丁雅婷,鐘為章*,秦 學,寧志芳,李 月,陳賽男

熱反硝化地芽孢桿菌水解催化剩余污泥提取蛋白質(zhì)

丁雅婷1,2,鐘為章1,2*,秦 學1,2,寧志芳1,2,李 月1,2,陳賽男1,2

(1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院,河北 石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術(shù)實驗室,河北 石家莊 050018)

為實現(xiàn)剩余污泥無害化處理以及資源化利用,采用從高溫堆肥基質(zhì)中篩選出的可產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等胞外酶的嗜熱菌—熱反硝化地芽孢桿菌對污泥氮源進行提取,分析反應時間、污泥含固率以及嗜熱菌粗酶液接種量對蛋白質(zhì)提取的影響,并確定最佳反應條件.結(jié)果表明:水解過程中各因素對蛋白質(zhì)回收率作用大小為:接種量>時間>含固率,得出最優(yōu)工藝條件為:pH=7、=60℃、=8h、污泥含固率為4%以及嗜熱菌接種量為20%,在此條件下污泥蛋白質(zhì)提取率達到32.05%,氨基酸含量為359.6mg/L,多肽含量為1060.1mg/L,且污泥上清液粒徑隨著反應的進行逐漸減小.

嗜熱菌；水解；剩余污泥；蛋白質(zhì)；影響因素

2019年,我國剩余污泥年產(chǎn)量達到了6000萬t,預計到2025年,剩余污泥年產(chǎn)量將達到9000萬t[1].隨著剩余污泥產(chǎn)量提高,傳統(tǒng)的處理方法可持續(xù)性較差[2],已經(jīng)不能滿足日益增長的處理需求[3].與此同時,剩余污泥干重的30%～60%都是未被利用的蛋白質(zhì),這部分蛋白質(zhì)經(jīng)資源化處理可作為發(fā)泡劑和動物飼料的原料[4],從源頭控制污泥減量化以及實現(xiàn)污泥資源化.

目前通過污泥水解實現(xiàn)污泥資源化和減量化的方法眾多,主要為物理法[5]、化學法[6]、生物法[7].物化法處理剩余污泥經(jīng)過多年發(fā)展,工藝已較為成熟,但成本高、副產(chǎn)物多等缺點限制了推廣[8].生物法處理剩余污泥作為一種新型的方法,具有反應溫和、副產(chǎn)物少、成本低等優(yōu)點[9],且通過生物法處理剩余污泥可將污泥中剩余的部分蛋白質(zhì)提取出用以制備飼料及有機肥[10]等衍生產(chǎn)品,真正實現(xiàn)了污泥資源化利用.生物預處理方法主要包括投加生物酶[11]和投加生物菌,由于直接投加生物酶時酶制劑成本較高,而篩選可分泌蛋白酶、淀粉酶等胞外酶的生物菌,可降低試驗成本.

剩余污泥中存有少量的抗生素[12],其能與核糖核蛋白結(jié)合,抑制微生物蛋白質(zhì)合成,阻礙嗜熱菌在污泥中的增殖,從而影響產(chǎn)酶效果.Chen等[13]驗證了抗生素會影響微生物群落的多樣性和豐富度.因此為避免抗生素對嗜熱菌產(chǎn)酶的影響,實現(xiàn)剩余污泥的高效降解,本研究通過將嗜熱菌胞外酶進行提取后作用于剩余污泥,探究提取污泥氮源效果,分析其對污泥水解指標蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽含量以及粒徑的影響,并通過響應面分析法優(yōu)化其提取條件.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 污泥理化性質(zhì) 試驗污泥取自石家莊市某污水處理廠(A2/O)剩余污泥泵房,污泥取回后,靜置沉淀,棄去上清液,降低污泥含水率.處理后的污泥性質(zhì)如表1.將剩余污泥樣品在4℃下貯藏,待用.

表1 剩余污泥基本理化性質(zhì)

1.1.2 污泥群落結(jié)構(gòu) 對剩余污泥進行16S V3- V4擴增區(qū)域的微生物分類測序,采用宏基因組技術(shù)解析剩余活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu).結(jié)果表明:從門水平而言,剩余污泥中優(yōu)勢微生物為變形菌門(28.32%)、擬桿菌門(16.39%)以及綠菌門(13.04%),3個優(yōu)勢菌門均屬于革蘭氏陰性菌.在剩余污泥中革蘭氏陰性菌比例可達57.75%.微生物分類測序結(jié)果如圖1所示.

圖1 污泥微生物群落相對豐度

1.2 熱反硝化地芽孢桿菌

嗜熱溶胞菌是由本實驗室從牛糞與秸稈的混合堆肥基質(zhì)[14]中分離出的熱反硝化地芽孢桿菌(DC8),保藏于中國普通微生物保藏中心,保藏號為CGMCC NO.23318.熱反硝化地芽孢桿菌為革蘭氏陽性需氧菌,菌株形態(tài)呈細桿狀,產(chǎn)芽孢,最適生長溫度60℃,最佳pH值為7,最佳生長時間為24h,在生長過程中,熱反硝化地芽孢桿菌可分泌蛋白酶、淀粉酶等多種胞外酶.由圖1可知,污泥中革蘭氏陰性菌占比較大,且革蘭氏陰性菌細胞壁中蛋白質(zhì)含量為60%,因此利用可產(chǎn)蛋白酶的嗜熱菌進行溶胞有更好的處理效果.

1.3 實驗方法

原代嗜熱菌菌株DC8于4℃下保存,復壯過程如下:挑取原代嗜熱菌接種于固體培養(yǎng)基,60℃下培養(yǎng)24h,選取在顯微鏡下菌體形態(tài)均勻的培養(yǎng)基,然后將其接種于250mL液體培養(yǎng)基中,60℃下培養(yǎng)24h,使其在波長600nm處吸光度達1.0,得到嗜熱菌菌懸液.

將活化后的嗜熱菌接種至液體培養(yǎng)基,調(diào)整不同時間(12,18,24,30和36h)、不同pH值(5.00,6.00,7.00,8.00和9.00)、不同溫度(45,50,55,60和65℃),之后測定嗜熱菌分泌蛋白酶和淀粉酶活性.為保證嗜熱菌胞外酶可產(chǎn)生最佳水解效果,將最佳條件下的菌懸液于高速離心機(8000r/min)離心后得到嗜熱菌粗酶液,作為接種體接種于剩余污泥中.

首先利用氫氧化鈉或鹽酸來調(diào)節(jié)剩余污泥pH值,之后將剩余污泥與嗜熱菌粗酶液在反應器中混合,控制剩余污泥含固率、粗酶液投加量以及反應時間,實驗過程利用恒溫培養(yǎng)箱以60℃,120r/min進行振蕩培養(yǎng),保障酶催化剩余污泥所需的溫度條件.待反應結(jié)束后,將處理后的剩余污泥用高速離心機(8000r/min)離心15min,收集上清液測定蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽含量以及粒徑.

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用響應曲面分析法,以蛋白質(zhì)提取率為響應值(),研究反應時間()、污泥含固率()以及嗜熱菌接種量()對響應值()的影響,每個因素取3個水平,設(shè)計了三因素三水平的響應面優(yōu)化實驗.

1.4 分析方法

污泥pH值、COD、TSS、VSS、TS以及VS[15-16]采用標準方法測定;采用凱氏定氮法[17]測定蛋白質(zhì)含量;氨基酸采用茚三酮比色法[18];多肽和蛋白酶酶活采用Folin酚法[19];淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法[20];粒徑分布采用全自動計數(shù)粒度儀(美國,LE400-05);污泥形貌采用環(huán)境掃描電子顯微鏡(QUANTA200)觀察,倍數(shù)選擇1000倍.試驗過程中,每個樣品進行3次平行檢測,結(jié)果取平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜熱菌產(chǎn)酶最佳生長條件

不同時間、pH值和溫度下熱反硝化地芽孢桿菌產(chǎn)蛋3白酶和淀粉酶活性影響如圖2所示.

由圖2a可知,在30h時,蛋白酶酶活達到最高值284.01U/mL,淀粉酶為137.38U/mL;在24h時,淀粉酶酶活達到最高值155.51U/mL,而蛋白酶達到278.36U/mL,綜合考慮,24h是最佳反應時間.在酶活性中心存在一些處于電離狀態(tài)的氨基酸殘基[21],pH值不但會影響酶的穩(wěn)定性,還會改變酶與底物的帶電狀態(tài),在適宜pH值環(huán)境下,酶保持良好的穩(wěn)定性,酶與底物的結(jié)合處于最適電離狀態(tài),有助于催化反應的進行.由圖2b可知,pH值為7時,蛋白酶活性和淀粉酶活性整體均達到最大值,分別是289.67和159.34U/mL.溫度是酶保持活性的重要因素[22],溫度較高時會導致酶不可逆的失活,溫度過低時,不能使酶的活性全部被激活.如圖2c可知,在60℃時蛋白酶活性和淀粉酶活性達到最大值,分別為261.25和162.82U/mL.綜上所述,熱反硝化地芽孢桿菌最佳產(chǎn)酶生長條件為=24h、pH=7、=60℃.

2.2 水解反應時間影響

在500mL錐形瓶中加入200mL含固率為4%的剩余污泥,利用0.5mg/L的NaOH控制污泥pH值為7,向污泥中添加20%(酶液:污泥)嗜熱菌粗酶液,在60℃下分別反應0,2,4,6,8,10和12h.水解時間對污泥蛋白質(zhì)提取的影響如圖3所示.

由圖3a可知,隨著時間增加,添加嗜熱菌粗酶液的污泥反應體系中,各指標均不斷升高,對蛋白質(zhì)促進作用明顯.在反應時間為2h時,蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽含量以及蛋白質(zhì)提取率分別是848.3,153.6,513.7mg/L和13%,而在反應時間為8h時,分別為1611.3,230.5,1023.7mg/L以及25.8%,說明在2～8h時3種有機物含量均升高近一倍,這與Liu等[23]研究結(jié)果一致.隨著時間增加,全部底物已與嗜熱菌粗酶液結(jié)合,8h后增長趨勢放緩,蛋白質(zhì)提取率不再增加,且隨著反應進行,多肽被酶分解為氨基酸小分子,多肽呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢.過長的反應時間伴隨著能耗和成本增加,并且長時間反應會導致短鏈蛋白質(zhì)的增加,因此最佳反應時間為8h.

剩余活性污泥絮體的形成過程十分復雜,有研究表明微生物絮凝成絮體主要是由于細菌為抵抗惡劣環(huán)境而產(chǎn)生的一種自身保護現(xiàn)象.隨著試驗反應進行,污泥絮體發(fā)生了明顯的變化,顏色由原始的深褐色變?yōu)闇\褐色,且顆粒變細,污泥顏色變化與宋勇[24]將水解酶投加至活性污泥系統(tǒng)結(jié)果一致.其污泥粒徑變化見圖3b.對比未經(jīng)嗜熱菌處理的剩余污泥,處理12h的剩余污泥粒徑在0～10μm的明顯增多,粒徑為30～100μm的占比明顯下降,平均粒徑下降8.345μm.結(jié)果表明,嗜熱菌粗酶液的溶胞作用導致絮體解體,污泥中的細菌裸露,隨即酶作用于細菌使其破解,粒徑顯著下降.Chen等[25]對比了幾種酶對提高剩余污泥水解和生物降解性的影響,并得出酶在破碎剩余污泥復雜結(jié)構(gòu)起著重大作用.

2.3 嗜熱菌不同接種量影響

接種量是嗜熱菌粗酶液與剩余活性污泥的體積比.由圖4a可知,蛋白質(zhì)、氨基酸和多肽含量都是在接種量為5%～20%時迅速上升,在20%～25%時趨勢變緩或下降.接種量5%～20%階段,蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽三者含量分別增加了760,192.01,564.67mg/L,蛋白質(zhì)提取率增加了12.19%,提取率達到32.05%.在20%～25%階段,蛋白質(zhì)、多肽含量以及蛋白質(zhì)提取率分別減少146.67,182.15mg/L以及2.35%,氨基酸含量增加3.47mg/L.比較數(shù)據(jù)可得,在20%接種量之后污泥與酶反應達到飽和,過量的酶分解蛋白質(zhì)導致其含量下降,蛋白質(zhì)分解出的多肽也被過量的酶分解為氨基酸,因此,接種量為20%時,酶與底物充分接觸,達到最佳效果.由圖4b可知,污泥粒徑不斷下降,在接種比為20%時,相較原污泥,0～10μm粒徑增加13%,10～30μm、30～50μm和50～100μm粒徑分別減少5.4%、7.5%和1.1%,平均粒徑由23.01μm下降至18.75μm.與Liu等[26]利用溶菌酶和鼠李糖脂聯(lián)合處理剩余污泥的結(jié)果一致.

空白為原污泥添加不同接種量酶液后的初始蛋白含量;pH值為7,溫度為60℃,含固率為4%,反應時間為8h.

2.4 污泥不同含固率影響

由圖5a可知,氨基酸和多肽含量隨著含固率增加不斷上升,蛋白質(zhì)含量在含固率1%～4%時上升,在4%～5%時下降,蛋白質(zhì)提取率也隨之下降.氨基酸和多肽含量隨著含固率的增加不斷上升,在含固率1%～5%時分別增加了199.53和642.31mg/L,在含固率為4%時分別達到359.6和1060.1mg/L,蛋白質(zhì)在含固率1%～4%時上升660.1mg/L,提取率上升10.6%,達到25.9%,在4%～5%時下降206.67mg/L,提取率下降3.3%.如圖5b所示,污泥粒徑隨著含固率增加而上升,相較1%含固率,在5%含固率時平均粒徑增加3.49μm.其主要原因是酶在進行催化反應時,首先與污泥形成酶-底物復合物(ES)網(wǎng)絡(luò),分子間催化作用轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿觾?nèi)的催化作用[27],而含固率為5%時,絮體結(jié)構(gòu)較為緊密,污泥與酶傳質(zhì)受到阻礙,導致酶難以與污泥形成ES復合物,進而影響水解效率,蛋白質(zhì)含量下降,而其中不能與底物結(jié)合的酶將已溶出的蛋白質(zhì)分解為氨基酸和多肽,因此含量上升.

pH值為7,溫度為60℃,接種量為20%,反應時間為8h

2.5 污泥形態(tài)變化

由圖6可知,原始污泥的絮體外包裹大量絲狀結(jié)構(gòu),存在明顯的絲狀菌連接,污泥結(jié)構(gòu)松散無序,絮體顆粒之間無明顯邊界.經(jīng)過嗜熱菌處理后的污泥,絲狀菌開始斷裂,污泥顆粒間相互纏繞現(xiàn)象已觀察不到,污泥表面結(jié)構(gòu)粗糙且相對緊密,邊界清晰,出現(xiàn)有規(guī)則的孔隙結(jié)構(gòu),且具有更大的比表面積,污泥細胞結(jié)構(gòu)經(jīng)水解后受到破壞,胞內(nèi)物質(zhì)流出,釋放水分,且其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與薛飛等[28]研究結(jié)果相似.

a.原始污泥;b.處理后污泥

2.6 嗜熱菌提取剩余污泥蛋白質(zhì)響應曲面法優(yōu)化實驗

由單因素實驗結(jié)果,確定反應時間()、含固率()和接種量()的取值范圍(表2),以蛋白質(zhì)提取率()為響應值,開展響應曲面實驗.通過將響應面優(yōu)化試驗得到的實驗值帶入響應面分析表,并對其進行響應面回歸分析(表3).

表2 響應曲面的實驗因素及水平

2.6.1 回歸模型的建立及統(tǒng)計分析 用Design Expert軟件分析表的實驗結(jié)果,得到回歸方程為:= 32.09 + 1.36+ 0.11+ 1.84+ 0.32+ 0.48+ 0.43- 2.882- 6.782- 2.772.

由表4可知,該模型的值為44.54,且(rod>) < 0.0001,說明該模型極顯著.相關(guān)系數(shù)2=0.9828>0.9,實驗值與預測值相關(guān)性良好.決定系數(shù)2Adj=0.9608,該模型能夠解釋96.08%的響應值變化,回歸性較好.信噪比Adeq Precision 16.879>4表明方程的擬合度較好,所以可用于嗜熱菌提取剩余污泥蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化.失擬項(>0.05)不顯著,說明方程的擬合效果較好.對比自變量的值可得出,不同因素對蛋白質(zhì)提取率影響次序:(接種量)>(反應時間)>(含固率).

表3 響應曲面實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 蛋白質(zhì)回收率回歸方程模型的方差分析

2.6.2 響應曲面分析及條件優(yōu)化 響應曲面顏色越深,說明結(jié)果越顯著,即蛋白質(zhì)提取效果越好[29].響應曲面坡度越陡,表示響應量對實驗條件的改變越敏感,等高線由橢圓向圓形演變表示交互作用的顯著性逐漸減弱.

由圖7a可見,蛋白質(zhì)提取率()隨著反應時間()和含固率()的增加先升高后降低,同時發(fā)現(xiàn)曲面坡度較大,并且表4的方差分析中的值為0.0416<顯著值0.05,說明因素之間存在明顯的相互作用并且影響顯著.通過比較表4中值大小得出的顯著性大于,說明反應時間對蛋白質(zhì)提取率的影響大于污泥含固率.從圖7b等高線圖中可以看出,等高線較為密集且呈橢圓形,也表明了交互作用顯著.

由圖8a可見,蛋白質(zhì)提取率()隨著接種量和時間的增加先升高后降低,曲面坡度較小,并且表4的方差分析中的值為0.3233>0.05,通過比較表4中值得出的顯著性大于,說明酶接種量對蛋白質(zhì)提取率的影響大于反應時間.從圖8b等高線圖中看出,等高線較為稀疏,也表明相互作用不顯著.

由圖9a可見,蛋白質(zhì)提取率()隨著接種量()的提高不斷增大,且隨著含固率()的增大先升高后降低,曲面相對較為平坦,并且表4的方差分析中的值為0.3764>0.05,說明因素影響不顯著.通過比較表4中值得出的顯著性大于,說明酶接種量對蛋白質(zhì)提取率的影響大于污泥含固率.從圖8b等高線圖中看出,等高線形狀呈圓形,表明相互作用不顯著.

綜上所述,嗜熱菌水解剩余污泥提取蛋白質(zhì)過程中,單獨的反應時間和接種量對蛋白質(zhì)提取率都有顯著影響,但是從兩兩結(jié)合角度出發(fā),發(fā)現(xiàn)反應時間和酶接種量以及酶接種量和污泥含固率之間不存在顯著的相互作用,而含固率和反應時間之間存在相互影響.

2.6.3 驗證結(jié)果實驗 根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計所得的結(jié)果和二次多項回歸方程,通過Design Expert軟件預測出蛋白質(zhì)提取的最佳反應條件為污泥含固率4%、酶接種量20%、反應時間8h.在上述條件下,蛋白質(zhì)提取率達32%以上,可以通過在最佳水解條件下進行水解來監(jiān)測模型精確度,進行3組平行實驗,污泥蛋白提取率為(32.11±0.13)%,從而可以得到通過響應面分析法對其最佳酶解條件進行優(yōu)化是可行的.該模型能較準確地模擬各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響,具有較高的應用價值.

3 結(jié)論

3.1 嗜熱菌水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的最佳提取條件為:含固率為4%、粗酶液投加量為20%、反應時間8h、反應溫度60℃,反應pH=7.在該提取條件下剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的最大值可達32.05%.

3.2 通過響應面分析得到嗜熱菌水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)各因素的影響顯著性由強至弱表現(xiàn)為:嗜熱菌接種量>反應時間>剩余污泥含固率.

3.3 污泥粒徑隨著反應進行逐漸降低,其中污泥50～100μm減少1.1%,30～50μm減少7.5%,10～30μm減少5.4%,0～10μm增加13%,且通過掃描電鏡可以看出污泥絮體顆粒變細,具有更大比表面積和更發(fā)達的孔隙結(jié)構(gòu).

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The extraction of protein from surplus sludge catalyzed by thermophilichydrolysis.

DING Ya-ting1,2,ZHONG Wei-zhang1,2*,QIN Xue1,2,NING Zhi-fang1,2,LI Yue1,2,CHEN Sai-nan1,2

(1.College of Environmental Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China；2.Biotechnology Laboratory of Pollution Prevention and Control of Hebei Province,Shijiazhuang 050018,China).,2022,42(8)：3780～3787

For optimizing the processing conditions to realizing the harmless treatment and resource utilization of excess sludge,the thermophilic bacteria (),which can produce extracellular enzymes such as protease and amylase,were selected from the high-temperature compost substrate and used to extract sludge nitrogen source in this study. Then effects of reaction time,sludge solid content and inoculum amount of crude enzyme solution of thermophilic bacteria on protein extraction were evaluated to determine the optimum reaction conditions. The results show that effects of various factors on protein recovery during hydrolysis were in the order of inoculation amount > time > solid content; and the optimal processing conditions included pH=7,=60℃,=8h,and solid content of 4% under which we observed thermophilic bacteria inoculation rate of 20%,protein extraction rate of 32.05%,amino acid content of 359.6mg/L,and polypeptide content of 1060.1mg/L,and that the sludge supernatant particle size decreased gradually with the reaction.

thermophilic bacteria；hydrolysis；surplus sludge；protein；influencing factors

X703

A

1000-6923(2022)08-3780-08

2022-01-25

河北省人才工程培養(yǎng)資助項目(A201901043);河北省自然科學基金資助項目(B2021208067);國家自然科學基金資助項目(51708170)

* 責任作者,副教授,zhongweizhang@aliyun.com

丁雅婷(1998-),女,河北科技大學碩士研究生,研究方向為固體廢物及廢水無害化處理及資源化利用.發(fā)表論文3篇.