范景如 張?zhí)K偉 趙傳偉 王曉莉 陳子清 林振素 郭舜奇

（汕頭市中心醫(yī)院，廣東 汕頭 515041）

微粒（Microparticle，MP）是從細(xì)胞膜出芽式產(chǎn)生的直徑約0.4-1μm 小囊泡，表面攜帶大量受體，內(nèi)含有蛋白、mRNA、microRNA 等。血循環(huán)中白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等均可產(chǎn)生微粒，最多是血小板微粒（Platelet Microparticle，PMP），參與了血液中炎癥、免疫反應(yīng)、血管生成等病理生理過程[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血管穩(wěn)定重要部分，動脈硬化的始動環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞損傷與功能失調(diào)，而高血壓導(dǎo)致心、腦、腎的損傷的病理生理過程均有動脈硬化，基于血壓所致動脈硬化早期為血管內(nèi)皮損傷，從而處于易形成血栓的狀態(tài)，從而促進血小板產(chǎn)生更多的PMP，而PMP 促凝血活性是50-100 倍于血小板，加劇發(fā)生血栓事件；另PMP 強烈的促凝作用、傳遞生物因子并參與免疫炎癥反應(yīng)。已有研究證實PMP 在急性冠脈綜合患者高于穩(wěn)定性心絞痛，而后者高于健康人[2]，有研究發(fā)現(xiàn)在重度高血壓升高，且PMP 水平與血壓嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示PMP 在高血壓疾病發(fā)生發(fā)展中有重要地位，是高血壓相關(guān)血栓事件的重要預(yù)測指標(biāo)[3]。人體存在血壓晝夜節(jié)律（Blood Pressure Circadian Rhythm，BPCR），它是通過 24h 動態(tài)血壓監(jiān)測（Ambulatory Blood-pressure Monitoring，ABPM）檢測的，可更全面地反映一天血壓的整體變化情況及變異性。并被多個指南推薦為評價高血壓患者降壓達(dá)標(biāo)的重要檢查手段，所測量的結(jié)果作為高血壓診治及評估預(yù)后的重要依據(jù)[4-6]。BPCR 消失是高血壓對血栓性事件等急性心腦血管事件甚至死亡存在獨立預(yù)測價值[7,8]。PMP 與血栓事件密切相關(guān)，本文指通過研究高血壓患者不同晝夜節(jié)律患者血循環(huán)中PMP 的變化，探討PMP 與高血壓患者BPCR消失的相關(guān)性。為高血壓病相關(guān)血栓性事件研究提供初步理論探索，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

入組2018年3月至2020年9月期間于我院高血壓門診并住院的高血壓患者，年齡在30-75 歲。按照《中國高血壓防治指南2018》高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)收錄患者：收縮壓≥140mmHg 和/或舒張壓≥90mmHg；且尚未服降壓藥或至少入組前2 周內(nèi)未服過任何降壓藥[6]；住院后完成ABPM 檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：肺動脈高壓、糖尿病、腦血管意外或心肌病、嚴(yán)重心律失常、嚴(yán)重心力衰竭、嚴(yán)重的心臟瓣膜疾病、急性心肌梗死等心血管疾病、近期急性或慢性炎癥或手術(shù)史、惡性腫瘤或自身免疫性疾病、外周血管疾病或嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重的肝、腎功能不全或甲狀腺功能異常、存在嗜酒、睡眠倒錯者、服用抗生素、抗血小板藥或調(diào)脂藥者。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審核通過（審批號：2019-科研（073）號），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方 法

1.2.1 一般資料收集 記錄入組者的性別、年齡、身高、體重、吸煙史、酗酒史、高血壓病程，既往病史、過敏史、手術(shù)史、及藥物使用情況，第二天清晨7 時空腹抽靜脈血。送醫(yī)院檢測，同時留取外周血3mL/例。

1.2.2 動態(tài)血壓檢查 ABPM 儀器采用無創(chuàng)型攜帶動態(tài)血壓檢測儀（美國SunTech 醫(yī)療公司，Oscar 2系列動態(tài)血壓儀）。記錄血壓相關(guān)參數(shù)。

1.2.3 動態(tài)血壓診斷高血壓的標(biāo)準(zhǔn)和分級標(biāo)準(zhǔn) 動態(tài)血壓診斷高血壓的標(biāo)準(zhǔn)：動態(tài)血壓白天平均值≥135/85mmHg，或 24h 平均值≥130/80mmHg，或夜間平均值≥120/70mmHg。以24h 血壓平均值標(biāo)準(zhǔn)進行分級：1 級高血壓：130/80-145/90mmHg；2 級高血壓 ：145/90 -160/100mmHg；3 級 高 血 壓 >160/100mmHg。如果收縮壓與舒張壓出現(xiàn)不同結(jié)果，以高一級為最終分級[6,9,10]；另部分診室血壓初步診斷為高血壓，動態(tài)血壓檢查又未達(dá)到以動態(tài)血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，列入白大衣高血壓組。

1.2.4 高血壓病患者晝夜節(jié)律模式分組標(biāo)準(zhǔn) 動態(tài)血壓晝夜節(jié)律（NBPDR）=（白天平均血壓-夜間平均血壓）/白天血壓平均值×100%。正常NBPDR 通常為10%-20%，高血壓患者部分血壓節(jié)律消失，即≤10%；NBPDR≤0%為反杓型，≥20%為超杓型，據(jù)我院既往數(shù)據(jù)統(tǒng)計，這兩類患者所占數(shù)量太少，反杓型歸入非杓型組，超杓型歸入杓型組，為據(jù)此我們分為：非杓型組（0%-10%，≤0%）、杓型組（10%-20%，≥20%）[6,9,10]。

1.2.5 血漿PMP 水平的檢測 （1）采集入組者3mL外周血，4h 內(nèi)提取血小板貧瘠血漿：于室溫下1500g離心10min，去除血細(xì)胞，獲得富含血小板血漿，移1.5mL 入 EP 管中，然后 13000g, 4℃，離心 10min，去除血小板，獲得貧瘠血小板血漿，保存于1.5mL LEP管中，-20℃保存；（2）樣本足夠后，取出后一次性凍融后（一次凍融不影PMP 的測定），從每樣本中取50μL，加入 20μL 特異性熒光抗體（anti-CD41-FITC）。另取50μL 加入同等數(shù)量的同型抗體（IgG1-FITC），室溫下避光孵育 30min；（3）取直徑為 1.0μm的2-氨基乙基化聚苯乙烯微球，溶于1mL 的雙蒸水中，在振蕩器上混勻后，作為內(nèi)參來確定所要檢測內(nèi)皮微粒的大??；（4）孵育30min 后，各管加入1mL的鞘液，后上流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter epics XL，單激光四色，美國）測定：前向角FS 及側(cè)向角SS取對數(shù)Log 放大，1.0μm 的標(biāo)準(zhǔn)微球位于FS/SS 散點圖右上方（見圖1），固在散點圖中集中區(qū)域左下側(cè)圈門來確定微泡的大小（均≤1.0μm），然后進行特異性熒光抗體表達(dá)分析，兩色法定義：PMP<1.0μm 且CD41+，根據(jù)絕對計數(shù)微球的濃度換算得出血漿中PMP 濃度。

圖1 流式細(xì)胞圖

1.3 觀察指標(biāo)

（1）一般資料：性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、低密度膽固醇膽固醇（LDL-C）、糖化血紅蛋白（HbA1C）、 C 反應(yīng)蛋白（CRP）、同型半胱氨酸（HCY）及尿酸（UA）。

（2）動態(tài)血壓檢查參數(shù)：24h 平均動脈壓（24 hour mean arterial Blood pressure,24hMABP）、24h 平均脈壓差（24 hour mean pulse pressure,24hMPP）、24h 平均收縮壓（24 hour Mean Systolic Blood Pressure,24hMSBP）、24h 平均舒張壓（24 hour Mean Diastolic Blood Pressure,24hMDBP）、白天平均收縮壓（Daytime Mean Systolic Blood Pressure,dMSBP）、白天平均舒張壓（Daytime Mean Diastolic Blood Pressure,dMDBP）、夜間平均收縮壓（Nighttime Mean Systolic Blood Pressure,nMSBP）、夜間平均舒 張 壓 （Nighttime Mean Diastolic Blood Pressure, nMDBP）、夜間血壓下降率(nighttime blood pressure decrease rate,NBPDR)=（白天血壓平均值-夜間血壓平均值）/白天血壓平均值×100%。

（3）血漿 PMP 的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗, 多組間均數(shù)比較方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗，并利用Tukey HSD 事后多重比較進行兩兩比較。定性資料用頻率表示，組間比較采用卡方檢驗。相關(guān)性分析采用秩相關(guān)進行相關(guān)性分析，回歸分析采用線性回歸分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例收集基本情況

本研究共232例，其中有24例為白大衣高血壓組。其余符合高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)且暫未治療的患者共208例，其中男 97例（46.6%），女性 111例（53.4%）（女性中：絕經(jīng)前 28例、絕經(jīng)后 83例）；吸煙 76例（36.5%），無吸煙 132例（63.4%）；平均年齡（56.0±10.9）歲，年齡最小31 歲，最大75 歲。按動態(tài)血壓分級標(biāo)準(zhǔn)：高血壓 1 級 101例，2 級 45例，3 級 62例。白大衣性高血壓、高血壓1、2、3 級組患者一般資料及動態(tài)血壓參數(shù)見表1。一般資料中4 組間除年齡、LDL-C 差異有統(tǒng)計學(xué)意義外，其余指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。動態(tài)血壓參數(shù)中4 組間均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

存在統(tǒng)計學(xué)差異的各項目中，再進行兩兩比較中：在年齡中：1 級組高于余各組；在 LDL-C 中：3 級組低于1 級組或2 級組；在動態(tài)血壓參數(shù)中：白大衣高血壓組與1 級組中的24h 舒張壓、白天舒張壓、夜間舒張壓不存在統(tǒng)計學(xué)差異；NBPDR3 級組低于白大衣或1 級組（見表1）。

表1 白大衣高血壓及不同高血壓級別一般情況及動態(tài)血壓參數(shù)的比較

2.2 不同級別高血壓分級的PMP 水平比較

2.2.1 以動態(tài)血壓作為高血壓的分級標(biāo)準(zhǔn) 白大衣高血壓組、1 級高血壓組、2 級高血壓組、3 級高血壓組 PMP 水平分別為（1657.14±461.36）、（2087.93±669.18）、（2361.54 ±1131.03）、（2888.89 ±740.34）個/μL。存在組間差異（F=32.796，P<0.001）,進行兩兩比較中：2 級高血壓組PMP 水平與1 級高血壓組不存在統(tǒng)計學(xué)差異，余各組的兩兩比較差異均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），見表2。

表2 不同高血壓級別PMP 水平（個/μL）及比較

2.2.2 以診室血壓作為高血壓的分級標(biāo)準(zhǔn) 1 級高血壓組、2 級高血壓組、3 級高血壓組PMP 平均水平分別為（n=135，2075.71±723.79）、（n=70，2816.67±962.38）、（n=27，2387.50±866.94）個/μL。僅 2 級高血壓組PMP 水平高于1 級高血壓組，余各組的兩兩比較差異均不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

2.3 高血壓患者不同血壓晝夜節(jié)律模式分組的PMP 比較

高血壓患者血壓杓型組與非杓型組的糖化血紅蛋白、夜間平均收縮壓、NBPDR 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。非杓型組PMP 水平高于杓型組，見表3。

表3 高血壓病患者血壓杓型組與非杓型組的基本資料及PMP 的比較

2.4 不同高血壓分級、不同血壓晝夜模式患者PMP 的比較

在動態(tài)高血壓分級后，再不同血壓晝夜模式的比較，不同級別高血壓患者的PMP 水平（個/μL）在血壓杓型組與非杓型組均存在統(tǒng)計學(xué)差異，見表4。

表4 不同級別高血壓病患者血壓杓型組與非杓型組的PMP 水平的比較

2.5 相關(guān)性和回歸分析

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高血壓患者NBPDR 與PMP 水平（個/μL）均存在負(fù)相關(guān)性（r=-0.661，P<0.001）。在線性回歸的的模型建立中，PMP 為因變量，性別、年齡、BMI、TG、LDL-C、HbA1C、CRP、UA、HCY、OSBP、ODBP、24hMABP、24hMPP、24hMSBP、24hMDBP、dMSBP、dMDBP、nMSBP、nMDBP、NBPDR為自變量。建立的標(biāo)準(zhǔn)化線性回歸方程為：PMP=0.176BMI+0.382OSBP-0.646NBPDR。這說明OSBP、BMI 及NBPDR 是高血壓患者PMP 水平的影響因素，其中NBPDR 的影響程度最大。

3 討 論

Wolf P 等于 1967年發(fā)現(xiàn)了 PMP 的存在，James E. Rothman 等三位科學(xué)家發(fā)現(xiàn)其運行及調(diào)節(jié)的機制，并因此獲得了諾貝爾獎，PMP 釋放量與血壓升高的剪切應(yīng)力持續(xù)激活血小板持續(xù)的時間成正比[11]，在血管內(nèi)皮損傷方面，有動物研究報道大鼠血循環(huán)中的PMP 水平升高與內(nèi)皮細(xì)胞中的一氧化氮水平成反比，進而增加了內(nèi)皮通透性[12]，加速了脂質(zhì)沉積于內(nèi)皮細(xì)胞的速度；另有研究發(fā)現(xiàn)PMP 進入內(nèi)皮細(xì)胞后，導(dǎo)致了白介素6 及腫瘤壞死因子等炎癥因子及細(xì)胞間黏附分子、活性氧水平升高，并提示PMP 導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的途徑存在線粒體凋亡機制[13]。

在PMP 另參與了動脈硬化的炎癥反應(yīng)，其所含的血小板炎癥因子P 選擇素、趨化因子，具有促進白細(xì)胞及單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮下，加劇炎癥反應(yīng)，同時能使硬化斑塊中的平滑肌細(xì)胞從梭形向菱形轉(zhuǎn)化，減弱收縮性能，說明PMP 導(dǎo)致了平滑肌細(xì)胞的炎性表型的變異，加速了動脈硬化。另有動物研究發(fā)現(xiàn)PMP 中的主要脂質(zhì)為溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC），后者與動脈硬化的斑塊不穩(wěn)定直接相關(guān)，并提示血漿PMP 可作為斑塊不穩(wěn)定的血液學(xué)標(biāo)志，也提示PMP 與高血壓患者相關(guān)血栓事件風(fēng)險密切相關(guān)[14,15]，有新近研究提示PMP傳遞miR-126-3P 進入巨噬細(xì)胞從而增強其吞噬脂質(zhì)的能力加重動脈硬化[16]。有動物高血壓的研究提示PMP 通過遞送miR-142-3p 進入血管內(nèi)皮細(xì)胞，加速了血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)亡[17]，這些研究均提示PMP 的升高加劇了血管內(nèi)皮損傷、動脈硬化，血栓風(fēng)險增加，而本研究中3 級高血壓病患者的CD41+PMP 明顯升高，可能提示其實動脈硬化程度嚴(yán)重，且CD41+PMP 可能參與了高血壓的動脈硬化。

血壓晝夜節(jié)律消失即為非杓型血壓或夜間高血壓，有調(diào)查顯示高血壓患者中約52%的節(jié)律消失，這一比例與本研究的結(jié)果相近[18]。夜間睡眠占24h節(jié)律的約三分之一時間，這時血壓也隨之下降，是人體心、腦、腎等重要器官恢復(fù)和血管內(nèi)皮修復(fù)的重要時間段，這時如果血壓異常升高，對血管的側(cè)壓強異常增加，損傷血管，引發(fā)或加重動脈硬化，且會造成心、腦、腎等重要器官在夜間仍處于超負(fù)荷運轉(zhuǎn)中，最終首先導(dǎo)致了這些靶器官的損害，長期持續(xù)存在時導(dǎo)致進行加重的器官損傷[19]。持續(xù)的夜間高血壓是一個更加“隱匿的殺手”，更提示高血壓的嚴(yán)重程度，對其發(fā)生心腦血管事件的獨立預(yù)測價值[7,8]。這說明非杓型高血壓患者心腦血管事件發(fā)生率上升，而已有多個研究報道了血漿PMP 水平與動脈硬化嚴(yán)重程度嚴(yán)重相關(guān)[2,3]。其中，也有另外研究利用不同PMP 的不同表型（如 CD31+/CD42b+或 CD62P），發(fā)現(xiàn)CD62P 的血小板微粒在高血壓患者中明顯升高[3,20]。國內(nèi)有報道了CD31+/CD42b+的PMP 在高血壓患者是中伴肥胖癥者明顯高于不肥胖者，并與血HDL-C存在密切相關(guān)，提示PMP 可能是高血壓伴肥胖的標(biāo)記物[21]。Alexandru N 等報道了血漿PMP 在高膽固醇的高血壓患者升高，并提示其機制可能是這類患者動脈硬化的重要機制之一[22]。本研究中的結(jié)果中，診室血壓、體重指數(shù)及夜間血壓下降率是預(yù)測高血壓病患者PMP（CD41+）水平的獨立預(yù)測因子，說明三者與PMP 存在相關(guān)，與上面研究結(jié)果一致。另發(fā)現(xiàn)NBPDR 的預(yù)測強度最大。說明PMP 可能也是夜間高血壓所致動脈硬化的重要的發(fā)病機制之一。在PMP 的生物學(xué)作用中，除了同樣有大量粘附分子和生物學(xué)作用外，其和血小板直接進入動脈的中層彈性結(jié)構(gòu)后，在動脈硬化中和脂質(zhì)、復(fù)合糖類一同積聚，形成微小血栓形或微出血灶，導(dǎo)致了血管內(nèi)皮系統(tǒng)中舒張血管、抗血栓形成、相關(guān)抗病原等特性的減弱，進而介導(dǎo)表層纖維組織增生及鈣質(zhì)沉積，使纖維帽形成，動脈彈性層逐漸鈣化而血管失去彈性。

綜上所述，降壓達(dá)標(biāo)同時應(yīng)該維持血壓晝夜節(jié)律，達(dá)到真正的降壓達(dá)標(biāo)。另高血壓患者的動脈硬化的一預(yù)防治療即抗血小板的治療的起動時機是目前常用的以10年心血管風(fēng)險評分作為標(biāo)準(zhǔn)[6]。目前有多個基礎(chǔ)及臨床研究提示抗血小板藥物可降低PMP 的水平[23-24]，更有研究提示PMP 能預(yù)測腦卒中的發(fā)生[25]。更說明PMP 為高血壓患者動脈硬化進程的重要參與者，可能是預(yù)測高血壓患者的嚴(yán)重程度，特別是血栓形成風(fēng)險的一個重要預(yù)測指標(biāo)，或可作為高血壓患者起用抗血小板治療時機及評價治療效果的潛在標(biāo)記物。結(jié)合本研究結(jié)果，3 級高血壓及非杓型高血壓患者的PMP 水平更應(yīng)得到注意，以降低其血漿PMP 水平作為降壓綜合治療的其中一個靶點。因此探討PMP 在高血壓的嚴(yán)重程度評估、抗血小板治療及預(yù)防血栓形成的作用具有積極的意義，能做到更好、更全面地防治高血壓，保護心、腦、腎等靶器官，更早預(yù)防嚴(yán)重血栓事件的發(fā)生。