郭艷霞，鄭金海（湖南大學(xué) 生命醫(yī)學(xué)交叉研究院，湖南 長沙 410082）

在19 世紀中期，美國一名外科醫(yī)生COLEY 用滅活的細菌混合物（化膿性鏈球菌、黏質(zhì)沙雷菌等）成功治愈患者的惡性肉瘤[1]，但因結(jié)果不能夠很好地被同行重復(fù)，同時由于化療和放療的興起，使得細菌介導(dǎo)的腫瘤治療（bacteria-mediated cancer therapy，BMCT）被擱置。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，BMCT 的抗癌機制被解析而重新走進科研者的視野。研究結(jié)果[2-3]表明，一些專性或兼性厭氧菌能夠特異性地在腫瘤組織中定植和增殖，且細菌的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），如脂多糖（LPS）、鞭毛蛋白、核酸等，被機體的模式識別受體（PRR）識別，激活機體的固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，有效地改變了腫瘤免疫微環(huán)境，從而誘導(dǎo)對腫瘤的殺傷作用。目前，在腫瘤治療中被廣泛研究的細菌，包括沙門菌[3]、李斯特菌[4]、大腸桿菌[5-6]等，均有顯著的抗癌活性。其中，減毒沙門菌（一種兼性厭氧菌）因其腫瘤靶向特異性高、腫瘤組織穿透能力強、具有廣譜抑癌效果和安全性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于抗癌研究[7-11]。

1 減毒沙門菌的抗腫瘤機制

減毒沙門菌對多種實體瘤具有廣譜的靶向特異性，在腫瘤組織中細菌數(shù)量可達到肝臟、脾臟等正常器官中細菌數(shù)量的千倍甚至萬倍以上。腫瘤組織中大量的減毒菌定植與增殖能夠有效地直接殺傷腫瘤細胞，同時改善腫瘤免疫微環(huán)境，激活機體的抗腫瘤免疫。

1.1 腫瘤靶向特異性

目前，關(guān)于減毒沙門菌靶向腫瘤的相關(guān)機制尚無明確定論，究其因素可能有：（1）腫瘤組織中血管系統(tǒng)異常紊亂導(dǎo)致氧運輸能力下降，缺氧環(huán)境有利于兼性厭氧菌的定植和增殖；（2）壞死的腫瘤細胞碎片為細菌生長與繁殖提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、核酸等）；（3）高度免疫抑制的腫瘤微環(huán)境有利于細菌逃離機體的免疫清除。細菌具有良好的組織穿透力，能在化療、放療無法起到治療效果的缺氧區(qū)富集，這種特性使之成為理想的藥物運輸載體?？傊[瘤微環(huán)境為沙門菌的生存和繁殖提供了理想的條件，有助于沙門菌在腫瘤部位富集并增殖。

1.2 對腫瘤的直接殺傷作用

有研究[12-13]表明，當減毒沙門菌定居在腫瘤組織后，可通過與腫瘤細胞爭奪營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡和自噬途徑來直接殺死腫瘤。同時，減毒沙門菌的自身代謝產(chǎn)物亦可對腫瘤細胞產(chǎn)生直接殺傷。減毒沙門菌表達和分泌的大量代謝物可干擾細胞信號通路，從而影響細胞生長。研究[14]表明，細菌代謝物在癌癥治療上具有很高的應(yīng)用潛能。1991年，研究人員開始用沙門菌LPS對癌癥患者進行Ⅰ期臨床試驗，觀察到癌癥患者血清中的TNF-α、IL-6和G-CSF均升高，并顯示一定的抗腫瘤活性[15]。隨后對結(jié)直腸癌和非小細胞肺癌患者進行Ⅱ期臨床試驗，結(jié)果顯示，對結(jié)直腸癌患者具有較顯著的抑癌效果，但是對非小細胞肺癌患者的治療效果不明顯[16]。但純化的沙門菌LPS 對機體的毒性也限制了其進一步的應(yīng)用。

1.3 改變腫瘤微環(huán)境及激活機體免疫系統(tǒng)

當細菌感染機體時，細菌的PAMP，包括LPS、鞭毛蛋白和核酸等，會被機體的PRR 識別，激活機體的炎癥信號通路（如炎癥小體），進一步激活機體的固有與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，殺死腫瘤細胞。另外，死亡的腫瘤細胞進一步釋放腫瘤抗原，從而激活抗原特異性的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。沙門菌來源的LPS 可增強腫瘤微環(huán)境中TNF-α的水平，增強腫瘤特異性CD8+T細胞反應(yīng)。其鞭毛蛋白能夠抑制腫瘤細胞的增殖能力，降低CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞的含量[17]。最近有報道[10,18-19]，沙門菌鞭毛通過黑色素瘤微環(huán)境中的TLR5/NF-κB信號通路，以及誘導(dǎo)巨噬細胞極化，激活機體免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。另有研究[20-21]表明，減毒沙門菌可誘導(dǎo)連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達上調(diào)，促進腫瘤細胞與樹突狀細胞之間形成間隙連接，從而促進加工過的腫瘤抗原肽的轉(zhuǎn)移和交叉表達，腫瘤細胞中Cx43 的上調(diào)也降低了免疫抑制酶吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）的表達。樹突狀細胞交叉提呈的腫瘤抗原和IDO的降低進一步激活了CD8+T細胞，加強抗腫瘤免疫反應(yīng)。

2 臨床試驗現(xiàn)狀及其存在問題

到目前為止，多種減毒沙門菌進入臨床試驗（表1）。其中，鼠傷寒沙門菌VNP20009 是首個進入I期臨床試驗的菌株，但在24 名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性腎癌患者中的試驗結(jié)果表明，VNP20009 并未表現(xiàn)出預(yù)期的腫瘤靶向能力，沒有達到預(yù)期的抗癌效果[22]。為了提高VNP20009 的抗癌能力，研究人員利用VNP20009表達可將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為有細胞毒性的5-氟尿嘧啶的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶，在患有食管腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌的3位患者中進行試驗，通過6個周期的治療后結(jié)果顯示，改造后的VNP20009的安全性顯著提高，且無明顯的不良反應(yīng)[23]。減毒沙門菌VXM01，通過攜帶VEGFR-2表達質(zhì)粒，在治療晚期胰腺癌的Ⅰ期臨床試驗中明顯激活VEGFR-2 的特異性T 細胞反應(yīng)并顯著減少了腫瘤灌注；但是，在評估VXM01 的安全性時，研究人員發(fā)現(xiàn)，與接受安慰劑治療相比，接受VXM01治療的患者出現(xiàn)血液中淋巴細胞減少、中性粒細胞增加和腹瀉等免疫相關(guān)不良反應(yīng)[24-25]。表達人源IL-2的減毒沙門菌Saltikva在Ⅰ期臨床試驗中可增加轉(zhuǎn)移性胃腸道腫瘤患者循環(huán)NK細胞和NK-T 細胞，且未觀察到對機體的毒性或不良反應(yīng)，這為使用多種減毒沙門菌介導(dǎo)的腫瘤免疫療法聯(lián)合其他療法的策略提供了可能性[26]。目前，Saltikva的Ⅱ期臨床試驗正在招募志愿患者中。

表1 減毒沙門菌抗腫瘤相關(guān)臨床試驗

但減毒沙門菌在臨床試驗中，顯示出了一定的局限性，主要為與在動物腫瘤模型中展現(xiàn)出的抗癌效果和生物安全性不一致，這可能是由多方面原因造成的，如減毒菌的過度弱化、宿主免疫系統(tǒng)的差異性、腫瘤生長速度和微環(huán)境等的不同，都可能會改變細菌在腫瘤微環(huán)境中的行為，進而導(dǎo)致臨床試驗結(jié)果未及預(yù)期。另外，臨床試驗結(jié)果揭示，單一的減毒沙門菌腫瘤免疫療法或許并不能達到理想的治療效果，與其他治療手段聯(lián)合或?qū)槟[瘤治療提供新的策略。

3 提高減毒沙門菌抗腫瘤效果的策略

減毒沙門菌基因編輯可操作性強，具有良好的應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景。利用可控表達系統(tǒng)，可實現(xiàn)抗腫瘤藥物在時空上精準表達遞送，大幅度提高治療的安全性。同時，將減毒工程菌與其他治療方法聯(lián)用，可進一步增強對腫瘤的治療效果。

3.1 遺傳工程改造

3.1.1 細菌毒性弱化 由于野生型細菌通常具有一定的毒性，因此需要通過基因改造降低其毒性，以提高治療性細菌的安全性。VNP20009通過將腺嘌呤和脂質(zhì)A合成所必需的兩個基因purI和msbB進行突變，在弱化細菌毒性的同時提高其在富含嘌呤的腫瘤組織中定居和增殖的能力。但是，在一項Ⅰ期臨床研究[22]中，由于VNP20009的毒性被過度弱化，導(dǎo)致其對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者和腎細胞癌患者無抑癌作用。A1-R，一種亮氨酸/精氨酸營養(yǎng)缺陷型沙門菌株，可誘導(dǎo)靜息癌細胞進入細胞周期，即從G0/G1 期進入到S/G2/M期，從而增強對化療藥物的敏感性[28]。鳥苷四磷酸突變沙門菌株（ΔppGpp），通過刪除relA和spoT 基因造成ppGpp 合成缺陷，成為非侵襲性菌株，其毒力僅是野生型細菌的百萬分之一[29]。

3.1.2 增強腫瘤靶向特異性 細菌抑癌作用的前提是其能夠在腫瘤組織定居和增殖，即細菌的抑癌作用與定居在腫瘤組織中的抗癌細菌含量呈正相關(guān)。在VNP20009的臨床Ⅰ期臨床試驗[22]中未表現(xiàn)出預(yù)期的靶向能力，從而沒有達到理想的抗癌效果。因此，提高細菌的腫瘤靶向效率是BMCT 抑癌效果的關(guān)鍵。通過在VNP20009表面表達CEA特異性ScFv以增強腫瘤靶向性，可顯著抑制轉(zhuǎn)染了人CEA表達質(zhì)粒的MC38 細胞小鼠結(jié)腸癌移植瘤的生長[30]。另有研究[31]表明，在ΔppGpp 菌株膜外蛋白A 上表達精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽，其可特異性結(jié)合在腫瘤細胞和腫瘤血管生成中過度表達的αvβ3 整合素，從而增強細菌的腫瘤靶向性和抑癌作用。減毒沙門菌菌株YB1，通過遺傳工程將菌株SL7207（aroA基因缺失）的必需基因asd 替換為缺氧靶向啟動子控制的基因結(jié)構(gòu)，在有氧條件下阻斷asd 基因的表達，導(dǎo)致二氨基庚二酸，diaminopimelate，DAP）合成受阻，使細菌在生長時發(fā)生裂解，以此提高YB1對缺氧腫瘤組織的靶向性[32-33]。

3.1.3 遞送多種抗癌因子提高抗腫瘤效果 減毒沙門菌不僅展現(xiàn)出顯著的抗癌效果，還具有良好的組織穿透能力和腫瘤靶向特異性。因此，減毒沙門菌可作為抗癌藥物的理想載體。目前，研究人員廣泛研究了利用減毒沙門菌攜帶細胞毒性蛋白、細胞因子、腫瘤相關(guān)抗原、siRNA和前藥轉(zhuǎn)化酶等藥物，可有效抑制腫瘤生長和延長荷瘤小鼠生存期。研究[3]表明，利用減毒沙門菌表達的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白B（vibrio vulnificusflagellin B,FlaB）能有效改善腫瘤免疫微環(huán)境，解除免疫抑制信號，使小鼠結(jié)直腸癌皮下腫瘤顯著消退甚至完全消失，并且顯著抑制原位結(jié)腸癌的生長及轉(zhuǎn)移。由ΔppGpp 減毒菌表達的溶細胞素A（cytolysin A，ClyA）可引起哺乳動物細胞膜孔洞形成，誘導(dǎo)細胞壞死，破壞腫瘤基質(zhì)細胞，提高腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤，顯著抑制腫瘤生長甚至導(dǎo)致腫瘤消失[34]。細胞因子通過促進免疫細胞的活化、增殖和遷移等促進殺傷腫瘤細胞。利用減毒沙門菌表達IL-2，可抑制瘤內(nèi)血管生成，增加瘤內(nèi)壞死，并有效誘導(dǎo)局部和系統(tǒng)性NK細胞增殖，增強抗腫瘤反應(yīng)[35]。以VNP20009為載體，在瘤內(nèi)表達可將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為具抗腫瘤活性的5-氟尿嘧啶的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶，在抑制腫瘤的同時，大大降低了機體的系統(tǒng)毒性[36]。瘤內(nèi)高度表達的免疫抑制因子IDO可顯著抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，通過減毒沙門菌攜帶編碼IDO shRNA的質(zhì)粒能夠增強中性粒細胞在腫瘤組織中的浸潤，激活固有免疫應(yīng)答，進一步抑制腫瘤生長、促進腫瘤死亡[37]。相關(guān)減毒沙門菌表達免疫調(diào)節(jié)子的研究總結(jié)見表2。

表2 減毒沙門菌表達免疫調(diào)節(jié)因子的相關(guān)研究

3.2 采用可控化表達系統(tǒng)

抗癌基因的高水平持續(xù)性表達會對機體正常組織產(chǎn)生毒性。因此，抗癌基因表達的遠程精準調(diào)控對BMCT 是極其重要的。γ 射線誘導(dǎo)的pRecA 啟動子需要電離輻射，但輻射會對正常組織造成損傷[53]。因此，采用安全型誘導(dǎo)表達系統(tǒng)（如pBAD、pTet 和Pm等），即通過給予外源誘導(dǎo)劑（如L-阿拉伯糖、四環(huán)素和乙酰水楊酸等）實現(xiàn)抗癌藥物可控化釋放，可大幅度降低對機體正常組織的毒性[3,54]。目前新興的利用腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的低氧誘導(dǎo)的啟動子系統(tǒng)（HIP-1和NirB）[55-56]及細菌密度依賴性的群體感應(yīng)系統(tǒng)[57]，也是一類調(diào)控抗癌藥物精準表達的理想手段。

3.3 聯(lián)合治療

雖然減毒沙門菌有許多抗腫瘤的優(yōu)點，但在Ⅰ期臨床試驗中，由于減毒沙門菌的腫瘤靶向性和細菌的毒性作用而無法達到預(yù)期的抗癌效果。考慮到癌癥治療的復(fù)雜性，單一療法并不能實現(xiàn)良好的抗癌作用，需聯(lián)合其他療法以增強抑瘤效果或達到治愈的目的。

3.3.1 與手術(shù)聯(lián)合 原發(fā)性腫瘤手術(shù)切除后，對轉(zhuǎn)移性腫瘤無法完全清除。有研究[58-59]顯示，術(shù)后進行沙門菌治療可顯著減少癌轉(zhuǎn)移，并有效提高患者生存期，表明在手術(shù)切除后進行減毒沙門菌治療的臨床潛力。

3.3.2 與化療聯(lián)合 由于腫瘤中血管系統(tǒng)的紊亂及不完整性，阻礙了化療藥物在腫瘤組織中的擴散，特別是在壞死和缺氧組織區(qū)域的傳遞，易造成腫瘤耐藥。為了克服化療中所面臨的腫瘤靶向不足、組織穿透性差和靶細胞毒性低等問題，利用細菌可以穿透腫瘤組織、定居在壞死區(qū)和缺氧區(qū)的能力，將BMCT 和化療相結(jié)合，一方面可以降低高劑量化療藥物對機體的毒性作用，另一方面可促進細菌在腫瘤中的定植，提高抑癌效果[60-61]。有研究[60]表明，抑制炎癥和血管生成的化合藥物雷公藤甲素可通過減少黑色素瘤中浸潤的中性粒細胞的數(shù)量，增加VNP20009 在腫瘤定植的數(shù)量，進而顯著抑制腫瘤生長，提高小鼠存活率。另一項研究[62]表明，將對機體有嚴重毒性的肺癌治療藥物紫杉醇制備成紫杉醇脂質(zhì)體后電轉(zhuǎn)化到細菌中，以氣管給藥的方式治療原發(fā)性大鼠肺癌，通過激活機體免疫反應(yīng)，可顯著提高抗癌效果。因此，將BMCT與化療相結(jié)合，可協(xié)同增強抗癌效果。

3.3.3 與放療聯(lián)合 放療是基于電離輻射使DNA雙鏈斷裂、造成DNA 損傷，從而殺死腫瘤細胞的治療方法。然而，放療的有效性主要取決于組織中氧的含量，壞死與缺氧區(qū)域的低氧濃度是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。有研究[63-64]表明，減毒沙門菌與放療相結(jié)合，產(chǎn)生的抗腫瘤效果顯著強于單獨治療。

3.3.4 與免疫療法聯(lián)合 過繼T細胞療法與活的或熱滅活的鼠傷寒沙門菌聯(lián)合治療，可顯著增強過繼性T 細胞的增殖能力，改變腫瘤微環(huán)境，增強抗腫瘤活性，并有效抑制腫瘤的復(fù)發(fā)[65]。將光熱材料聚多巴胺包裹在VNP20009 表面，同時將抗PD-1 肽承載于磷脂相變凝膠內(nèi)以達到原位緩釋的目的，利用細菌、光熱和免疫三重聯(lián)合治療策略，能達到更有效的抗癌作用[66]。PD-1 抗體作為一種高效的腫瘤免疫療法，已應(yīng)用于臨床腫瘤治療，但其低應(yīng)答率、免疫相關(guān)不良反應(yīng)多等也限制了其廣泛應(yīng)用。有研究[67]將光熱敏感脂質(zhì)體（pH-temperature dual-sensitive liposome,PTSL）與減毒沙門菌外膜囊泡（outer membrane vesicle,OMV）融合制成的仿生級聯(lián)靶向納米系統(tǒng)（siRNA@PLOV）應(yīng)用于腫瘤治療，該系統(tǒng)不僅保留了OMV 的生物學(xué)特性，還增強了載藥能力，聯(lián)合治療明顯增加T細胞的浸潤，可有效提高T細胞的細胞毒性和抗癌活性。

3.3.5 與光熱療法聯(lián)合 光熱療法是指利用外部光源照射到瘤內(nèi)的具有較高光熱轉(zhuǎn)換效率的材料，將光能轉(zhuǎn)化成熱能，從而殺死腫瘤的新興抗癌手段。有研究[68]表明，使用納米材料聚多巴胺以氧化和自聚合方式包裹VNP20009，通過尾靜脈注射的減毒菌特異性靶向腫瘤后，通過近紅外激光照射治療，消除了腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。有趣的是，細菌療法協(xié)同光熱療法還可增強彼此的抑癌能力，從而產(chǎn)生更好的抗癌效果。

4 展望

BMCT是一個快速發(fā)展的誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫的腫瘤治療領(lǐng)域，是直接殺傷腫瘤、激活抗腫瘤免疫反應(yīng)的新型腫瘤治療方法。雖然關(guān)于BMCT的研究已有一百多年，但到目前為止，只有減毒牛型結(jié)核桿菌（mycobacterium bovis）懸液制成的活菌苗即卡介苗（bacille calmette-guérin，BCG）已成功應(yīng)用于臨床膀胱癌患者的治療。因此，BMCT 在向臨床轉(zhuǎn)化之前，仍有一些問題需要解決。減毒沙門菌雖顯示出良好的轉(zhuǎn)化潛能，但仍有一些方面需要進一步提升。第一，安全性問題。安全性是腫瘤治療的先決條件，沙門菌如何在進行適當?shù)臏p毒化處理后，仍保持良好的抗腫瘤活性，是需要研究人員持續(xù)探索的問題。VNP20009 臨床試驗的失敗，可能是因為細菌毒性過度弱化而導(dǎo)致無抑癌效果。新近研究[69]報道，利用輻射誘變技術(shù)獲得了超耐氧的減毒沙門菌株KST0650，在感染CT26 細胞小鼠移植瘤模型的14 d中，KST0650在腫瘤組織中都維持較高且穩(wěn)定的濃度，但不能有效地抑制腫瘤生長和提高小鼠生存率。在生物技術(shù)支撐下，兼顧安全性與抗腫瘤活性的減毒沙門菌株會很快構(gòu)建成功。第二，抗菌免疫。治療菌株的預(yù)暴露會降低抑癌效果，因此在細菌治療腫瘤患者前，了解其免疫背景是非常必要的。不過，有研究[46]報道，營養(yǎng)缺陷型沙門菌菌株SF200（ΔlpxR9 ΔpagL7 ΔpagP8 ΔaroA ΔydiV ΔfliF）對機體的免疫刺激能力顯著增強，可克服預(yù)先暴露會限制抗腫瘤活性的問題。第三，減毒沙門菌的給藥方式?？诜毦^靜脈注射的生物利用度低，腫瘤抑制能力也較差，可能的原因是口服細菌在到達腫瘤組織前被胃腸道消化而失活。研制能夠保持活性的口服細菌制劑在臨床治療中是非常有必要的。有研究[70]報道，通過生物界面的超分子自組裝，在15 min 內(nèi)便可完成生物相容性脂質(zhì)體包裹大腸桿菌，提高細菌在胃腸道惡劣條件下的生存能力。未來，對于減毒沙門菌治療的給藥途徑需要進一步優(yōu)化。此外，在機制研究方面，減毒沙門菌的腫瘤靶向性及抗腫瘤的機制目前還不甚清楚。許多研究使用了不同的菌株、腫瘤小鼠模型、給藥途徑、細菌劑量及給藥次數(shù)等，進一步表明了減毒沙門菌抗腫瘤機制的復(fù)雜性。因此，只有深入了解減毒沙門菌的腫瘤靶向性及抗腫瘤機制，才能最大化地提高抗腫瘤療效。

綜上，雖然減毒沙門菌介導(dǎo)的腫瘤治療在臨床試驗中還未達到預(yù)期效果，但基于減毒沙門菌抗腫瘤治療與傳統(tǒng)治療相比存在許多顯著的優(yōu)勢，仍值得深入探究。隨著現(xiàn)代生物科技的發(fā)展與多學(xué)科的交叉融合，減毒沙門菌介導(dǎo)的腫瘤治療在臨床轉(zhuǎn)化方面有著巨大的潛力與良好的臨床應(yīng)用前景。