馬文飚，石博，夏蕾，乜茹，桑子江，馬鑫（青海省人民醫(yī)院 乳甲科，青海 西寧 810001）

甲狀腺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其主要病理類型為甲狀腺乳頭狀癌，目前臨床主要采用手術(shù)與放射性碘消融等方法治療，但其發(fā)病率仍逐年升高[1]。早期篩查甲狀腺癌并給予及時治療有助于降低甲狀腺癌病死率[2]。研究[3]表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）在甲狀腺癌中異常表達(dá)并可參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。lncRNA SNHG14在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)且發(fā)揮致癌基因作用[4?6]，但SNHG14 對甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其具體機制尚不清楚。本課題組利用StarBase 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR?433?3p 可能是SNHG14 的靶基因。研究[7]表明，miR?433在甲狀腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR?433 可抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖。本研究主要探討甲狀腺癌組織中SNHG14 與miR?433?3p 的表達(dá)，采用體外細(xì)胞實驗檢測抑制SNHG14的表達(dá)對甲狀腺癌SW597細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本的收集及患者的臨床資料

收集2017 年10 月至2018 年12 月青海省人民醫(yī)院收治的20例甲狀腺癌患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，均經(jīng)病理證實為甲狀腺癌。其中男性10例、女性10例，年齡為50～70歲，中位數(shù)年齡為61.33歲。腫瘤直徑＞1 cm者8例、≤1 cm者12例；TNM分期為Ⅰ期、Ⅱ期患者共13 例，Ⅲ期、Ⅳ期患者共7 例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者6例；腫瘤個數(shù)為單個者15例、多個者5例；有侵犯包膜現(xiàn)象者4例，未侵犯包膜者16 例。所有患者均簽署知情同意書，本研究方案已獲得青海省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批注號為No.2022?81）。

1.2 實驗用細(xì)胞與試劑

甲狀腺癌細(xì)胞SW579 購自美國ATCC 細(xì)胞庫。SNHG14小干擾RNA（si?SNHG14）（5'?UCGUAC UAUCUAGCUACU?3'）及其對照無意義陰性序列（si?NC）、miR?433?3p模擬物（mimic）（5'?CGU ACUAGUCAGUCGUA?3'）及其陰性對照（miR?NC）、miR?433?3p 特異性寡核苷酸抑制劑（anti?miR?433?3p）（5'?GAUCGAUCGCCGAUCGCCCAUUUUU?3'）及其陰性對照（anti?miR?NC）均購自廣州銳博生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒均購自大連寶生物工程公司，MTT、凋亡檢測試劑盒均購自美國Sigma 公司，兔抗人E?cadherin 抗體購自美國CST 公司，兔抗人caspase?3 前體（Pro?caspase?3）、抗裂解型caspase?3（cleaved caspase 3，C?caspase?3）、抗Ki67 及 抗N?cadherin 抗體均購自美國Santa Cruz 公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將生長至約70%匯合的SW579細(xì)胞在Opti?MEM減血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用LipofectamineTM2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分成6組：si?NC 組（轉(zhuǎn)染si?NC）、si?SNHG14 組（轉(zhuǎn)染si?SNHG14）、miR?NC 組（轉(zhuǎn)染miR?NC）、miR?433?3pmimic 組（轉(zhuǎn)染miR?433?3p mimic）、si?SNHG14+anti?miR?NC 組（si? SNHG14 與anti?miR?NC共轉(zhuǎn)染）、si?SNHG14+anti?miR?433?3p組（si? SNHG14 與anti?miR?433?3p 共轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染后，采用qPCR法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中SNHG14和miR?433?3p 的表達(dá)水平以鑒定轉(zhuǎn)染后的敲減或過表達(dá)效果。

1.4 qPCR 檢測甲狀腺癌組織和細(xì)胞中SNHG14、miR?433?3p的表達(dá)水平

采用TRIzol 法分別提取甲狀腺癌組織、癌旁組織和6 組轉(zhuǎn)染后SW579 細(xì)胞的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒說明書操作，合成cDNA后配制qPCR 反應(yīng)體系，以cDNA 為模板進(jìn)行qPCR。PCR參數(shù)：預(yù)變性95 ℃5 min；95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，共40 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。根據(jù)2-ΔΔCt法計算SNHG14、miR?433?3p 的相對表達(dá)量。SNHG14的正向引物為5'?GCAACCAGAGCGTGA AGAA?3'，反向引物為5'?ACCCGAGCAATGCCA GTA?3'；GAPDH 的正向引物為5'?GGAGCGAGA TCCCTCCAAAAT?3'，反向引物為 5'?GGCTGT TGTCATACTTCTCATGG?3'；miR?433?3p的正向引物為5'?AACGAGCTTGTGGCCGACG?3'，反向引物為5'?TGCGGCGTTTTGAACGACTGC?3'；U6 的正向引物為5'?GTCGTCGAAACTGCTGGG?3'，反向引物為5'?TGACGCTGCGTTGGCAAGTC?3'。

1.5 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后各組SW579細(xì)胞的增殖能力

在96孔板中分別接種6組SW579細(xì)胞（3×103個/孔），每組設(shè)置3 個復(fù)孔，于轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），室溫下放置4 h后，加入150 μL DMSO 振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測光密度（D）值，以D值代表細(xì)胞增殖能力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組SW579 細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況

細(xì)胞周期檢測：取6 組轉(zhuǎn)染后的對數(shù)生長期SW579 細(xì)胞（1×106個/mL），每200 μL 加入500 μL 預(yù)冷PBS，加入70%乙醇3.5 mL，離心后棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入RNase A 50 μL，37 ℃水浴30 min，加入PI 染液450 μL，4 ℃處理30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡檢測：分別取6組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期SW579 細(xì)胞，在500 μL 結(jié)合緩沖液中懸浮，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作，以流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 Transwell 實驗檢測轉(zhuǎn)染后各組SW579 細(xì)胞的遷移和侵襲能力

侵襲實驗中，取40 μL預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋后的人工基膜（metrigel）平鋪上室后放置5 h，待晾干后開始實驗。遷移實驗則不預(yù)鋪人工基膜。將200 μL對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后各組的SW579細(xì)胞（5×104個/mL）加至Transwell 上室，取600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液加至Transwell下室，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，移除未穿膜細(xì)胞后，用多聚甲醛固定侵襲或遷移細(xì)胞10 min，1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡（200 倍）下觀察并計數(shù)，以隨機選取的5個視野中細(xì)胞數(shù)的平均值為侵襲或遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSNHG14與miR?433?3p間的靶向結(jié)合

采用StarBase 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)SNHG14 與miR?433?3p 的序列間存在結(jié)合位點。構(gòu)建攜帶野生型SNHG14 基因的載體SNHG14?WT 和攜帶突變型SNHG14基因的載體SNHG14?MUT。取對數(shù)生長期SW579 細(xì)胞，按轉(zhuǎn)染處理的不同分為4 組：SNHG14?WT+miR?NC共轉(zhuǎn)染組、SNHG14?WT+miR?433?3p mimic 共轉(zhuǎn)染組、SNHG14?MUT+miR?NC 共轉(zhuǎn)染組和SNHG14?MUT+miR?433?3p mimic 共轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染24 h 后收集SW579 細(xì)胞，檢測各組細(xì)胞中熒光素酶的活性水平。為進(jìn)一步驗證SNHG14 與miR?433?3p之間的調(diào)控作用，取對數(shù)生長期SW579細(xì)胞，按轉(zhuǎn)染處理的不同分成4組：pcDNA3.1 組、pcDNA3.1?SNHG14 組、si?NC 組、si?SNHG14 組，轉(zhuǎn)染24 h 后采用qPCR法檢測各組細(xì)胞中miR?433?3p的水平。

1.9 WB法檢測轉(zhuǎn)染后各組SW579細(xì)胞中E?cadherin、C?caspase?3、Pro?caspase?3、Ki67、N?cadherin蛋白的表達(dá)

收集6 組SW579 細(xì)胞，在冰上用RIPA 裂解30 min，進(jìn)行細(xì)胞總蛋白抽提，蛋白經(jīng)SDS?PAGE 常規(guī)分離、轉(zhuǎn)PVDF膜后封閉2 h，分別加入一抗E?cadherin、C?caspase3、Pro?caspase3、Ki67、N?cadherin（稀 釋度均為1∶1 000）后在4 ℃下處理過夜，加入二抗（稀釋度為1∶2 000）后在室溫下處理1 h，化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，各條帶灰度值采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均獨立重復(fù)3 次。采用SPSS21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，本研究所有數(shù)據(jù)均屬于計量資料且均符合正態(tài)分布，以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌組織中SNHG14呈高表達(dá)而miR?433?3p呈低表達(dá)

qPCR 實驗結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中SNHG14的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（0.25±0.02vs0.86±0.09，P＜0.01），miR?433?3p的表達(dá)水平顯著低于較癌旁組織（0.64±0.06vs0.17±0.02，P＜0.01）。

2.2 敲減SNHG14可抑制SW579細(xì)胞增殖且誘導(dǎo)其凋亡

qPCR 實驗結(jié)果顯示，與si?NC組相比，si?SNHG14組SW579 細(xì)胞中SNHG14 的表達(dá)水平顯著降低（0.36±0.03vs0.88±0.09，P＜0.05）。MTT 法、FCM 檢測結(jié)果顯示，與si?NC 組相比，si?SNHG14 組SW579細(xì)胞的增殖能力降低（P＜0.05，圖1A），G1 期細(xì)胞比例增加、S 期細(xì)胞比例減少（均P＜0.01，圖1B），細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05，圖1C）。WB 法檢測結(jié)果（圖1D）顯示，與si?NC組相比，si?SNHG14組SW579細(xì)胞中Ki67、Pro?caspase?3 蛋白表達(dá)量降低（均P＜0.01），而C?caspase?3 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01）。這些結(jié)果說明，敲減SNHG14 可明顯抑制SW597 細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)其凋亡。

2.3 敲減SNHG14 表達(dá)可抑制SW579 細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT進(jìn)程

Transwell 實驗結(jié)果（圖2A）顯示，與si?NC 組相比，si?SNHG14 組SW579 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)[（68±7.10）vs（152±15.78）個，P＜0.05]與侵襲細(xì)胞數(shù)[（62±6.33）vs（139±14.21）個，P＜0.05]均顯著減少。WB法檢測結(jié)果（圖2B）顯示，與si?NC 組相比，si?SNHG14組SW579 細(xì)胞中E?cadherin 蛋白表達(dá)量顯著增加（0.80±0.08vs0.34±0.03，P＜0.05），N?cadherin 蛋白表達(dá)量顯著減少（0.27±0.03vs0.88±0.09，P＜0.05）。這些結(jié)果說明，敲減SNHG14 表達(dá)可明顯抑制SW597細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT進(jìn)程。

2.4 SNHG14靶向miR?433?3p并抑制其表達(dá)

StarBase 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)預(yù)測結(jié)果（圖3）顯示，SNHG14的3'UTR存在miR?433?3p的結(jié)合位點。雙熒光素報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與SNHG14?WT+miR?NC共轉(zhuǎn)染組相比，SNHG14?WT+miR?433?3p mimic 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低（0.26±0.03vs1.00±0.10，P＜0.01）。另外，qPCR 檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1 組比較，pcDNA3.1?SNHG14 組細(xì)胞中miR?433?3p 表達(dá)明顯降低（0.05±0.01vs0.19±0.02，P＜0.01）；與si?NC組比較，si?SNHG14組細(xì)胞中miR?433?3p明顯升高（0.51±0.05vs0.18±0.02，P＜0.01），這些結(jié)果說明，SNHG14可靶向結(jié)合miR?433?3p并抑制其表達(dá)。

2.5 過表達(dá)miR?433?3p可抑制SW579細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程，促進(jìn)其凋亡

qPCR 結(jié)果顯示，與miR?NC 組相比，miR?433?3p mimic 組SW579 細(xì)胞中miR?433?3p 的表達(dá)水平明顯升高（0.46±0.04vs0.18±0.02，P＜0.01），說明轉(zhuǎn)染實驗有效地使miR?433?3p 在細(xì)胞中過表達(dá)。MTT（圖4A）、FCM（圖4B）檢測結(jié)果顯示，與miR?NC組相比，過表達(dá)miR?433?3p可使SW579細(xì)胞的增殖活力減弱（P＜0.05），G1 期細(xì)胞比例增加、S 期細(xì)胞比例減少（均P＜0.05）；WB 法檢測結(jié)果（圖4C）顯示，與miR?NC組相比，miR?433?3p mimic 組SW579細(xì)胞中Ki67、Pro?caspase?3、N?cadherin蛋白表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.01），C?caspase?3、E?cadherin蛋白表達(dá)量均顯著升高（均P＜0.01）；FCM（圖4D）和Transwell實驗檢測結(jié)果（圖4E）顯示，與miR?NC 組相比，miR?433?3p mimic 組SW579細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），而遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01）。這些結(jié)果說明，過表達(dá)miR?433?3p可抑制SW579細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程，且促進(jìn)其凋亡。

2.6 抑制miR?433?3p可部分逆轉(zhuǎn)敲減SNHG14表達(dá)對SW579細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

MTT、qPCR、FCM、WB和Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，與si?SNHG14+anti?miR?NC組相比，si?SNHG14+anti?miR?433?3p 組SW579 細(xì)胞的增殖水平顯著升高（P＜0.05，圖5A），miR?433?3p 的表達(dá)水平明顯升高（0.51±0.05vs0.26±0.03，P＜0.01），細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例減少、S 期細(xì)胞比例增高（均P＜0.05，圖5B、C），Ki67、Pro?caspase?3、N?cadherin 蛋白表達(dá)量升高而C?caspase?3、E?cadherin蛋白表達(dá)量降低（均P＜0.01，圖5D），遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.01，圖5E）。這些實驗結(jié)果說明，抑制miR?433?3p可部分逆轉(zhuǎn)由敲減SNHG14表達(dá)產(chǎn)生的對SW579細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。

3 討論

部分lncRNA 在甲狀腺癌中轉(zhuǎn)錄失調(diào)并發(fā)揮抑癌或促癌基因作用，還可通過充當(dāng)miRNA 的海綿分子而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。既往研究[9?10]顯示，lncRNA CRNDE、lncRNA SNHG15 等在甲狀腺癌細(xì)胞中異常表達(dá)并影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究[11]顯示，SNHG14 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，而抑制其表達(dá)可通過調(diào)控miR?519b?3p/DDX5 軸促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；SNHG14 在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲低其表達(dá)能抑制彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖、遷移和免疫逃逸，并通過調(diào)控miR?152?3p 影響彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[12]；SNHG14 通過調(diào)節(jié)miR?206/YWHAZ 軸抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]；在非小細(xì)胞肺癌中，SNHG14 可使miR?340 海綿化而發(fā)揮致癌功能[14]。最近的研究結(jié)果[15]顯示，SNHG14 可通過調(diào)控miR?93?5p 抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示SNHG14 有望成為甲狀腺癌潛在標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)，SNHG14在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)，敲減SNHG14可抑制甲狀腺癌SW579 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1期，同時下調(diào)Ki67、Pro?caspase?3、N?cadherin 蛋白的表達(dá)而上調(diào)C?caspase3、E?cadherin蛋白表達(dá)。提示敲減SNHG14 表達(dá)可抑制甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖及遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期。

本研究使用StarBase 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SNHG14 和miR?433?3p 的序列上存在相互結(jié)合的位點，進(jìn)一步通過雙熒光素酶報告實驗證實了SNHG14能夠靶向調(diào)控miR?433?3p 表達(dá)，而miR?433?3p 在多種癌癥表達(dá)下調(diào)，還可通過介導(dǎo)下游mRNA 影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過程[16?18]。miR?433?3p 通過靶向生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor?bound protein 2，GRB2）抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖與侵襲[19]。人腦膠質(zhì)瘤中，miR?433?3p 通過靶向調(diào)控cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP?response element binding protein，CREB）的表達(dá)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長并增強其化療敏感性[20]。相關(guān)報道[21]指出，miR?433?3p 還可作為肝細(xì)胞癌早期診斷的生物標(biāo)志物。有研究[21]顯示，miR?433 在甲狀腺癌中低表達(dá)，miR?433 有望成為甲狀腺癌潛在標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示，miR?433?3p 在甲狀腺癌組織中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR?433?3p 會抑制SW579 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)相應(yīng)減少，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1期，同時下調(diào)Ki67、Pro?caspase?3、N?cadherin蛋白的表達(dá)而上調(diào)C?caspase?3、E?cadherin 蛋白的表達(dá)，說明SNHG14對甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用是通過靶向miR?433?3p來實現(xiàn)。

綜上所述，SNHG14在甲狀腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，敲減SW579 細(xì)胞中SNHG14 的表達(dá)可通過上調(diào)miR?433?3p 來抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明甲狀腺癌病理的分子機制和探尋其生物標(biāo)志物提供了新線索。但miR?433?3p是否可調(diào)控相關(guān)靶基因而參與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程尚需進(jìn)一步探究。