成剛剛，魯亮，陳世偉，李振海，趙廷彬，殷海松，鄭志強(qiáng)，喬長(zhǎng)晟*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)試驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津 300457；3.天津慧智百川生物技術(shù)有限公司，天津 300457；4.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300457；5.軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院軍需工程技術(shù)研究所，北京 101300）

普魯蘭多糖是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）發(fā)酵產(chǎn)生的類似葡聚糖的胞外水溶性黏質(zhì)多糖[1-2]，其分子是由α-1，4-糖苷鍵連接3個(gè)葡萄糖形成麥芽三糖，并通過(guò)α-1，6-糖苷鍵連接麥芽三糖，形成高分子量線形多糖[3-4]。因其具有水溶性好、易降解、易成膜、阻氧、無(wú)毒等特點(diǎn)，已被普遍應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕化工和農(nóng)業(yè)等多領(lǐng)域，是一種極具研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景的高新生物制品[5-6]。發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖時(shí)，發(fā)酵液黏度高使菌液分離困難，并且發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也對(duì)多糖純化造成一定的困難。因此，去除這些雜質(zhì)是普魯蘭多糖純化過(guò)程中的重要步驟。

目前，普魯蘭多糖的菌液分離主要是通過(guò)無(wú)機(jī)絮凝劑絮凝除菌和板框過(guò)濾除菌，牛登飛[7]采用三氯化鋁絮凝除菌，用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀進(jìn)行澄清，用硅藻土進(jìn)行過(guò)濾；萬(wàn)玉軍等[8]使用硅藻土作為助濾劑，板框過(guò)濾除菌。傳統(tǒng)的除菌方式不僅會(huì)造成無(wú)機(jī)金屬離子殘留，助濾劑的使用還會(huì)產(chǎn)生固體廢渣，造成環(huán)境污染。常用脫蛋白的方法主要有三氟三氯乙烷法、物理吸附法、Sevag 法[9]、鹽析法[10]、三氯乙酸法[11]和蛋白酶法。馬麗等[12]采用三氟三氯乙烷法去除螺旋藻多糖中的蛋白質(zhì)；賀曉晗等[13]采用硅鎂類物質(zhì)吸附去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)；張璐等[14]采用木瓜蛋白酶法去除多糖發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的化學(xué)除蛋白方式，從純化蛋白的角度講，有較好的效果，但對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵液中使用化學(xué)方法去除蛋白質(zhì)的同時(shí)，不僅會(huì)造成有機(jī)試劑的殘留，而且多糖損失率較高。

本試驗(yàn)首先從4種生物絮凝劑中選定除菌效果最好的絮凝劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化絮凝除菌工藝。然后從6種酶中選定脫蛋白效果最佳的蛋白酶，除菌后發(fā)酵液進(jìn)行脫蛋白處理，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化脫蛋白工藝。再經(jīng)傳統(tǒng)脫色、超濾、濃縮干燥成粉末，測(cè)定固體普魯蘭多糖粉末的理化指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

出芽短梗霉CGMCC.7055（Aureobasidium pullulans CGMCC.7055）、聚谷氨酸：天津北洋百川生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉、殼聚糖：北京索萊寶生物科技有限公司；海藻酸鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250：天津市大茂化學(xué)試劑廠；中性蛋白酶（1.5×105U/mL）、復(fù)合蛋白酶（1.4×105U/mL）、堿性蛋白酶（8.6×104U/mL）、木瓜蛋白酶（5.0×103U/mL）、風(fēng)味蛋白酶（4.0×103U/mL）：北京瀾翊康生物科技有限公司；酸性蛋白酶（50 U/mL）、牛血清蛋白：上海源葉生物有限公司；大孔樹(shù)脂LX-68M：西安藍(lán)曉科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20型pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；Tecan SunRise酶標(biāo)儀：帝肯奧地利責(zé)任有限公司；B-260恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；UV-1200型紫外分光光度計(jì)：泰亞賽福公司；TDL-5-A型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SP-1500型噴霧干燥機(jī)：上海順儀試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SY-MU2050型切向流超濾系統(tǒng)：上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 普魯蘭多糖發(fā)酵液制備

參照張攀等[15]的方法，略作修改，以出芽短梗霉進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵96 h，當(dāng)普魯蘭多糖達(dá)到80 g/L時(shí)，待用。

1.3.2 多糖含量及得率的測(cè)定

參照宋亞瓊等[16]的方法，略作修改，取30 mL普魯蘭多糖溶液，用2倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌靜置一段時(shí)間，將沉淀放在已恒重的濾紙上抽濾，放入80℃烘箱中干燥至恒重，稱量、記錄結(jié)果。根據(jù)式（1）計(jì)算出普魯蘭多糖的含量，按照（2）式計(jì)算出普魯蘭多糖的得率。

式中：M為普魯蘭多糖含量，g/L；m為普魯蘭多糖和濾紙總重量，g；m0為空白濾紙質(zhì)量，g。

式中：W為粗多糖得率，% ；M0為處理后普魯蘭多糖的含量，g；M為處理前普魯蘭多糖的含量，g。

1.3.3 除菌率的測(cè)定

取未除菌發(fā)酵液1 mL稀釋25倍，搖勻，使用酶標(biāo)儀在620 nm處測(cè)定其吸光度，記為A；經(jīng)過(guò)絮凝處理的發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取上清，稀釋25倍在620 nm處測(cè)定其吸光度，記為A0。吸光度和菌體含量成正比，以吸光度直接表示菌體含量。吸取200 μL待測(cè)液，于620 nm處測(cè)溶液的吸光度，除菌率（Y）按照式（3）計(jì)算。

1.3.4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及脫蛋白率的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[17]測(cè)定普魯蘭多糖發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)波長(zhǎng)掃描后在595 nm條件下測(cè)定吸光度，得回歸方程y=6.151 4x+0.011 1，R2=0.999（x為蛋白含量，mg/mL；y為吸光度），脫蛋白率按照式（4）計(jì)算。

式中：X為脫蛋白率，% ；x為處理前樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/mL；x0為處理后樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

1.3.5 固體普魯蘭多糖中指標(biāo)的測(cè)定

水分、灰分、單糖、二糖及寡糖含量分別參考GB 5009.3—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》、GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》、GB 28402—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑普魯蘭多糖》進(jìn)行測(cè)定。

1.4 生物絮凝劑除菌試驗(yàn)

1.4.1 生物絮凝劑的篩選

取100 mL發(fā)酵液各4份，考察羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、海藻酸鈉、聚谷氨酸4種生物絮凝劑在添加量0.6 g/L，絮凝溫度40℃，絮凝時(shí)間30 min，不同pH值下的除菌率，確定最佳生物絮凝劑的類型。

1.4.2 單因素試驗(yàn)

取100 mL發(fā)酵液各7份，在絮凝劑的添加量0.6g/L，絮凝溫度40℃，絮凝時(shí)間30 min的條件下，分別以pH 值 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 進(jìn)行試驗(yàn)，離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳pH值。

按照上述試驗(yàn)最優(yōu)pH值，取100 mL發(fā)酵液各6份，在絮凝劑的添加量0.6 g/L，絮凝時(shí)間30 min的條件下， 分別以絮凝溫度 20、30、40、50、60、70 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳絮凝溫度。

按照上述試驗(yàn)最優(yōu)pH值和絮凝溫度，取100 mL發(fā)酵液各6份，在絮凝劑的添加量0.6 g/L，分別以絮凝時(shí)間 10、20、30、40、50、60 min 進(jìn)行試驗(yàn)，離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳絮凝時(shí)間。

按照上述試驗(yàn)最優(yōu)pH值，絮凝溫度和絮凝時(shí)間的條件下，取100 mL發(fā)酵液各6份，分別以殼聚糖添加量 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L 進(jìn)行試驗(yàn)， 離心去除菌體，以除菌率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳殼聚糖添加量。

1.4.3 生物絮凝除菌響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上應(yīng)用Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)（三因素三水平），因素與水平的具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 生物絮凝除菌響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design of biopolymer flocculation in sterilization

1.5 酶法脫蛋白試驗(yàn)

1.5.1 蛋白酶的篩選

以脫蛋白率和多糖得率為指標(biāo)，取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各6份，比較中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和酸性蛋白酶6種蛋白酶，在各自最適溫度，加酶量100 U/mL條件下的脫蛋白率，確定最佳蛋白酶的類型。

1.5.2 單因素試驗(yàn)

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各7份，在加酶量100 U/mL，酶解溫度50℃，酶解2.0h的條件下，分別以pH 值 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 進(jìn)行試驗(yàn)，90 ℃滅酶5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳pH值。

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各6份，按照上述試驗(yàn)最優(yōu)pH值，在加酶量100 U/mL，酶解2.0 h的條件下，分別以酶解溫度 40、45、50、55、60、65 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，90℃滅酶5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳酶解溫度。

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各7份，按照上述試驗(yàn)最優(yōu)pH值和酶解溫度，在加酶量100 U/mL條件下，分別以酶解時(shí)間 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 進(jìn)行試驗(yàn)，90℃滅酶5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳酶解時(shí)間。

取經(jīng)除菌的發(fā)酵液100 mL各6份，按照上述試驗(yàn)最優(yōu)pH值，酶解溫度和酶解時(shí)間，分別以加酶量20、40、60、80、100、120 U/mL 進(jìn)行試驗(yàn)，90 ℃滅酶 5 min，離心去除沉淀后，以脫蛋白率和多糖得率為指標(biāo)，確定最佳加酶量。

1.5.3 酶法脫蛋白響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上應(yīng)用Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)（四因素三水平），因素與水平的具體參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 酶法脫蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design of enzymatic deproteinization

1.6 樹(shù)脂脫色

取經(jīng)脫蛋白后的發(fā)酵液，按照5 BV/h進(jìn)行大孔樹(shù)脂脫色試驗(yàn)，當(dāng)濾液為淡黃色或無(wú)色，收集濾液。

1.7 超濾、濃縮

取經(jīng)脫色后的發(fā)酵液進(jìn)行超濾除鹽，經(jīng)截留分子量10 kDa超濾膜組件，水洗6次后，濃縮至5% ，收集濾液。

1.8 干燥

取經(jīng)超濾濃縮后的濾液，設(shè)置進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為85℃，進(jìn)料速度為25 mL/min，霧化驅(qū)動(dòng)，壓力為0.4 MPa，噴霧干燥，得到固體普魯蘭多糖粉末。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面結(jié)果分析，用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性分析，用Origin 2019b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物絮凝劑的篩選

不同pH值下生物絮凝劑對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵液除菌效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同pH值下生物絮凝劑對(duì)除菌效果的影響Fig.1 Effect of biopolymer flocculation on sterilization under different pH values

由圖1可知，4種生物絮凝劑中，在相同條件下殼聚糖對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵液菌體的絮凝效果最好，pH值為3.0～4.0時(shí)除菌率可達(dá)97.6% 左右。故選殼聚糖進(jìn)行普魯蘭多糖發(fā)酵液絮凝除菌試驗(yàn)。

2.2 殼聚糖絮凝除菌單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH值對(duì)殼聚糖絮凝除菌率的影響

pH值對(duì)殼聚糖除菌率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)殼聚糖除菌效果的影響Fig.2 Effect of pH value on sterilization of chitosan

由圖2可知，pH值是影響絮凝的一個(gè)重要因素，在堿性條件下絮凝效果不理想，而酸性條件下效果較好。殼聚糖屬于陽(yáng)離子絮凝劑，整個(gè)體系的pH值對(duì)絮凝效果影響明顯。在堿性條件下，其氨基成電中性，吸附絡(luò)合能力顯著降低[18]；并且普魯蘭多糖發(fā)酵液的黏度也受pH值的影響，酸性條件下黏度較低，有利于殼聚糖絮凝菌體分離。當(dāng)絮凝劑pH值為3.0～4.0時(shí)，除菌率較高，分別為97.6% 和96.76% ；多糖得率分別為91.15% 和91.5% 。pH值3.0和pH值4.0殼聚糖除菌效果差異不顯著，而且考慮普魯蘭多糖發(fā)酵液pH值在4.0～5.0之間，為了節(jié)約成本，選擇最佳pH值為4.0。

2.2.2 絮凝溫度對(duì)殼聚糖除菌率的影響

絮凝溫度對(duì)殼聚糖除菌率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 絮凝溫度對(duì)殼聚糖除菌效果的影響Fig.3 Effect of flocculation temperature on the sterilization of chitosan

由圖3可知，隨著絮凝溫度的升高，殼聚糖絮凝除菌率緩慢上升，多糖得率逐漸上升，溫度達(dá)到40℃時(shí)除菌率和多糖得率達(dá)到最高，分別為98.10% 和95.47% ，且隨著溫度繼續(xù)升高，除菌率整體上保持穩(wěn)定，多糖得率也趨于平緩，說(shuō)明絮凝溫度（＞30℃）對(duì)絮凝除菌影響較小。

2.2.3 絮凝時(shí)間對(duì)殼聚糖除菌率的影響

絮凝時(shí)間對(duì)殼聚糖除菌率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 絮凝時(shí)間對(duì)殼聚糖除菌效果的影響Fig.4 Effect of flocculation time on the sterilization of chitosan

由圖4可知，絮凝除菌反應(yīng)在20 min時(shí)除菌率和多糖得率達(dá)到最高，分別為98.17% 和93.97% ，隨著絮凝時(shí)間的增加，除菌率和多糖得率降低，后趨于穩(wěn)定；可能是因?yàn)楸匦跄龝r(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)造成絮凝劑形成的架橋結(jié)構(gòu)逐漸不穩(wěn)定，菌體逐漸游離出來(lái)，而普魯蘭多糖復(fù)合到殼聚糖絮凝沉淀中，進(jìn)而造成除菌效率降低和多糖損失率升高。因此，最優(yōu)絮凝時(shí)間為20 min。

2.2.4 殼聚糖添加量對(duì)殼聚糖除菌率的影響

殼聚糖添加量對(duì)殼聚糖絮凝除菌率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 殼聚糖添加量對(duì)殼聚糖除菌效果的影響Fig.5 Effect of chitosan addition on the sterilization of flocculation

由圖5可知，隨著殼聚糖添加量的逐漸增加，絮凝除菌率逐漸升高隨后趨于平穩(wěn)，表明殼聚糖添加量增加到一定程度后，除菌率整體上趨于穩(wěn)定。此現(xiàn)象屬于架橋絮凝機(jī)理，絮凝劑用量增加有利于其與菌體充分架橋，當(dāng)生物高分子絮凝劑覆蓋菌體表面大約為50% 時(shí)，其絮凝作用最好[19]；用量過(guò)多會(huì)造成吸附過(guò)飽和，使其在每個(gè)膠粒上形成覆蓋層，再次讓膠粒呈現(xiàn)一種穩(wěn)定狀態(tài)[20]。所以，整個(gè)體系中絮凝劑用量需要適中，過(guò)量或少量都達(dá)不到理想的絮凝效果。在殼聚糖添加量為0.8 g/L時(shí)，除菌效率最高，為98.45% ，多糖得率為91.3% 。因此選擇殼聚糖的最佳添加量為0.8 g/L。

2.3 殼聚糖絮凝除菌響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸模型的建立

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以pH值（A1）、絮凝時(shí)間（B1）、殼聚糖添加量（C1）3 個(gè)因素為響應(yīng)變量，以除菌率為響應(yīng)值（Y1），設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)17組，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 殼聚糖絮凝除菌Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design of chitosan flocculation in sterilization

對(duì)表3進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y1=98.60-0.862 5A1-0.700 0B1+1.54C1-0.85A1B1-0.425 0A1C1+0.800B1C1-1.59A12-2.96B12-1.34C12。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 殼聚糖絮凝除菌的回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models for chitosan flocculation in sterilization

由表4可以看出，除菌率模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），一次項(xiàng)中pH值和殼聚糖添加量影響極顯著，絮凝時(shí)間影響顯著；根據(jù)F值大小，可以判斷3個(gè)因素對(duì)菌體去除率的影響主次順序?yàn)闅ぞ厶翘砑恿浚–1）＞pH 值（A1）＞絮凝時(shí)間（B1）；相互作用項(xiàng) A1B1、B1C1顯著（P＜0.05）；模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2=0.971 7，說(shuō)明模型具有可行性；同時(shí)模型的調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.935 3，說(shuō)明模型能夠解釋試驗(yàn)93.53% 的響應(yīng)值變化，表明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際數(shù)據(jù)擬合程度好。

2.3.2 殼聚糖絮凝除菌各因素間交互作用

殼聚糖絮凝除菌各因素間交互作用如圖6所示。

圖6 各因素交互作用的等高線圖和曲面圖Fig.6 Contour diagrams and surface diagrams for the interaction of factors

由圖6可知，pH值和絮凝時(shí)間、絮凝時(shí)間和殼聚糖添加量的交互作用較強(qiáng)，與表4方差分析中顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證

響應(yīng)面優(yōu)化最優(yōu)條件：pH值為3.71、絮凝時(shí)間為20.01 min、殼聚糖添加量為0.96 g/L，在此條件下模型預(yù)測(cè)的除菌率為99.19% 。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，取絮凝pH值為3.70、絮凝時(shí)間為20 min、殼聚糖添加量為0.96 g/L，在此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際得到的除菌率為99.05% 。這與模型預(yù)測(cè)值較為接近，誤差不超過(guò)5% ，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

2.4 蛋白酶的篩選

不同酶種類對(duì)粗多糖溶液脫蛋白率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 酶種類對(duì)粗多糖溶液脫蛋白的影響Fig.7 Effect of enzymes on deproteinization of crude polysaccharide solution

由圖7可知，在不同酶各自最適宜的條件下，堿性蛋白酶的脫蛋白效率最高，且多糖得率也最優(yōu)，分別為67.5% 和98.55% 。表明普魯蘭多糖發(fā)酵液中蛋白質(zhì)以堿性蛋白質(zhì)為主，因此選擇堿性蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)。

2.5 堿性蛋白酶脫蛋白單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 pH值對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

pH值對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見(jiàn)圖8。

圖8 pH值對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.8 Effect of pH on deproteinization of alkaline protease

pH值是影響蛋白酶催化活性的主要因素之一。一方面，pH值會(huì)改變底物的帶電狀態(tài)，對(duì)底物和蛋白酶的特異性結(jié)合產(chǎn)生影響；另一方面，過(guò)酸過(guò)堿的試驗(yàn)條件下，會(huì)破壞蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白酶活性降低甚至失活[21]。由圖8可知，pH值為8.0～8.5時(shí)，脫蛋白率相對(duì)較高。而且pH值對(duì)多糖得率影響不顯著。因此，確定酶解pH值為8.5，此時(shí)脫蛋白率為68.82% 。

2.5.2 酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見(jiàn)圖9。

圖9 酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.9 Effect of enzymolysis temperature on deproteinization of alkaline protease

由圖9可知，酶解溫度在45℃～50℃時(shí)，脫蛋白率相對(duì)較高。酶解溫度也是影響酶的催化效率的一個(gè)重要因素，適當(dāng)?shù)奶岣呙附鉁囟瓤梢源龠M(jìn)酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，提高脫蛋白率，但酶解溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活，故酶解溫度確定為45℃，此時(shí)脫蛋白率最高，為69.49% ，多糖得率為98.85% 。因此，選擇酶解溫度45℃。

2.5.3 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見(jiàn)圖10。

圖10 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.10 Effect of enzymolysis time on deproteinization of alkaline protease

由圖10可知，當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí)，脫蛋白率最高，為72.76% ，多糖得率為98.38% 。并且酶解時(shí)間對(duì)多糖得率無(wú)顯著影響。因此，選擇最佳酶解時(shí)間2.5 h。

2.5.4 加酶量對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響

加酶量對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白率的影響見(jiàn)圖11。

圖11 加酶量對(duì)堿性蛋白酶脫蛋白的影響Fig.11 Effect of enzyme addition on deproteinization of alkaline protease

由圖11可知，當(dāng)加酶量為60 U/mL～80 U/mL時(shí)，脫蛋白率較高。隨著加酶量的增加，脫蛋白率開(kāi)始降低，可能是因?yàn)榈鞍酌噶窟^(guò)多，滅酶不完全造成蛋白含量增加。因此，選擇加酶量為80 U/mL，此時(shí)脫蛋白率最高，為74.40% ，多糖得率為98.42% 。

2.6 堿性蛋白酶法脫蛋白響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸模型的建立

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以pH值（A2）、酶解溫度（B2）、酶解時(shí)間（C2）、加酶量（D2）4 個(gè)因素為響應(yīng)變量，以脫蛋白率為響應(yīng)值（Y2），設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)29組，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 堿性蛋白酶法脫蛋白的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Factors and levels of Box-Behnken design of alkaline protease in deproteinization

對(duì)表5進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y2=74.43+1.63A2+0.70B2+0.68C2+1.25D2-1.21A2B2+0.05A2C2+1.41A2D2-1.17B2C2-1.48B2D2-1.22C2D2-4.95A22-4.47B22-4.36C22-4.55D22。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 堿性蛋白酶法脫蛋白的回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models by alkaline protease in deproteinization

由表6可以看出，堿性蛋白酶法脫蛋白模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），一次項(xiàng)中pH值和加酶量影響極顯著，酶解溫度和酶解時(shí)間影響顯著；根據(jù)F值大小，可以判斷4個(gè)因素對(duì)脫蛋白率的影響主次順序?yàn)閜H 值（A2）＞加酶量（D2）＞酶解溫度（B2）＞酶解時(shí)間（C2）；相互作用項(xiàng) A2B2、A2D2、B2D2和 C2D2顯著（P＜0.05）；模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2=0.964 0，說(shuō)明模型具有可行性；同時(shí)模型的調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.928 1，說(shuō)明模型能夠解釋試驗(yàn)92.81% 的響應(yīng)值變化，表明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際數(shù)據(jù)擬合程度好。

2.6.2 堿性蛋白酶法脫蛋白各因素間交互作用

堿性蛋白酶法脫蛋白各因素間交互作用如圖12所示。

圖12 各因素交互作用的等高線圖和曲面圖Fig.12 Contour diagrams and surface diagrams for the interaction of factors

由圖12可知，pH值和酶解溫度、pH值和加酶量、酶解溫度和加酶量、酶解時(shí)間和加酶量的交互作用較強(qiáng)，與表6的方差分析中顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

2.6.3 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證

響應(yīng)面優(yōu)化最優(yōu)條件：pH值為8.59、酶解溫度為45.10℃、酶解時(shí)間為2.53 h，加酶量為83.10 U/mL，在此條件下模型預(yù)測(cè)的脫蛋白率為74.70% 。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，取pH值為8.6、酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為2.5 h，加酶量為83 U/mL，在此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際得到的脫蛋白率為74% 。這與模型預(yù)測(cè)值較為接近，誤差不超過(guò)5% ，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

2.7 固體普魯蘭多糖理化指標(biāo)

按照上述普魯蘭多糖提取工藝，得到固體普魯蘭多糖粉末，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果如表7所示，產(chǎn)品質(zhì)量滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

表7 固體普魯蘭多糖理化指標(biāo)結(jié)果Table 7 Physicochemical indexes of solid pullulan

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面分析優(yōu)化普魯蘭多糖發(fā)酵液除菌和脫蛋白工藝，結(jié)果表明最佳除菌條件：pH3.7、絮凝時(shí)間為20 min、絮凝溫度為40℃、殼聚糖添加量為0.96 g/L，此時(shí)除菌率為99.19% ，多糖得率為91.3% 。最佳脫蛋白條件：pH8.6、酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為2.5 h，堿性蛋白酶加酶量為83 U/mL，此時(shí)脫蛋白率為74.70% ，多糖得率為98.42% 。再經(jīng)傳統(tǒng)的樹(shù)脂脫色、超濾濃縮、干燥得到產(chǎn)品純度為91.5% ，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，表明此工藝具有應(yīng)用于普魯蘭多糖生產(chǎn)的潛能。