葉華，劉洪順，俞玥，李占明，鐘建軍，郭元新

（江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212100）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝物，具有分布廣、毒性強(qiáng)的特點(diǎn)，常污染花生、核桃、玉米等產(chǎn)品[1-3]，嚴(yán)重威脅人體健康，已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物質(zhì)[4]。為保障食品安全和人體健康，世界各國都對AFB1在食品中的含量制定了最高限量標(biāo)準(zhǔn)，其中歐盟最為嚴(yán)格，將花生中AFB1最高限量標(biāo)準(zhǔn)定為2 mg/kg，新加坡和日本的最高限量標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)置為5 mg/kg和10mg/kg[5]。我國標(biāo)準(zhǔn)GB2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》將花生中AFB1最高限量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為20mg/kg[6]。因此，開發(fā)食品中黃曲霉快速檢測方法對食品安全監(jiān)控和人體健康保障具有重要意義。傳統(tǒng)的真菌毒素檢測方法主要有高效液相色譜法[7-8]、質(zhì)譜法[9]等，存在儀器設(shè)備昂貴、操作技術(shù)要求高、檢測費(fèi)時等不足[10-11]；近年來發(fā)展的免疫分析法雖然具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但同樣存在抗體制備繁瑣耗時、免疫反應(yīng)需要多步遞進(jìn)和反復(fù)洗滌以及成本高等缺點(diǎn)[12-14]。

核酸適配體，又稱“化學(xué)抗體”，是一種能折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，以較高親和力和特異性識別各種靶標(biāo)分子的單鏈寡核苷酸序列，通常通過體外合成技術(shù)——指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 制備獲得，無需動物實(shí)驗(yàn)，合成方便且制備成本低[15-16]。作為一種新型分子識別探針，在食品安全檢測尤其是真菌毒素檢測方面受到廣泛關(guān)注和研究[17-18]。Zhu等[19]利用核酸適配體作為分子探針構(gòu)建了一種雙競爭橫向測流試紙條并成功用于多種食品和飼料樣品中黃曲霉毒素的檢測。Geleta等[20]合成了一種還原氧化石墨烯/二硫化鉬/聚苯胺納米復(fù)合材料，并以此構(gòu)建了一種電化學(xué)適配體傳感器，該傳感器對AFB1具有較好的選擇性、靈敏性和穩(wěn)定性。

氧化石墨烯（graphite oxide，GO）是石墨烯的氧化產(chǎn)物，由于其合成方便、具有較好的親水性、分散性以及卓越的熒光猝滅能力，在食品安全檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[21-22]。本試驗(yàn)以AFB1為檢測對象，利用氧化石墨烯納米片建立一種熒光核酸適配體生物傳感器，通過優(yōu)化試驗(yàn)條件應(yīng)用于花生樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生米：市售。黃曲霉毒素核酸適配體TAF序列具體為 5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3'[23]，其 5'端標(biāo)記有四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）熒光基團(tuán)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化（HPLC級）。黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、伏馬菌素（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）：青島普瑞邦生物工程有限公司；氧化石墨烯水溶液：江蘇先豐納米材料科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、六水合氯化鎂：上海麥克林生化科技有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max i3多功能酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；HR-AFM原子力顯微鏡：美國AFM Workshop公司；Centrifuge 5427 R冷凍高速離心機(jī)：德國艾本德eppendorf公司；RS-FS1401多功能粉碎機(jī)：合肥榮事達(dá)小家電有限公司；PHS-25型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Medium-e400 up超純水儀：上海和泰儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 氧化石墨烯濃度優(yōu)化

分別取100 nmol/L核酸適配體溶液200 μL加入到等體積不同濃度氧化石墨烯溶液中（0、5、10、20、30、40 μg/mL）， 并用 pH7.4 的結(jié)合緩沖溶液（binding buffer，BB，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2·6H2O，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl）補(bǔ)至總體積為 500μL，使氧化石墨烯終濃度為 0、2、4、8、12、16 μg/mL，混勻后每孔取200 μL測定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長547 nm，發(fā)射波長584 nm），試驗(yàn)設(shè)3個平行取平均值。所有操作均在避光條件下進(jìn)行，以不加GO為對照組。

1.3.2 核酸適配體濃度優(yōu)化

根據(jù)1.3.1結(jié)果取最佳濃度的氧化石墨烯溶液200 μL 和等體積不同初始濃度的適配體（70、80、90、100、110、120、130 nmol/L） 于 1.5 mL 棕色離心管中混合，補(bǔ)加BB緩沖溶液至500 μL，則適配體終濃度分別為 28、32、36、40、44、48、52 nmol/L。 室溫下避光孵育20 min后用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長547 nm，發(fā)射波長584 nm），試驗(yàn)設(shè)3個平行，取平均值。

1.3.3 孵育時間優(yōu)化

采用酶標(biāo)儀熒光動力學(xué)模式進(jìn)行氧化石墨烯和適配體孵育時間的優(yōu)化，具體程序設(shè)置如下：延遲3 s，振板5 s，運(yùn)行時長5 min，檢測間隔20 s。取一定體積最佳濃度適配體溶液先進(jìn)行動力學(xué)試驗(yàn)5 min后，立即快速加入等體積最佳濃度氧化石墨烯溶液，然后按照上述程序進(jìn)行熒光動力學(xué)試驗(yàn)。

1.3.4 檢測時間優(yōu)化

最佳檢測時間同樣采用動力學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置程序如下：延遲3 s，振板5 s，運(yùn)行時長45 min，檢測間隔20 s。在1.3.3步驟優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上，向氧化石墨烯/適配體孵育體系中加入一定體積AFB1溶液（終濃度為0.5 μg/mL），按照上述程序進(jìn)行熒光動力學(xué)試驗(yàn)。

1.3.5 檢測靈敏度分析

在優(yōu)化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別取等體積氧化石墨烯溶液和適配體溶液于1.5 mL離心管中混勻，室溫下避光孵育最佳時間后，加入100 μL一系列不同濃度AFB1（終濃度分別為 0、1、5、10、50、100、200 ng/mL），繼續(xù)混勻避光孵育最佳時間后，每孔分別取200 μL測定其熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)設(shè)置3個平行，取平均值。記對照組（不加AFB1組）的熒光強(qiáng)度為F0，試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度為Fi。以ΔF（ΔF=Fi-F0）為縱坐標(biāo)，以AFB1濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算檢測限。

1.3.6 特異性分析

以與AFB1結(jié)構(gòu)或功能類似的FB1、OTA、ZEN 3種真菌毒素代替靶標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)方法的特異性分析。取最佳濃度的氧化石墨烯溶液和適配體溶液各200 μL，待孵育完全后分別加入上述3種毒素（終濃度500 ng/mL）和AFB1各100 μL，室溫混勻孵育后分別測定其熒光強(qiáng)度記為Fi。對照組以100 μL BB緩沖溶液代替毒素，其熒光強(qiáng)度記為F0。根據(jù)熒光強(qiáng)度變化情況ΔF（ΔF=Fi-F0）分析檢測方法的特異性。

1.3.7 樣品檢測

花生米樣品預(yù)處理參考Ye等[24]的方法進(jìn)行處理，略有改動。將花生米樣品用粉碎機(jī)粉碎，再用研缽搗碎較大顆粒后研磨成粉末。準(zhǔn)確稱取粉末樣品5.0 g于50 mL透明離心管中，并加入25 mL 50% 甲醇溶液渦旋振蕩30 min，室溫靜置25 min后在4℃下冷凍離心20 min（5 000 r/min），收集上清液過濾后即為花生米空白提取液。在空白提取液中加入不同濃度（5、50、200 ng/mL）的AFB1溶液，充分振蕩。按照1.3.5步驟進(jìn)行檢測，根據(jù)所得檢測值和實(shí)際添加濃度計算回收率?；厥章拾匆韵鹿竭M(jìn)行計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均設(shè)置3個平行，熒光強(qiáng)度值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Origin 8.5軟件進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

本試驗(yàn)所構(gòu)建的檢測方法原理如圖1所示。

圖1 氧化石墨烯-核酸適配體傳感器檢測原理Fig.1 Schematic presentation of graphene oxide-based fluorescence aptasensor assay

因?yàn)檠趸┍砻娲嬖谥豕倌軋F(tuán)和共軛結(jié)構(gòu)，它能夠?qū)ARMA熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體通過π-π堿基堆積作用非共價固定在氧化石墨烯表面，這樣由于熒光基團(tuán)與GO靠近而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，適配體上的熒光被猝滅。在體系中沒有AFB1的情況下，核酸適配體仍然被吸附在GO表面，熒光強(qiáng)度基本保持不變。當(dāng)體系中存在AFB1時，由于適配體與AFB1的高親和性，使得適配體從GO上解離下來而與AFB1結(jié)合，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離GO，從而熒光強(qiáng)度得到恢復(fù)。因此，可以根據(jù)體系熒光強(qiáng)度前后變化與AFB1濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)AFB1的檢測。

2.2 氧化石墨烯納米片表征及濃度優(yōu)化

氧化石墨烯納米片的原子力顯微鏡表征及濃度優(yōu)化結(jié)果見圖2。

圖2 GO表征及濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Characterization and concentration optimization of graphene oxide

由圖2a可以看出，氧化石墨烯呈明顯的片狀單層結(jié)構(gòu)，其平均寬度約為0.5 μm，平均厚度為2 nm，平均徑厚比為250∶1，有利于核酸適配體的吸附。

由圖2b可以看出，隨著氧化石墨烯濃度的增加，核酸適配體熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)氧化石墨烯濃度大于12 μg/mL時，核酸適配體的熒光強(qiáng)度下降不明顯，基本保持不變。這說明12 μg/mL的氧化石墨烯基本能將40 nmol/L濃度核酸適配體的熒光信號猝滅完全。因此，確定氧化石墨烯的最佳終濃度為12 μg/mL。

2.3 核酸適配體TAF濃度優(yōu)化

圖3是核酸適配體熒光強(qiáng)度在最優(yōu)氧化石墨烯濃度條件下的猝滅效果圖，即核酸適配體TAF濃度的優(yōu)化結(jié)果圖。

圖3 核酸適配體TAF濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Concentration optimization of TAF aptamer

從圖3可以看出，在氧化石墨烯濃度12μg/mL猝滅條件下，隨著核酸適配體TAF濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)適配體濃度大于36nmol/L時，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增加，而當(dāng)繼續(xù)增加適配體的濃度至44 nmol/L時，熒光強(qiáng)度迅速上升。這說明36 nmol/L是適配體TAF的熒光被12 μg/mL濃度氧化石墨烯基本猝滅的臨界點(diǎn)。但為了確保適配體的熒光能完全被氧化石墨烯猝滅，最終確定32 nmol/L為適配體最佳終濃度。

2.4 孵育時間優(yōu)化

氧化石墨烯與核酸適配體TAF孵育時間熒光動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 氧化石墨烯猝滅適配體熒光時間動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Real-time fluorescence kinetic test of aptamer by graphene oxide

從圖4可以看出，在未加入氧化石墨烯時（前300 s），適配體的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，當(dāng)加入氧化石墨烯后，體系熒光強(qiáng)度迅速降低，至550 s后體系熒光強(qiáng)度降到最低并保持穩(wěn)定。這說明加入氧化石墨烯后，經(jīng)過約250 s后TAF適配體熒光強(qiáng)度基本被猝滅完全，即此時核酸適配體基本完全吸附在氧化石墨烯表面。因此，扣除加注氧化石墨烯時間（10 s），核酸適配體和氧化石墨烯的最佳孵育時間為240 s，即孵育4 min后可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.5 檢測時間優(yōu)化

熒光動力學(xué)試驗(yàn)優(yōu)化確定最佳檢測時間結(jié)果如圖5所示。

圖5 檢測時間優(yōu)化動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Real-time fluorescence kinetic test of the detection

由圖5可以看出，在GO/適配體孵育體系中，沒有AFB1存在情況下（前5 min），由于TAMRA熒光標(biāo)記的適配體已經(jīng)被完全吸附在氧化石墨烯表面，熒光被猝滅并處于一個較低值水平；當(dāng)向體系中加入AFB1后，其熒光強(qiáng)度隨著時間的延長而不斷增強(qiáng)，當(dāng)時間達(dá)到32 min后，熒光強(qiáng)度趨于平緩，基本不再增強(qiáng)。這主要是由于核酸適配體TAF與AFB1具有較強(qiáng)的親和性，適配體逐漸被AFB1從氧化石墨烯表面解離下來而特異性結(jié)合，熒光得到增強(qiáng)。因此，當(dāng)加入待分析樣品27 min后（扣除加入樣品前5 min的動力學(xué)試驗(yàn)時間），體系熒光強(qiáng)度基本不再增強(qiáng)，而趨于穩(wěn)定，可進(jìn)行樣品分析檢測?？紤]到優(yōu)化的GO/適配體最佳孵育時間4 min，因此整個方法從上樣到出檢測結(jié)果約需30 min左右，檢測時間相對較快。

2.6 方法性能分析及應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)曲線及特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of standard curve and specificity test

從圖6a可以看出，ΔF與AFB1濃度具有良好的對數(shù)關(guān)系，其方程為y=4 295.23lnx+5 662.90，R2=0.972 7。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）標(biāo)準(zhǔn)計算得該方法的檢測限為2.37 ng/mL，檢測范圍為2.37 ng/mL～200.00 ng/mL。從圖6b可以看出，OTA、FB1和ZEN對體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)基本上無影響，說明本方法特異性較好，具有較好的選擇性。

花生實(shí)際樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 花生樣品AFB1加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery of aflatoxin B1in peanut samples

由表1可知，在3種不同加標(biāo)濃度條件下，回收率為85.0% ～114.4% ，說明本方法具有較好的回收率，可用于花生實(shí)際樣品中AFB1檢測。本方法的檢測靈敏度和回收率均低于王琦等[25]的研究結(jié)果，這可能有兩個原因，一是兩者所用的適配體序列不一致（相差3個堿基）且標(biāo)記熒光基團(tuán)不一樣；二是本試驗(yàn)所使用的是花生樣品提取液，而文獻(xiàn)使用的是白酒樣品，無需進(jìn)行提取預(yù)處理，干擾因素相對較少。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用氧化石墨烯納米片構(gòu)建了一種AFB1的熒光分析檢測方法。經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)條件，該方法的檢測范圍為2.37 ng/mL～200.00 ng/mL，檢測限為2.37 ng/mL，能滿足日常檢測限量要求。同時該方法具有較好的選擇性，基本不受OTA、FB1、ZEN等真菌毒素存在的影響。該方法操作簡便、檢測耗時短，整個檢測完成只需約30 min左右時間，對花生實(shí)際樣品加標(biāo)分析，回收率為85.0% ～114.4% ，結(jié)果比較可靠，具有潛在的實(shí)際應(yīng)用前景。