關(guān)滄海，王海存，于少博，高欣，姜興明，孫東升（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院.普通外科；b.心肌缺血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150086）

膽管癌是一種可發(fā)生在膽管任何部位的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1?4]，患者的5 年生存率不足30%，其原因包括患者早期癥狀不明顯、腫瘤解剖位置不易明確以及缺乏特異性的分子標(biāo)志物等[5?6]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由前體mRNA 經(jīng)反向剪切形成的閉合環(huán)狀的RNA，許多circRNA 在人體多種生理病理過程，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7?10]。有研究[11?13]發(fā)現(xiàn)，circ_0000615 在乳腺癌、腎癌和胃癌等腫瘤中呈高表達(dá)，并通過吸附miRNA 進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，然而circ_0000615 在膽管癌中的表達(dá)及其在膽管癌中的作用和相關(guān)機(jī)制尚少見報(bào)道。既往研究[14?15]發(fā)現(xiàn)，miR?432?5p 在乳腺癌和肝癌中呈低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用。本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)circ_0000615 與miR?432?5p間是否存在互補(bǔ)序列并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者的靶向關(guān)系，同時(shí)探索circ_0000615 是否通過靶向miR?432?5p 調(diào)控膽管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移及其分子機(jī)制，以期為膽管癌的診斷和治療提供新的潛在的治療靶點(diǎn)和分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞，包括正常膽管上皮HIBEC細(xì)胞和膽管癌CCLP?1、QBC939、TFK?1 和RBE 細(xì)胞，其中除RBE 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心外，其余細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，si?NC、si?circ_0000615（si?circ?1、si?circ?2）、miR?NC、miR?432?5p mimic、inhibitor?NC 和inhibitor?miR?432?5p均購(gòu)自上海吉瑪公司，TRIzol試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master試劑盒均購(gòu)自瑞士Roche 公司，RNase R 購(gòu)自上海碧云天公司，CCK?8 試劑盒購(gòu)自日本Dojindo 公司，EdU 試劑盒購(gòu)自廣州Ribobio公司，基質(zhì)膠（matrigel）購(gòu)自美國(guó)BD公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

將CCLP?1、QBC939、RBE 和TFK?1 細(xì)胞等膽管癌細(xì)胞和正常膽管上皮HIBEC細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37°C、5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度約70%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將CCLP?1 和QBC939 細(xì)胞（500 個(gè)細(xì)胞/孔）接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)40%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：si?NC 組（轉(zhuǎn)染si?circ NC），si?circ?1 組（轉(zhuǎn)染si?circ?1），si?circ?2 組（轉(zhuǎn)染si?circ?1），si?NC+inh?NC 組（轉(zhuǎn)染si?circ NC+inhibitor NC），si?NC+inh?miR?432?5p 組（轉(zhuǎn)染si?circ NC+inhibitor?miR?432?5p），si?circ?1+inh?miR?432?5p 組（轉(zhuǎn)染si?circ?1+inhibitor?miR?432?5p）。用Lipofectamine?3000將不同組合的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CCLP?1 和QBC939 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后CCLP?1 和QBC939 細(xì)胞中circ_0000615、miR?432?5p的表達(dá)

用TRIzol試劑盒提取轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞總RNA，電泳驗(yàn)證完整性后，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用SYBR Green試劑進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。引物序列：circ_0000615正向引物為5'?GCGCTCAATCCT TTGGGAAC?3'，反向引物為5'?GGACAACATCAT TGCTTTTCAGAC?3'；miR?432?5p正向引物為5'?ACACTCCAGCTGGGTCTTGGAGTAGGTCA?3'，反向引物為5'?TGGTGTCGTGGAGTCG?3'；GADPH正向引物為5'?GGGAGCCAAAAGGGTCAT?3'，反向引物為5'?GAGTCCTTCCACGATACCAA?3'；U6正向引物為5'?GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT?3'，反向引物為5'?CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT?3'。PCR擴(kuò)增條件：95°C 10 min，95°C 12 s、50°C 30 s、72°C 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以GAPDH和U6作為內(nèi)參基因，用2?ΔΔCt方法計(jì)算circ_0000615、miR?432?5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 RNase R酶切circ_0000615實(shí)驗(yàn)

從膽管癌CCLP?1、QBC939 細(xì)胞中抽提出總RNA，RNase R 組RNA 樣本與RNase R 酶混合反應(yīng)15 min，NC 組RNA 樣本經(jīng)稀釋緩沖液處理15 min，之后兩組RNA 樣本按1.3 方法，用qPCR 檢測(cè)細(xì)胞中GAPDH和circ_0000615的表達(dá)水平。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證circ_0000615 與miR?432?5p之間的靶向關(guān)系

通過在線生物信息學(xué)分析網(wǎng)站（Circinteractome）預(yù)測(cè)circ_0000615 和miR?432?5p 之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，將含有miR?432?5p與circ_0000615互補(bǔ)結(jié)合部位的序列插入雙熒光素酶基因報(bào)告基因載體pmirGLO 構(gòu)建野生型質(zhì)粒（circ_0000615?WT），將上述序列突變序列構(gòu)建突變型質(zhì)粒（circ_0000615?MUT）。用Lipofectamine?3000 將報(bào)告基因質(zhì)粒與miR?432?5p mimic 或miR?NC 共轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCLP?1、QBC939 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.6 CCK?8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組CCLP?1和QBC939細(xì)胞的增殖能力

將轉(zhuǎn)染后處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞用胰酶消化后，以1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至0、24、48 和72 h 時(shí)加入10 μL 的CCK?8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（D）值，以D值表示細(xì)胞的增殖能力。

1.7 EdU 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組CCLP?1、QBC939 細(xì)胞的增殖能力

將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到96 孔板，培養(yǎng)24 h 后在每個(gè)孔中加入100 μL EdU 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用多聚甲醛固定細(xì)胞，隨后在避光條件下用Apollo 567 和Hoechst 33342 進(jìn)行染色。用倒置熒光顯微鏡觀察、計(jì)算EdU 陽性細(xì)胞數(shù)量并拍照，將Apollo 567 陽性細(xì)胞與Hoechst 33342 標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量的比值作為EdU陽性細(xì)胞率。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組CCLP?1、QBC939細(xì)胞的遷移、侵襲能力

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將含1×105個(gè)細(xì)胞的懸液（200 μL）接種于Transwell 上室，隨后在下室加入800 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，并依次進(jìn)行甲醛固定以及結(jié)晶紫染色。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：在加入細(xì)胞懸液前在Transwell 上室預(yù)鋪基質(zhì)膠，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)最后，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)遷移或侵襲細(xì)胞并拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 6.0 軟件繪制相關(guān)圖像。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，配對(duì)數(shù)據(jù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 或P＜0.01 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在膽管癌細(xì)胞中circ_0000615呈高表達(dá)而miR?432?5p呈低表達(dá)

qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與HIBEC 細(xì)胞比較，CCLP?1、QBC939、RBE 和TFK?1 細(xì)胞中circ_0000615 呈高水平表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.01，圖1A），CCLP?1 和QBC939 細(xì)胞中表達(dá)水平較其他細(xì)胞更高，故選取這2種細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；與HIBEC細(xì)胞比較，miR?432?5p在CCLP?1、QBC939、RBE和TFK?1細(xì)胞中呈低水平表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.01，圖1B）。RNase R酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1C）顯示，與NC 組樣本比較，RNase R處理的樣本中，雖然GAPDH含量明顯降低（P＜0.01），但circ_0000615 含量無明顯明顯變化（P＞0.05），說明circ_0000615 可以抵抗RNase R 酶切，上述結(jié)果證明circ_0000615 具有比線性RNA 更穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)circ_0000615 與miR?432?5p間存在靶向關(guān)系

根據(jù)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（Circinteractome）的預(yù)測(cè)顯示，circ_0000615與miR?432?5p之間存在互補(bǔ)結(jié)合序列（圖2A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖2B）顯示，與miR?432?5p NC比較，miR?432?5p mimic+circ_0000615 WT 組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），miR?432?5p mimic+circ_0000615 MUT 組細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），這一結(jié)果證實(shí)circ_0000615 與miR?432?5p 之間存在靶向結(jié)合關(guān)系。

2.3 敲減circ_0000615 可抑制CCLP?1、QBC939 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力

qPCR檢測(cè)結(jié)果（圖3A、B）顯示，與si?NC組比較，si?circ?1 和si?circ?2兩組中兩種細(xì)胞中的circ_0000615表達(dá)水平均顯著低降低（P＜0.05 或P＜0.01），miR?432?5p 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001），說明敲減circ_0000615的實(shí)驗(yàn)成功；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)敲減circ_0000615 后miR?432?5p表達(dá)升高，說明前者負(fù)調(diào)控后者的表達(dá)。CCK?8 法（圖3C）和EdU 實(shí)驗(yàn)（圖3D）結(jié)果顯示，與si?NC 組相比，si?circ_0000615 組的細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)（圖3E）和遷移實(shí)驗(yàn)（圖3F）結(jié)果顯示，與si?NC組相比，si?circ_0000615 組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。上述結(jié)果說明，敲減circ_0000615 可抑制CCLP?1、QBC939 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

2.4 下調(diào)miR?432?5p可部分逆轉(zhuǎn)由敲減circ_0000615產(chǎn)生的對(duì)CCLP?1 和QBC939 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用

qPCR（圖4A）、CCK?8 法（圖4B）、EdU 增殖實(shí)驗(yàn)（圖4C）、Transwell遷移（圖4D）和侵襲實(shí)驗(yàn)（圖4E）結(jié)果顯示：與si?NC+inh?NC組相比，si?NC+inh?miR?432?5p 組miR?432?5p 的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），說明inhibitor?miR?432?5p轉(zhuǎn)染成功后顯著抑制了miR?432?5p的表達(dá)；同時(shí)，CCLP?1 和QBC939 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯升高（P＜0.01 或P＜0.001），說明下調(diào)miR?432?5p 可增強(qiáng)CCLP?1 和QBC939細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，此外，si?circ?1+inh?miR?432?5p 組細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯弱于si?NC+inh?miR?432?5p 組（P＜0.05 或P＜0.01），但又高于si?NC+inh?NC組（P＜0.05），說明下調(diào)miR?432?5p可部分逆轉(zhuǎn)由敲減circ_0000615產(chǎn)生的對(duì)CCLP?1 和QBC939 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的促進(jìn)作用。

3 討論

手術(shù)切除是目前治療膽管癌最有效的手段，但大多數(shù)膽管癌患者直到晚期才被診斷，難以通過手術(shù)進(jìn)行根治切除。因此，探索膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及有效的生物學(xué)標(biāo)志物是十分必要的。circRNA 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵作用已成為研究焦點(diǎn)[16?18]。circ_0000615 在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)并通過海綿吸附miR?145?5p 促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]；circ_0000615 通過miR?138?5p/FoxP4 軸促進(jìn)腎癌的發(fā)生發(fā)展[12]。然而，circ_0000615 在膽管癌中的表達(dá)及其能否調(diào)控膽管癌的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。此外，miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也起重要作用[19?22]。例如，miR?432?5p 在膠質(zhì)瘤中通過抑制下游促癌基因RAB10的表達(dá)從而起到抑癌作用[23]。目前，尚無研究指出miR?432?5p 在膽管癌中能否發(fā)揮調(diào)控作用。

本研究首次發(fā)現(xiàn)circ_0000615 和miR?432?5p在膽管癌細(xì)胞中呈異常表達(dá)，qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明膽管癌CCLP?1、QBC939、RBE 和TFK?1 細(xì)胞中circ_0000615 的表達(dá)水平明顯高于正常膽管上皮HIBEC 細(xì)胞；miR?432?5p 在膽管癌細(xì)胞中明顯低表達(dá)。值得注意的是，circRNA 可以與mRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，miRNA 也能直接結(jié)合circRNA或通過影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)間接調(diào)控circRNA，從而促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11?13]。本研究通過在線生物信息學(xué)分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circ_0000615 與miR?432?5p 之間存在結(jié)合位點(diǎn)，并用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)circ_0000615與miR?432?5p 存在靶向結(jié)合關(guān)系。本研究體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲減circ_0000615 表達(dá)后可使CCLP?1、QBC939 細(xì)胞中miR?432?5p 表達(dá)水平升高，細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力降低，說明miR?432?5p可能是一個(gè)抑癌基因，上調(diào)其表達(dá)水平可以抑制膽管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為；在未經(jīng)干預(yù)的膽管癌細(xì)胞中circ_0000615 呈高表達(dá)狀態(tài)，circ_0000615抑制了miR?432?5p 在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)，后者的抑癌效應(yīng)沒有顯示出來，在敲減circ_0000615后，miR?432?5p的抑癌作用就表現(xiàn)出來了。

綜上所述，本研究證實(shí)circ_0000615在膽管癌細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，而miR?432?5p 呈低水平表達(dá)；circ_0000615 促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為，這一結(jié)果與靶向抑制miR?432?5p的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果提示，circ_0000615可能成為膽管癌診斷和治療的分子靶標(biāo)，敲減circ_0000615或過表達(dá)miR?432?5p 有望作為膽管癌的治療有效措施，進(jìn)而為臨床轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)，但circ_0000615/miR?432?5p 軸如何調(diào)控膽管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的上下游分子機(jī)制仍然需要深入探索。