于迪，龍娟，張麗雯，黃嘉佳，黃媛，趙立春，孔繁磊

（廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200）

雜環(huán)胺（heterocyclic amines，HAs）是食品熱加工過程中產生的具有致突變性和致癌性的一類化合物[1]。目前，已經鑒定出超過25種HAs化合物，分為兩類：一類為氨基咔啉雜環(huán)胺（amino-carbolines）；另一類為氨基咪唑氮雜芳烴（aminoimidazole-azaarenes，AIAs），AIAs類雜環(huán)胺又可分為喹啉型、喹喔啉型和吡啶型。2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenyl-imidazole[4，5-b]pyridine，PhIP）屬于AIAs類雜環(huán)胺[2-3]。研究表明，HAs的攝入會增大患癌風險，其中來源于 PhIP 的約占一半[4-5]。J?gerstad 等[6]認為HAs化合物合成的前體物質為葡萄糖、氨基酸和肌酸，并提出了喹啉類雜環(huán)胺形成的機理。前期研究普遍認為氨基酸、肌酸和葡萄糖是PhIP的前體物質。Shioya 等[7]、Puangsombat等[8]將試驗對象簡化，利用氨基酸、肌酸和葡萄糖3種PhIP的前體物質建立模型反應，研究PhIP的形成機制。Manabe等[9]的研究則確認了雜環(huán)胺PhIP模型反應中的前體物質是苯丙氨酸和肌酐，而起關鍵作用的物質是反應過程中形成的中間體——苯乙醛。于迪[10]以苯丙氨酸和肌酐作為雜環(huán)胺PhIP模型反應中的前體物質，確定了兩者最佳摩爾比，使得到的模型反應體系中PhIP生成量最高。在化學模型體系中，可以排除大量干擾因素，這有利于反應機理層面的研究，因此許多學者利用化學模型體系進行PhIP的形成機理研究[11-15]。

抑制PhIP的形成有很多途徑，例如通過食品加工處理控制[16-19]、通過添加抗氧化劑控制[20-23]等。模型反應中加入酚酸類物質屬于添加抗氧化劑控制途徑，香辛料因富含酚酸類成分有較強的抗氧化活性，可抑制雜環(huán)胺的形成[24]。研究表明，花椒葉提取物對牛肉餅中雜環(huán)胺的生成有抑制作用，因其富含多酚類物質，具有良好的抗氧化活性[25]。鄢嫣等[26]研究發(fā)現黑胡椒乙醇提取物可以抑制PhIP的形成。包香香[27]研究發(fā)現阿魏酸、對香豆酸對羅非魚餅中雜環(huán)胺的形成有一定的抑制作用。陳怡[28]對苦苣菜提取物進行了測定，發(fā)現提取物的主要成分為咖啡酸、綠原酸，將苦苣菜提取物添加至豬肉糜中以不同條件烘烤后，檢測到的雜環(huán)胺總量有所降低。

本研究將阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸3種單體酚酸以及混合酚酸分別添加到模型體系中，對比分析酚酸類物質抑制PhIP形成的效果，探討酚酸類物質在模型體系中是否存在相互協(xié)同抑制作用，監(jiān)控反應物和生成物的變化，推測抑制PhIP形成的反應機理，為酚酸類物質在抑制食品加工中雜環(huán)胺的形成方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PhIP標準品（色譜純，98% ）：加拿大多倫多研究化學公司；肌酐、L-苯丙氨酸（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；阿魏酸標準品、咖啡酸標準品、對香豆酸標準品（分析純，≥98% ）：北京索萊寶科技有限公司；甲醇（質譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；甲酸（色譜純）：上海吉至生化科技有限公司；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

分析天平（FA1204）：賽多利斯科學儀器北京有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9140A）：上海煜南儀器有限公司；超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（Xevo TQ-XS）：美國Waters公司；聚四氟乙烯反應管、不銹鋼反應釜：廣西中醫(yī)藥大學食品質量與安全實驗室自制。

1.3 模型體系的制備

模型體系參考于迪[10]的試驗方法稍作修改。

PhIP模型體系（空白組）的制備：取苯丙氨酸（0.6 mmol）-肌酐（0.6 mmol），加入 10 mL 去離子水，置于聚四氟乙烯反應管（25 mL）中，再將反應管裝入不銹鋼反應釜中，充分密封，在200℃下反應3.5 h。取出水浴降溫后用0.22 μm微孔濾膜過濾，將所得溶液置于4℃冰箱保存。

酚酸-PhIP對照模型體系的制備：分別在單體酚酸以及不同配比的混合酚酸溶液（均為10 mL）中加入苯丙氨酸（0.6 mmol）-肌酐（0.6 mmol），建立 13種不同濃度和不同混合形式的酚酸模型體系，其中9種單體酚酸模型體系，分別為10 mL的10-8、10-9、10-10mg/mL的阿魏酸（A）、咖啡酸（B）、對香豆酸（C）。 4種混合酚酸模型體系見表1。

表1 混合酚酸模型體系Table 1 Model systems of mixed phenolic acids

1.4 檢測方法

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）法，對模型體系中的酚酸、苯丙氨酸、肌酐以及PhIP進行定性和定量分析。參考文獻[10]的方法條件并作如下調整。

液相色譜條件：檢測器Waters QDa、Waters 2998 PDA檢測器；色譜柱Waters CORTECSC18+（2.7 μm，2.1 mm×100 mm）；進樣量 5.0 μL；流速 0.2 mL/min；流動相A為甲醇，流動相B為0.1% 甲酸-水；梯度洗脫條件為0～1min5% A，1min～10min90% A，10min～14min 5% A。

質譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），多反應監(jiān)測模式；正、負離子掃描模式；樣品溫度（10.0±5.0）℃，柱溫（30±5.0）℃；質量掃描范圍50 amu～500 amu；離子源溫度150℃；噴霧電壓3 000 V；毛細管溫度300℃；毛細管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度550℃。

2 結果與分析

2.1 模型體系中PhIP的檢測結果

PhIP的母離子與子離子的碎片質譜圖見圖1。

圖1 PhIP的母離子與子離子碎片質譜圖Fig.1 Mass spectra of parent ion and daughter ion fragments of PhIP

從圖1可以看出，模型體系中PhIP在質譜檢測中存在著正離子m/z=224的母離子峰，擊碎此峰得到的二級碎片子離子峰m/z=210，可定性該峰的代表物質為PhIP，與文獻[20]的檢測結果一致。

2.2 模型體系中前體物質及酚酸物質的測定

苯丙氨酸和肌酐的出峰時間和子離子碎片質譜圖見圖2。阿魏酸、咖啡酸和對香豆酸的母離子碎片和子離子碎片質譜圖見圖3～圖5。

圖2 苯丙氨酸和肌酐的出峰時間和子離子碎片質譜圖Fig.2 Peak time and mass spectra of daughter ion fragments of phenylalanine and creatinine

圖3 阿魏酸的母離子碎片和子離子碎片質譜圖Fig.3 Mass spectra of parent ion and daughter ion fragments of ferulic acid

圖4 咖啡酸的母離子碎片和子離子碎片質譜圖Fig.4 Mass spectra of parent ion and daughter ion fragments of caffeic acid

圖5 對香豆酸的母離子碎片和子離子碎片質譜圖Fig.5 Mass spectra of parent ion and daughter ion fragments of p-coumaric acid

從圖2可以看出，正離子掃描模式下，在UPLCMS/MS檢測中于3.18 min出現m/z=166的峰，二級碎片子離子峰m/z=120，經二級質譜鑒定，可定性該峰為苯丙氨酸；在UPLC-MS/MS檢測中于1.08 min出現m/z=114的峰，二級碎片子離子峰m/z=72、m/z=86，經二級質譜鑒定，可定性該峰為肌酐。從圖3可以看出，負離子掃描模式下，在UPLC-MS/MS檢測中，存在m/z=193的母離子峰，二級碎片子離子峰m/z=133，經二級質譜鑒定，可定性該峰為阿魏酸。從圖4可以看出，負離子掃描模式下，在UPLC-MS/MS檢測中，存在m/z=179的母離子峰，二級碎片子離子峰m/z=135，經二級質譜鑒定，由此可定性該峰為咖啡酸。從圖5可以看出，負離子掃描模式下，在UPLC-MS/MS檢測中，存在m/z=163的母離子峰，二級碎片子離子峰m/z=84，經二級質譜鑒定，可定性該峰為對香豆酸。

2.3 單體酚酸模型體系中前體物質及PhIP含量變化分析

單體酚酸模型體系中肌酐、苯丙氨酸、酚酸以及PhIP含量變化趨勢見圖6～圖9。

圖6 單體酚酸模型體系中肌酐含量變化趨勢Fig.6 Trends of creatinine content in single phenolic acids model systems

圖7 單體酚酸模型體系中苯丙氨酸含量變化趨勢Fig.7 Trends of phenylalanine content in single phenolic acids model systems

圖8 單體酚酸模型體系中酚酸含量變化趨勢Fig.8 Trends of phenolic acid content in single phenolic acids model systems

圖9 單體酚酸模型體系中PhIP含量變化趨勢Fig.9 Trends of PhIP content in single phenolic acids model systems

已有研究表明，模型體系中前體物質——苯丙氨酸會熱降解生成苯乙醛，苯乙醛與另一前體物質——肌酐反應生成PhIP[7]。從圖6可以看出，咖啡酸、阿魏酸和對香豆酸的單體模型體系中，隨著酚酸的濃度增加，肌酐含量逐漸增大。從圖7和圖8可以看出，酚酸濃度為10-10mg/mL時，3個單體酚酸模型體系中苯丙氨酸含量均高于空白模型；咖啡酸、阿魏酸的單體模型體系中隨酚酸濃度增大，苯丙氨酸含量和經過模型體系反應后的酚酸含量均降低，而對香豆酸單體模型體系中隨酚酸濃度增大，苯丙氨酸含量和經過模型體系反應后的酚酸含量均呈現先下降再緩慢上升的趨勢。原因可能是隨著酚酸濃度的增加，酚酸與苯丙氨酸發(fā)生加合反應，生成新的化合物，阻礙了肌酐與苯丙氨酸反應生成PhIP，進而肌酐的含量會有所增加，苯丙氨酸含量整體呈降低趨勢，并且使得苯丙氨酸和經過模型體系反應后的酚酸含量呈現相似的趨勢。從圖9可以看出，單體酚酸模型體系中PhIP的含量均比空白模型中PhIP的含量低，同時咖啡酸、阿魏酸的單體模型體系中PhIP含量隨著酚酸濃度增大而逐漸降低，對香豆酸的單體模型體系中PhIP含量隨著酚酸濃度增大呈現出先下降再緩慢上升的趨勢。在單體酚酸模型體系的10-10mg/mL和10-9mg/mL兩種酚酸濃度中，從整體效果比較，3種酚酸對PhIP形成的抑制效果由強到弱的順序為咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸。分析三者的化學結構可以發(fā)現，咖啡酸在苯環(huán)上有兩個鄰位羥基，而對香豆酸和阿魏酸均只有一個羥基，結合Salazar等[29]的研究結果：芳香環(huán)上有兩個鄰位羥基的酚酸對PhIP形成的抑制效果最強，而當芳香環(huán)中有烷基或羧基作為取代基時會略微降低對PhIP形成的抑制效果。所以從理論上分析咖啡酸的抑制效果最強，與本試驗結果相符；當酚酸濃度增加為10-8mg/mL時，阿魏酸對PhIP形成的抑制效果強于對香豆酸，與文獻[29]的研究結果相符，且當對香豆酸濃度增加到10-8mg/mL時，其對PhIP形成的抑制效果卻沒有隨之增強，可能是對香豆酸在模型體系中生成的新化合物既對PhIP形成有抑制作用，又能減少對香豆酸的消耗。

2.4 混合酚酸模型體系的前體物質及PhIP含量變化分析

混合酚酸模型體系中肌酐、苯丙氨酸、酚酸以及PhIP含量變化見圖10～圖12。

圖10 混合酚酸模型體系中肌酐含量變化Fig.10 Changes in creatinine content in the model systems of mixed phenolic acids

圖11 混合酚酸模型體系中苯丙氨酸含量變化Fig.11 Changes in phenylalanine content in the model systems of mixed phenolic acids

圖12 混合酚酸模型體系中PhIP含量變化Fig.12 Changes in PhIP content in the model systems of mixed phenolic acids

結合單體酚酸模型體系對PhIP形成的抑制效果，阿魏酸和咖啡酸濃度均在10-8mg/mL時，對PhIP形成抑制效果最強；對香豆酸濃度在10-9mg/mL時抑制效果最強，當濃度達到10-8mg/mL時抑制效果雖有所減弱，但變化不大，為了統(tǒng)一混合酚酸模型體系中酚酸單體的濃度，各個酚酸單體濃度選取為10-8mg/mL。

從圖10～圖12可以看出，4種混合酚酸模型體系的肌酐的含量相近，說明酚酸抑制PhIP形成的化學機理與肌酐的關系不大；但對于苯丙氨酸含量而言，阿魏酸+對香豆酸（A+C）模型體系中含量最少，咖啡酸+對香豆酸（B+C）模型體系中含量最多。相較僅有一個酚羥基的阿魏酸，咖啡酸苯環(huán)上的兩個羥基活性更強，而在咖啡酸+對香豆酸（B+C）的模型體系中，咖啡酸可能與對香豆酸脫羧合成新物質，消耗了酚酸，酚酸之間的協(xié)同抑制相互作用導致體系對PhIP形成的抑制效果降低；而阿魏酸+對香豆酸（A+C）體系中，阿魏酸的化學性質比咖啡酸穩(wěn)定，體系中阿魏酸和對香豆酸大部分直接與苯丙氨酸或者苯乙醛反應，使得體系對PhIP形成的抑制效果明顯。因此阿魏酸+對香豆酸（A+C）模型體系對PhIP抑制效果最強，PhIP生成量最低，抑制效果最弱的是咖啡酸+對香豆酸（B+C）模型體系，PhIP生成量最高。原因可能是酚酸與苯丙氨酸或者苯乙醛反應生成了新的化合物，抑制了PhIP的生成；并推測是各類酚酸之間協(xié)同作用產生的中間產物與前體物質發(fā)生反應，對PhIP形成的抑制效果產生差異，具體抑制路徑需進一步分析。

2.5 單體酚酸與混合酚酸模型體系中對PhIP形成的抑制效果對比分析

單體酚酸與混合酚酸模型體系中PhIP形成的抑制率見圖13。

圖13 模型體系對PhIP形成的抑制率對比Fig.13 Inhibition rates of phenolic acids on PhIP formation in model systems

從圖13可以看出，在單體酚酸模型體系中，除對香豆酸模型體系是隨著酚酸濃度增加，其抑制率先上升后下降外，其余單體酚酸模型體系的抑制率隨酚酸濃度的增加均呈上升趨勢；混合酚酸模型體系中抑制率最高的為阿魏酸+對香豆酸（A+C）模型體系，其抑制率為56.37% ；抑制率最低的是咖啡酸+對香豆酸（B+C）模型體系，其抑制率為13.33% 。通過分析發(fā)現，混合酚酸模型對PhIP形成的抑制率均小于單體酚酸模型體系中酚酸濃度為10-8mg/mL時的抑制率，可能是由于在混合酚酸模型體系中酚酸單體爭搶PhIP前體物質——苯丙氨酸，導致混合酚酸模型體系中出現酚酸與酚酸之間相互抑制的作用，導致了混合酚酸模型體系的抑制率普遍降低的現象。

酚酸抑制PhIP形成的可能抑制機理路徑見圖14。

圖14 酚酸抑制PhIP形成的可能抑制機理路徑Fig.14 Possible pathways of phenolic acid inhibiting PhIP formation

綜合所有研究數據發(fā)現酚酸物質加入模型體系后，單體酚酸模型體系隨酚酸濃度增大，肌酐的含量增多，而苯丙氨酸含量整體減少；在混合酚酸模型體系中肌酐的含量相近，而苯丙氨酸含量卻有較大差異。推測可能是因為加入的酚酸抑制了苯丙氨酸生成苯乙醛，或者苯丙氨酸在熱降解后可能與酚酸反應生成新的化合物，致使大部分苯丙氨酸不能與肌酐反應，使得肌酐含量增多，反應通過消耗掉前體物質含量，致使PhIP生成量減少，對PhIP的抑制效果增大。相關研究[29]表明，鄰、間和對二羥基苯可以抑制苯丙氨酸的降解，由此推測酚酸抑制PhIP形成的反應機理。從圖14可以看出，酚酸可能在高溫熱反應中與PhIP的前體物質——苯丙氨酸反應形成加合物1；酚酸在高溫體系中與苯丙氨酸熱降解產物苯乙醛反應生成加合物2；兩條路徑反應消耗掉PhIP的前體物質，從而抑制PhIP的形成。

3 結論

本試驗選取的阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸在模型體系中均對PhIP的形成有抑制作用，不同的單體酚酸與混合酚酸對PhIP抑制率不同。在單體酚酸模型體系中，咖啡酸和阿魏酸模型體系的抑制率隨酚酸濃度的增加均呈上升趨勢；混合酚酸模型體系中阿魏酸+對香豆酸模型體系抑制率最高，阿魏酸+咖啡酸模型體系抑制率次之，咖啡酸+對香豆酸模型體系抑制率最低；綜合試驗數據分析，不論是酚酸單體模型體系還是混合酚酸模型體系，其抑制PhIP形成的機理與苯丙氨酸含量的變化密切相關，可能是加入的酚酸抑制了苯丙氨酸生成苯乙醛，或者與苯丙氨酸反應生成新的化合物；在混合酚酸模型體系里，推測是各類酚酸物質之間存在相互協(xié)同抑制作用導致對PhIP形成的抑制效果不同。本試驗驗證了酚酸類物質對PhIP形成有抑制作用，對比分析單體酚酸和混合酚酸的模型體系對PhIP形成的影響，監(jiān)控整個反應過程中前體物質和生成物質的變化關系，推測出酚酸模型體系對PhIP形成的抑制路徑，為酚酸類物質在抑制食品加工中雜環(huán)胺的形成應用方面提供依據。