王維 沈艷 范亞楠 周迎春 劉華 王軍 王倩 苗文萍 何長生

（安徽省動物疫病預防與控制中心 230091)

布魯氏菌?。˙rucellosis，簡稱“布病”）是由布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病，感染后會引起懷孕母畜流產、不孕、乳腺炎；公畜睪丸炎、不育等臨床癥狀[1-2]。該病呈全球性流行，羊、牛和豬等家畜均為易感動物。我國將其列為二類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B 類流行病[3]。

我國根據(jù)各地布病流行情況，結合人間病例的發(fā)病情況，將全國分為三類區(qū)域。安徽省作為布病二類地區(qū)，在布病防控中采取監(jiān)測凈化與申報免疫相結合的防控措施[4-5]。

由于布病病原學檢測方法對實驗室生物安全水平要求高，并存在一定的感染風險，而血清學檢測操作相對簡單，感染風險低，適用性廣，在基層布病監(jiān)測工作中被廣泛應用[6]。目前，在日常防控工作中，主要采用虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）與競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）等血清學檢測方法。本研究通過采用不同的血清學檢測方法，對已知感染情況的87 份羊血清進行布魯氏菌抗體檢測，并根據(jù)檢測結果對各種方法進行評估，嘗試提出一種合理的血清學檢測方法組合方案，以期在布病申報免疫及檢測凈化工作中提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑

虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原、布魯氏菌病標準陽性與陰性血清，購自哈藥集團生物疫苗有限公司；布魯氏菌競爭ELISA 檢測試劑盒，購自青島立見診斷技術發(fā)展中心；布魯氏菌抗體快速檢測試劑卡，購自北京世紀元亨公司。以上試劑均按要求存放，并處于效期內。

1.1.2 血清樣本

血清樣本為本中心保存的已知感染情況的羊血清樣本87 份。

1.1.3 主要儀器設備

96 孔酶標儀，Bio-Rad 公司產品；37℃恒溫生化培養(yǎng)箱，哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠產品；單道微量移液器和多道微量移液器，Transferpette 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法

1.2.1.1 虎紅平板凝集試驗

對全部樣品進行RBT 檢測，操作與結果判定按照《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T18646-2018）進行。

1.2.1.2 試管凝集試驗

對全部樣品進行RBT 檢測，采用常量法與微量法兩種不同的檢測方法，操作與結果判定按照《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T18646-2018）進行。

1.2.1.3 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗

對全部樣品用cELISA 方法檢測，具體步驟按說明書進行。

1.2.1.4 布魯氏菌抗體定量檢測試紙條檢測

對全部樣品采用GICA 檢測，根據(jù)其各自說明書進行操作和結果判定。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析與處理

檢測數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。采用假陽性率、假陰性率、一致率和Kappa 值4 種分析指標。

假陽性率：即確證陰性中檢測結果為陽性的占比。

假陰性率：即確診陽性中檢測結果為陰性的占比。

一致率：試驗判定結果與標準診斷結果相同數(shù)占總檢測數(shù)的比例。

符合程度依據(jù)一致性檢驗結果（Kappa 值）判定。相關參考文獻顯示：若0.81≤Kappa 值≤1.0，說明兩種方法的診斷結果一致程度為極高；若0.61≤Kappa 值＜0.81，說明兩種方法的診斷結果一致程度為高；若0.41≤Kappa 值＜0.61，說明兩種方法的診斷結果一致性一般；若0.21≤Kappa 值＜0.41，說明兩種方法的診斷結果一致性較差；若Kappa 值＜0.21，說明兩種方法的診斷結果不一致[7]。

2 結果

2.1 RBT、SAT、cELISA 與GICA 血清學檢測結果

應用RBT、SAT、cELISA 與GICA 分別對87 份已知感染情況的羊血清樣品（53 份陽性、34 份陰性）進行檢測，檢測結果（表1）顯示，經RBT 檢測，陽性樣本數(shù)量為54 份，陰性樣本數(shù)量為33 份；經SAT（常量法）檢測，陽性樣本數(shù)量為50 份，陰性樣本數(shù)量為37 份；經SAT（微量法）檢測，陽性樣本數(shù)量為51 份，陰性樣本數(shù)量為36 份；經cELISA 檢測，陽性樣本數(shù)量為50 份，陰性樣本數(shù)量為37 份；經GICA 檢測，陽性樣本數(shù)量為55 份，陰性樣本數(shù)量為32 份。

表1 RBT、SAT、cELISA 與GICA 血清學檢測結果

2.2 RBT、SAT、cELISA 與GICA 的敏感性、特異性與一致性的比較

由表2 可知，RBT 的敏感性、特異性分別為90.57%、82.35%；SAT（常量法）的敏感性、特異性分別為92.45%、97.06%；SAT（微量法）的敏感性、特異性分別為96.23%、100%；cELISA 的敏感性、特異性分別為94.34%、100%；GICA的敏感性、特異性分別為94.34%、95.29%。其中RBT 的敏感性與特異性都比較差，SAT 與cELISA 的敏感性、特異性相對更優(yōu)，同樣作為初篩方法的GICA 敏感性與特異性都比RBT更加優(yōu)良。

表2 RBT、SAT、cELISA 與GICA 血清學檢測結果比較

假陽性與假陰性方面，RBT 的假陰性率與假陽性率都相對較高，分別為17.65%、9.43%；GICA 的假陽性率偏高；相較而言，SAT（常量法）、SAT（微量法）與cELISA 的準確性與一致性更好。

經Kappa 檢驗可以看出，RBT 與GICA 的Kappa 值均小于0.81，與真實結果一致程度為高；而SAT 與cELISA 的Kappa值均大于0.81，與真實結果一致程度為極高。

3 結論與討論

從上述結果可以發(fā)現(xiàn)，RBT 的敏感性與特異性都相對較低，相關研究也表明，RBT 會因為疫苗免疫或交叉反應等因素而產生假陽性結果，同時亦會因前帶現(xiàn)象而產生假陰性[8]，但由于其操作簡便，所需實驗設備較少而被廣泛應用于布病的初篩檢測中[9]。需要注意的是，應用RBT 對臨床樣本檢測時，由于各廠家生產的平板凝集抗原滴度不同，針對某些弱陽性樣本，可能會產生不同的檢測結果。為消除RBT 檢測方法的缺陷，在實際工作中推薦選用SAT 與ELISA 方法中的一種或多種進行復核檢測，以確保檢測結果的準確性。

免疫膠體金檢測技術是基于抗原抗體檢測的一種新型免疫標記技術，在生物醫(yī)學的各領域得到廣泛應用[10]。通過本研究可以看出，與RBT 相比，GICA 的敏感性更好，但特異性較為一般。在實驗操作與檢測結果判定過程中，受主觀因素與外界環(huán)境因素的影響更少，具有檢測敏感性更高，所需血清量更少，檢測樣本類型更多樣等優(yōu)點[11]。因此，GICA 比RBT 更適合未來布病初篩實驗。

《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T18646-2018）新增加了SAT（微量法）作為布病血清學檢測確診方法，從試驗結果中可以看出，SAT 的敏感性較低，但特異性較高，適合在陽性樣本復核及布病凈化監(jiān)測等情況下選用。同時，在實際操作中發(fā)現(xiàn)，微量法所需試劑耗材較少，可以在96 孔稀釋板上進行操作，與常量法相比，更加適合大量的臨床樣本確認工作。在結果判定時，微量法將孔底凝集情況作為判定標準，比常量法更加易于實驗員觀察判定。

cELISA 于2018 年被納入我國布病法定檢測方法，該檢測方法的敏感性、特異性及與正確結果一致性都比較優(yōu)良，具有操作簡便、判定標準準確、重復性好、單次試驗可完成大量樣本等優(yōu)點[12]。在臨床樣本檢測過程中，cELISA 的檢測結果更加穩(wěn)定可靠[13]。但因各廠家檢測試劑的試驗靈敏度與閾值線的設定各不相同，不同品牌檢測試劑的檢測結果無法直接進行參考比較，因此，在臨床診斷中，需結合動物臨床癥狀進行科學判定為宜。

在布魯氏菌病防控工作中，實驗室的檢測結果可作為臨床診斷與疫病凈化消除的參考依據(jù)。檢測方法的敏感性越高，對識別陽性動物越有利，特異性越高，可有效減少我們對疫病的誤診，從而進一步降低凈化與撲殺過程中的成本。而當檢測方法的檢測性能較差時往往會導致疫病誤診與漏診，對研判疫情存在狀況與維護公共衛(wèi)生安全等工作產生各種不利影響。從上述檢測結果中不難發(fā)現(xiàn)，若僅選用某種血清學檢測方法，很容易導致誤診或漏診。因此，在布病臨床診斷與疫病凈化過程中，要合理選擇聯(lián)用不同的檢測方法，根據(jù)當?shù)匾卟×餍星闆r，采用垂直試驗或平行試驗進一步提高試驗結果的準確性。

近年來，安徽省人布病病例數(shù)與動物布病抗體檢測陽性數(shù)日益增加，《國家動物疫病強制免疫指導意見（2022-2025年）》（農牧發(fā)〔2022〕 1 號）中要求各地根據(jù)評估情況以縣為單位確定本省份的布病免疫區(qū)，各場戶可根據(jù)實際需要進行備案，采取布病疫苗免疫。種種跡象表明，未來布病診斷工作面臨著更加復雜多變的形勢與挑戰(zhàn)。血清學檢測方法存在的一個共性問題是無法有效鑒別感染抗體與免疫抗體。因此，在布病控制與凈化工作中，既要科學選用血清學檢測方法，也應結合動物臨床癥狀及免疫情況，考慮使用病原學檢測方法進行進一步的判定。