劉 瑞, 于文庚, 胡順鑫, 尚 帥*

(1.濱州學(xué)院, 山東 濱州 256600；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院, 山東 煙臺(tái) 264001)

植物葉際微生物群落中含有豐富的細(xì)菌、真菌和病毒，葉際微生物具有多種功能，如固氮[1-3]、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4-5]、抑制病原微生物[5]、降解環(huán)境污染物[6]等。植物葉際微生物群落的多樣性、擴(kuò)散性和群落發(fā)育與寄主植物的生理生化、生活環(huán)境和免疫力有關(guān)[7]。

白蠟(Fraxinuschinensis)作為重要的耐鹽堿植物，雌雄異株，廣泛分布于黃河三角洲區(qū)域，其樹(shù)干挺拔直立，外形美觀，樹(shù)皮也可以作為藥用，是重要的景觀植物。然而在雌雄異株植物的研究進(jìn)展中，對(duì)于白蠟雌雄株的葉際微生物菌群的研究很缺乏。漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程導(dǎo)致雌雄植株在諸多方面表現(xiàn)出顯著差異。因此，本研究分析白蠟雌雄植株微生物組成差異的影響因素，能夠更好地了解雌雄株的適應(yīng)特性與差異。

1 材料與方法

1.1 葉片采集

采樣點(diǎn)位于黃河三角洲區(qū)域(北緯37°22′、東經(jīng)118°02′)，該地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候，全年平均氣溫12.9 ℃，年降水量632 mm，土地為鹽堿地。分別取4棵不同的雌性(BC1～BX4)和雄性白蠟樹(shù)(BX1～BC4)，選擇枝葉繁盛，無(wú)病蟲(chóng)害，樹(shù)齡3年以上的白蠟雌雄植株。樹(shù)的性別根據(jù)有無(wú)種子辨別，采樣時(shí)戴上無(wú)菌手套平均采摘(東南、西南、東北)枝干上的完整嫩綠的、無(wú)病蟲(chóng)害斑點(diǎn)的葉片共50～100 g。將摘取的樣品放入無(wú)菌封口袋中，液氮保存，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。

1.2 葉片微生物DNA提取及微生物分析

稱取白蠟雌雄株葉片樣品3 g，剪碎放入滅菌的錐形瓶中，加入1∶20(葉重/體積TE緩沖液=1∶20)無(wú)菌TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH為8.0)，用滅菌膜封口在室溫條件下200 r/min的搖床上振蕩30 min，分離微生物，振蕩后的葉片在40 kHz超聲15 min，在無(wú)菌環(huán)境中使用真空抽濾設(shè)備將振蕩液中的微生物收集到0.22 μm的滅菌的濾膜上，使用試劑盒提取濾膜上的總DNA[7]?；?6S rDNA基因的V3～V4區(qū)，利用高通量測(cè)序儀對(duì)白蠟雌雄株樣品的細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果和分析

2.1 樣品稀釋曲線

由圖1可知，8個(gè)樣本序列數(shù)目均在10 000之后趨于平緩，表明測(cè)序結(jié)果具有合理性，本研究所獲取的測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可信。

圖1 樣品的稀疏曲線

2.2 白蠟雌雄葉際菌群alpha多樣性分析

alpha多樣性指數(shù)用來(lái)反映雌雄白蠟葉際微生物群落多樣性，分別采用Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、Goods-coverage 5種指數(shù)來(lái)描述(表1)。雌雄白蠟alpha多樣性的coverage指數(shù)均為1，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)的多樣性分析，雌株葉際細(xì)菌群落的observed-otus指數(shù)大于雄株細(xì)菌菌群；另外，雌株葉際細(xì)菌的Shannon指數(shù)(表示群落多樣性，其數(shù)值與多樣性成正比)明顯高于雄株細(xì)菌菌群。結(jié)果表明，白蠟雌株葉際細(xì)菌菌群在物種數(shù)目和群落結(jié)構(gòu)多樣性上遠(yuǎn)高于白蠟雄株葉際細(xì)菌菌群。

表1 樣本多樣性指數(shù)

2.3 雌雄白蠟葉際菌群結(jié)構(gòu)組成

通過(guò)韋恩圖直觀展示各分組特有及共有的otu數(shù)目，以此來(lái)分析雌雄白蠟樣品間的相似性。由圖2顯示，白蠟雌株葉片特有otu為901個(gè)，白蠟雄株特有otu為680個(gè)，白蠟雌雄葉片共有otu為251個(gè)。雌雄白蠟葉際菌群組成存在差異，白蠟雌株葉際特有菌群多于白蠟雄株。

圖2 雌雄白蠟葉際菌群韋恩圖

由圖3顯示，白蠟葉際細(xì)菌屬于13門，18綱，30目，40科，67屬。在門水平上，白蠟雌株葉際優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)藻菌門(72.38%)，變形菌門(17.10%)，棲熱菌門(4.57%)，放線菌門(2.53%)，擬桿菌門(2.07%)；白蠟雄株葉際優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)藻菌門(84.06%)，變形菌門(10.30%)，放線菌門(1.53%)，擬桿菌門(1.52%)，棲熱菌門(1.38%)。

圖3 雌雄白蠟葉際菌門組成

在屬水平上，白蠟雌株葉際優(yōu)勢(shì)菌群為生氧光細(xì)菌、異常球菌屬、鞘氨醇單胞菌、甲基桿菌屬等；白蠟雄株的主要菌屬為生氧光細(xì)菌、鞘氨醇單胞菌和薄層菌屬等(圖4)。

圖4 雌雄白蠟葉際菌屬組成

3 結(jié)論與討論

葉際微生物廣泛分布于各類植物中，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝活動(dòng)，植物為葉際微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與生存空間，葉際微生物與植物相互影響，并處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中。隨著葉際微生物組研究的不斷深入，植物與葉際微生物間的研究也越來(lái)越多。葉際環(huán)境作為特殊的生境，具有很大的不穩(wěn)定性，存活于葉際的微生物面臨水分匱乏、營(yíng)養(yǎng)缺乏及強(qiáng)光、高溫和紫外線的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，白蠟雌雄株葉片雖然都具有一定數(shù)量的特有otu，但存在251個(gè)共有otu，表明白蠟雌雄株葉片既存在差異，又有共性。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，葉際優(yōu)勢(shì)菌群主要包括變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門[8-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，白蠟葉際細(xì)菌中藍(lán)藻菌門占優(yōu)勢(shì)，其次是變形菌門，放線菌門和擬桿菌門。藍(lán)藻菌門可以通過(guò)氮?dú)獾墓潭▉?lái)提高稻田和其他土壤的肥力，在水體進(jìn)化中也起到積極的作用。因此葉片中的藍(lán)藻菌門能夠產(chǎn)生氧氣，凈化空氣和固氮的作用，能夠促進(jìn)白蠟的生長(zhǎng)。

白蠟雌雄株葉際微生物群落的多樣性指數(shù)存在一定的差異，白蠟雌株菌群結(jié)構(gòu)多樣性高于白蠟雄株葉際菌群。此外，白蠟雌雄株葉際微生物在門水平差異不大，在屬水平存在顯著差異。通過(guò)比較白蠟雌雄株菌群發(fā)現(xiàn)，殺雄菌屬(0.18%)為雌株特有，前人研究發(fā)現(xiàn)殺雄菌屬共生菌廣泛分布于節(jié)肢動(dòng)物中，能夠殺死寄主的雄性胚胎，具有改變白蠟蟲(chóng)后代雌雄比例的作用[12]，推測(cè)白蠟雌株葉片對(duì)于白蠟蟲(chóng)具有一定的防御能力。