馬曉麗，高艷，魏瑜，曹雷雨，張周華，張莉（.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 綜合內(nèi)四科，新疆 烏魯木齊 830054；.新疆醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054）

目前，食管癌為全球高發(fā)惡性腫瘤之一。根據(jù)全球腫瘤數(shù)據(jù)（Globocan 2012）分析[1]顯示，2012年全球食管癌的發(fā)病率位居第八位。2015 年，有數(shù)據(jù)[2?3]顯示，食管癌發(fā)病率和病死率均居第四位。由于食管癌患者早期臨床表現(xiàn)不明顯，且缺乏有效的早期篩查及診斷方法，大部分食管癌患者確診時(shí)已為中晚期，無手術(shù)機(jī)會(huì)，五年生存率較低。對于食管癌的治療，臨床上仍采用放療、化療等綜合治療[4]，治療手段比較單一，缺乏有效的靶向及免疫治療手段。在中國，食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占食管癌病例數(shù)的90%以上。整合素 連接激 酶（integrin?linked kinase，ILK）是HANNIGAN 等[5]于1996 年發(fā)現(xiàn)的一種絲氨酸/甲硫氨酸蛋白激酶。既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，ILK 是整合素和生長因子受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要信號蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、凋亡、增殖、遷移、細(xì)胞周期、腫瘤形成及胚胎發(fā)育等過程中起著重要作用。ILK 參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在一些惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如結(jié)腸癌[7?8]、膠質(zhì)瘤[9?11]等。但目前關(guān)于ILK 在ESCC方面的研究甚少，本研究將探討ILK的異常表達(dá)對ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步深入研究ILK在腫瘤中發(fā)揮的作用，從而為ESCC的精準(zhǔn)診療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象的一般資料

檢測ILK 所用的150 點(diǎn)組織芯片（目錄號為HEso?Squ150CS?02）購自上海芯超生物科技有限公司。組織芯片中ESCC和配對的癌旁組織標(biāo)本，選取2012年1月至2014年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的75 例ESCC 患者。納入患者術(shù)前均未接受放化療及其他抗腫瘤輔助治療，病理明確診斷為ESCC。收集患者的病理資料，包括年齡、性別、病理診斷、病理分級、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況和TNM分期（AJCC第7版）等臨床病理資料。75例ESCC組織芯片在免疫組織化學(xué)染色中無脫落，組織芯片排列整齊、背景清潔。

1.2 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

ESCC 細(xì)胞EC9706、ECA109、TE?1、KYSE?150購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司細(xì)胞保存中心。裸鼠（4周齡BALB/c）購自上海靈暢生物科技有限公司[動(dòng)物合 格證號：SCXK（滬）2018?0003]。DMEM培養(yǎng)基、青?鏈霉素、胎牛血清、胰蛋白酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRIzol試劑盒購自上海普飛公司，qPCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自廣州銳博公司，MTT 試劑盒購自美國Genview公司，凋亡試劑盒購自美國eBioscience公司，流式細(xì)胞分析儀（CantoⅡ）購自美國BD公司，WB檢測試劑購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司，酶類試劑購自美國NEB公司，WB所用一抗ILK兔抗人抗體購自英國Abcam公司，內(nèi)參β?actin抗體購自美國Santa Cruz公司，兔二抗、鼠二抗均購自美國CST 公司，BCA 蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光劑均購自美國Thermo公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測ESCC 組織中ILK 蛋白的表達(dá)

脫蠟前將組織芯片在60 ℃恒溫箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟、無水乙醇水合、PBS 沖洗3次（5 min/次）?？乖靡叶匪囊宜峥乖迯?fù)液修復(fù)，過氧化氫溶液室溫封存30 min，加入牛血清蛋白于37 ℃封閉30 min，PBS 洗滌，加入稀釋型抗ILK 兔抗人多克隆抗體，4 ℃過夜。次日，洗去殘液，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃反應(yīng)30 min，用DAB顯色劑洗滌，蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。ILK 表達(dá)情況主要依據(jù)抗體的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染色強(qiáng)度和染色陽性率來評價(jià)，其中染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為0分（陰性）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）、3 分（棕褐色），染色陽性率評分標(biāo)準(zhǔn)為0 分（陰性）、1 分（＜25%）、2分（25%～＜50%）、3分（50%～＜75%）、4 分（≥75%）。染色分?jǐn)?shù)=染色強(qiáng)度評分×染色陽性率評分，以0～3分為低表達(dá)，4～12分為高表達(dá)。

1.4 慢病毒載體構(gòu)建

利用Chromas 靶序列分析軟件設(shè)計(jì)針對目的基因的干擾序列，針對ILK 的干擾序列為5'?CGAAGC TCAACGAGAATCA?3'。隨后合成具有干擾序列的單鏈DNA 寡核苷酸（購自南京金斯瑞生物科技公司），將其在最終濃度為20 μmol/L的退火緩沖液中溶解。消化GV115載體（購自上海吉?jiǎng)P基因公司）并將其線性化，連接雙鏈寡核苷酸與線性化載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。采用聚合酶鏈反應(yīng)鑒定陽性克?。═aKaRa公司，貨號R001A），進(jìn)行保存和測序，選擇測序結(jié)果與靶序列完全一致的克隆用于質(zhì)粒抽提。隨后，將質(zhì)粒包裝成病毒（由上海吉?jiǎng)P基因公司完成），陰性對照病毒滴度為5×108TU/mL，目的基因干擾病毒LV?ILK?RNAi滴度為4×108TU/mL。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與干擾慢病毒感染

所有細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期KYSE?150細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)20%左右，將陰性對照和LV?ILK?RNAi 病毒以MOI=20 加入到KYSE?150 細(xì)胞中。將細(xì)胞分組處理：shILK 組細(xì)胞感染目的基因干擾慢病毒、shCtrl組細(xì)胞感染陰性對照病毒。感染16 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，在感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況。

1.6 WB 法檢測KYSE?150 細(xì)胞中ILK 基因的敲降效率

收集2 組細(xì)胞（shCtrl 和shILK），RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清液用BCA 法測定蛋白濃度。進(jìn)一步行聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用濕轉(zhuǎn)法把蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，聚偏氟乙烯薄膜用5%脫脂奶粉液封閉，室溫封閉1 h。PBS 清洗3次，5 min/次。加入一抗ILK 抗體（稀釋比1∶500）和β?actin 抗體（稀釋比1∶5 000）4 ℃反應(yīng)過夜。次日，用PBS 清洗多余抗體3 次，5 min/次。加入對應(yīng)二抗（稀釋比1∶10 000），室溫反應(yīng)1.5 h。用PBS清洗多余抗體3次，每次5 min。隨后加入發(fā)光底物，反應(yīng)30 s，ECL 法結(jié)合X 光片顯影，使用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的積分光密度值，并和β?actin 進(jìn)行相比較，統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度。

1.7 qPCR法檢測敲降ILK對KYSE?150細(xì)胞中ILK mRNA表達(dá)的影響

收取各組細(xì)胞樣品，使用TRIzol 試劑裂解并抽提總RNA。利用PrimeScript RT 試劑盒在標(biāo)準(zhǔn)條件下產(chǎn)生隨機(jī)引物，將500 ng的總RNA反轉(zhuǎn)錄為10 μL的最終體積。反應(yīng)條件是95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s、59.2 ℃退火與延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)。結(jié)果用GAPDH的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化。用ILK和GAPDH的引物進(jìn)行qPCR，ILK 基因的上游引物序列：5'?GAC GACATTTTCACTCAGTGC?3'，下游引 物序列：5'?ACGGTTCATTACATTGATCCGTG?3'；GAPDH 上游引物序列：5'?TGACTTCAACAGCGACACCCA?3'，下游引物序列：5'?CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA?3'。采用ABI7500 平臺對qRCR 的相關(guān)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（2?ΔΔCt法）。

1.8 MTT 法檢測敲減ILK 對KYSE?150 細(xì)胞增殖的影響

取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞，稀釋成單細(xì)胞懸液，每孔100 μL 接種于96 孔 板（2×103細(xì) 胞/孔），在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在細(xì)胞貼壁后0、24、48、72、96 和120 h 向每孔加入MTT 液20 μL至其終濃度為5 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去掉上清液，加入二甲基亞砜150 μL，震蕩2～5 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上測定490 nm 波長下的光密度（D）值，以D值代表細(xì)胞增殖水平。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.9 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測敲降ILK對KYSE?50細(xì)胞克隆形成能力的影響

取處于對數(shù)生長期的KYSE?150 細(xì)胞用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液接種于6孔板培養(yǎng)板上，細(xì)胞接種密度為4×103個(gè)/孔，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 周，間隔3 d 更換培養(yǎng)液1 次。用4%多聚甲醛固定30～60 min 后，用結(jié)晶紫染色10～20 min。晾干、拍照、計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)及形成率，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。進(jìn)行3 次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.10 FACS 檢測敲降ILK 對KYSE?150 細(xì)胞凋亡的影響

取對數(shù)增長期的shCtrl 組及shILK 組細(xì)胞，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，制備成細(xì)胞懸液。與上清細(xì)胞收集同一5 mL離心管中，1 000×g離心5 min，棄上清，以4 ℃預(yù)冷的D?Hanks液洗滌細(xì)胞沉淀。結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀，加入10 μL Annexin Ⅴ?APC染色進(jìn)行上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。利用guava InCyte軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.11 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)敲降ILK對KYSE?150移植瘤生長的影響

將4周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成對照組（NC組）和干預(yù)組（KD 組），每組10 只。制備KYSE?150細(xì)胞后（細(xì)胞接種量為2×106個(gè)，懸于200 μL PBS中），注射到動(dòng)物皮下。觀察成瘤情況，每4 d用游標(biāo)卡尺測量瘤塊最長和最短直徑，計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=（瘤體長徑×瘤體短徑2）/2。皮下注射28 d后或根據(jù)實(shí)際成瘤情況及動(dòng)物福利倫理規(guī)定，用過量的2%戊巴比妥鈉對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施安樂死，再進(jìn)行頸椎脫臼確認(rèn)死亡，剝離移植瘤，計(jì)算移植瘤體積。將取出的腫瘤稱量瘤質(zhì)量，并放于多聚甲醛中固定，液氮冷凍后于-80 ℃保存。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對所得結(jié)果進(jìn)行處理，用Prism GraphPad 9.0 軟件繪圖。以χ2檢驗(yàn)分析ILK的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以的形式表示，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比的形式表示；兩組間的差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ILK蛋白在ESCC組織中呈高表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果（圖1）顯示，ESCC 組織中ILK染色多為陽性，其在ESCC組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織[93.3%（70/75）vs29.3%（22/75），χ2=64.768，P＜0.05]。

2.2 ILK表達(dá)與ESCC患者特征的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，ILK 高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)（P=0.001），而ILK 高、低表達(dá)組患者的年齡（P=0.645）、性別（P=0.588）、T 分期（P=0.898）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.536）、分化程度（P=0.966）、臨床分期（P=0.791）等患者特征間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 ILK表達(dá)與ESCC患者臨床參數(shù)的關(guān)系（N=75）

2.3 ILK mRNA在KYSE150細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示：ESCC細(xì)胞ECA109、TE?1、EC9706、KYSE150 中ILK mRNA 的表達(dá)水平分別為（1.15±0.58）、（6.06±0.41）、（36.23±23.52）和（995.14±53.42）。以KYSE?150細(xì)胞的ILK mRNA表達(dá)水平最高，因此選用KYSE?150細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 敲降ILK基因抑制KYSE?150細(xì)胞的增殖能力

使用ILK干擾慢病毒感染KYSE?150細(xì)胞，顯微鏡觀察顯示，未見細(xì)胞有肉眼可見的形態(tài)學(xué)變化。熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況（圖3），熒光率即為陽性感染率。慢病毒感染KYSE?150細(xì)胞3 d后，兩組細(xì)胞均可見綠色熒光表達(dá)，感染效率均在90%以上。

qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4A）顯 示，shCtrl 組KYSE?150細(xì)胞中ILK mRNA的表達(dá)量約為shILK組的12.8 倍（P＜0.05）。WB 法檢測結(jié)果（圖4B）顯示，shILK組KYSE?150細(xì)胞中ILK蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05），提示ILK 敲降成功。MTT 法檢測結(jié)果（圖4C）顯示，shILK組KYSE?150細(xì)胞的增殖能力顯著低于shCtrl 組（均P＜0.01]。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4D）顯示，shILK組細(xì)胞克隆形成率低于shCtrl組（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，敲降ILK 的表達(dá)可抑制KYSE?150細(xì)胞的增殖能力。

2.5 敲降ILK基因促進(jìn)KYSE?150細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（圖5）顯示，shILK組KYSE?150細(xì)胞的凋亡率高于shCtrl 組（P＜0.05）。結(jié)果表明，敲降ILK 基因的表達(dá)可促進(jìn)KYSE?150細(xì)胞凋亡。

2.6 敲降ILK基因抑制KYSE?150細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長

裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，KD 組的裸鼠移植瘤體積及質(zhì)量均低于NC 組（P＜0.05）。表明敲降ILK 基因的表達(dá)明顯減緩了皮下移植瘤的形成速度，腫瘤體積也明顯減小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲降ILK 基因可抑制裸鼠KYSE?150 細(xì)胞移植瘤的生長，提示ILK可能參與了ESCC的發(fā)生與發(fā)展過程。

3 討論

ILK 是一種細(xì)胞內(nèi)信號蛋白，具有Ser/Thr 蛋白激酶活性，參與調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括AKT、GSK?3β、NF?κB、Erk 等信號通路[5，12]。ILK 由452 個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為59 000，位于人染色體11Pl5.5～l5.4，基因全長8.8 kb，含有13 個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子。ILK 在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、凋亡、遷移、生長、細(xì)胞周期、腫瘤形成及浸潤和轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程中起重要作用[13]。

ILK 參與惡性腫瘤形成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[14]表明ILK 高表達(dá)可導(dǎo)致裸鼠乳腺癌的形成。有研究結(jié)果[15]發(fā)現(xiàn)，ILK 可能是結(jié)腸炎癥及腫瘤發(fā)生中的分子驅(qū)動(dòng)因子和介質(zhì)，通過調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠模型的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的生長。亦有研究發(fā)現(xiàn)，ILK在一些惡性腫瘤中過表達(dá)，如乳腺癌[16]、卵巢癌[17]、結(jié)直腸癌[18]、膀胱癌[19]等，提示ILK 在腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展中起著十分重要的作用。

ILK主要通過參與腫瘤細(xì)胞的遷移和黏附、細(xì)胞外基質(zhì)降解以及腫瘤血管生成等促進(jìn)腫瘤浸潤和遷移。PERL 等[20]報(bào)道了高表達(dá)ILK 能誘導(dǎo)E?鈣黏蛋白的表達(dá)減少，降低細(xì)胞之間及細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附性，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。DRIVER等[21]利用qPCR 技術(shù)研究南非起源的5 個(gè)人類ESCC細(xì)胞中ILK 的表達(dá)情況及其亞型，分析生長因子對ILK 表達(dá)的影響，結(jié)果提示EGF 和TGF?β1 可調(diào)節(jié)ESCC細(xì)胞中ILK的表達(dá)。此外，有研究[22]報(bào)道，ILK抑制劑QLT0267通過阻止Akt和下游靶標(biāo)GSK?3β的磷酸化，可有效阻礙神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ILK/Akt級聯(lián)的信號傳導(dǎo)，進(jìn)一步遏制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，說明ILK可能成為未來腫瘤基因治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

本研究首先采用免疫組織化學(xué)染色法檢測ESCC 組織中ILK 的表達(dá)情況，結(jié)果表明ILK 蛋白在ESCC 組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05），且ILK 高表達(dá) 與淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)（P＜0.05），提示ILK 可能參與ESCC 發(fā)生、發(fā)展的過程。其次，從細(xì)胞水平通過MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲降ILK 表達(dá)后，KYSE?150 細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力減弱。表明ILK 基因可能促進(jìn)KYSE?150 細(xì)胞增殖，由此推測ILK 基因異常表達(dá)可能是增加ESCC 惡性程度的一個(gè)重要因素。細(xì)胞凋亡與許多疾病尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著密切的關(guān)系。通過FACS 檢測抑制ILK 基因表達(dá)對KYSE?150 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降ILK 基因表達(dá)后，相對于對照組，細(xì)胞凋亡率升高，故ILK 抑制KYSE?150 細(xì)胞凋亡，可能是促進(jìn)細(xì)胞增殖的一個(gè)重要原因。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，成功建立KYSE?150細(xì)胞皮下成瘤裸鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于對照組而言，ILK 干擾組裸鼠瘤體顯著偏小，而且生長較為緩慢。結(jié)果表明，敲降ILK基因可抑制裸鼠KYSE?150 細(xì)胞移植瘤的生長，提示ILK 可能參與了ESCC的發(fā)病過程。

綜上所述，本研究從組織水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物模型三個(gè)層面揭示了ILK 基因敲降可阻礙KYSE?150 細(xì)胞增殖及裸鼠皮下移植瘤的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為ESCC 的早期臨床診斷和精準(zhǔn)診療提供了新策略和新靶點(diǎn)。但目前關(guān)于ILK 與其上下游基因的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚，且相關(guān)信號通路在ESCC 中的深入研究還有待完成。后續(xù)本課題組將更進(jìn)一步研究ILK 在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機(jī)制，為ESCC治療發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)和新機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。