張煊鈞[82]通過(guò)海藻酸鈉包埋重組菌，用于生產(chǎn)D-塔格糖。反應(yīng)時(shí)間為36h，底物濃度150g/L時(shí)，固定化細(xì)胞的酶活可達(dá)29U/mL，在反應(yīng)3個(gè)批次后，酶活約為27U/mL，反應(yīng)4個(gè)批次后，酶活仍能維持21 U/mL左右。李秋喜等[89]通過(guò)海藻酸鈉與戊二醛的包埋-交聯(lián)法固定化大腸桿菌，用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖。固定化細(xì)胞的酶活回收率為76% ，在循環(huán)使用8次后，酶活仍能保留60% 以上。在形成海藻酸鈣微球前加入硅藻土可以擴(kuò)大微球內(nèi)孔道，得到催化活性更高的細(xì)胞。孫帆等[85]通過(guò)硅藻土-海藻酸鈉的吸附-包埋法固定重組枯草芽孢桿菌，用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖。固定化細(xì)胞酶活回收率為64% ，連續(xù)反應(yīng)7個(gè)批次后轉(zhuǎn)化率為28% ，酶活仍能保留81% 。在海藻酸鈉溶液中加入二氧化鈦可減少固定化細(xì)胞中的細(xì)胞泄露，增大了機(jī)械強(qiáng)度。但其使用注射器將混合液緩慢滴入氯化鈣中的方式比較繁瑣，且顆粒之間由于滴入時(shí)間的不同，導(dǎo)致顆粒的硬化時(shí)間存在較大誤差。魏玉霞等[86]通過(guò)海藻酸鈉-二氧化鈦固定重組枯草芽孢桿菌，用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖。固定化細(xì)胞的酶活回收率為82% ，在循環(huán)使用10次后，酶活回收率仍保留58% 。

殼聚糖與戊二醛的吸附-交聯(lián)法是另一種簡(jiǎn)單有效的細(xì)胞固定方法。Hirose等[52]在白蛋白存在下通過(guò)殼聚糖與戊二醛固定放射土壤桿菌細(xì)胞，用于生產(chǎn)D-甘露糖。固定化酶的轉(zhuǎn)化率在20% ～23% ，半衰期約為60 d。反應(yīng)14 d后，180 mL流出液中積累多達(dá)9 g的D-甘露糖。

4 結(jié)論與展望

固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)的運(yùn)用將成為功能糖生物制造未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，天然高分子、合成高分子和納米材料已被開(kāi)發(fā)用于固定化酶/固定化細(xì)胞合成功能糖。目前，大部分研究的重點(diǎn)在于功能糖合成路徑的構(gòu)建，如高表達(dá)菌株的構(gòu)建以及多基因的共表達(dá)菌株的構(gòu)建。用于功能糖生物制造的固定化酶和固定化細(xì)胞研究較少，還需要在以下幾個(gè)方面做出努力：（1）引入高性能、低成本的固定化新材料，在一定程度上維持固定化酶/固定化細(xì)胞的酶活，延長(zhǎng)固定化酶/固定化細(xì)胞的使用壽命，進(jìn)而大大降低功能糖的生產(chǎn)成本；（2）消除功能糖合成過(guò)程中可能產(chǎn)生的副反應(yīng)，如美拉德反應(yīng)，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量；（3）構(gòu)建適于固定化技術(shù)的反應(yīng)器，如填充床反應(yīng)器，通過(guò)批次反應(yīng)、放大試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)功能糖連續(xù)、穩(wěn)定、規(guī)?；铣桑龠M(jìn)綠色生物制造產(chǎn)業(yè)發(fā)展。