張言慧，淵辛華，高先嶺，袁建國*，吉武科，王丹華，邵寶凱

1(山東國力生物技術(shù)研究院，山東 濟(jì)南，250101)2(山東國力生物科技有限公司，山東 濟(jì)南，250014)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，主要存在于腦和骨髓中[1]。GABA是由谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)不可逆催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)生成的[2]。GABA具有多種生理功能，能夠改善睡眠和治療抑郁[3]、增強(qiáng)免疫力[4]、降低血壓[5]、提高視覺皮層功能[6]、抵制肥胖[7]、減輕焦慮和更年期綜合癥[8]以及治療癲癇病[9]等。

目前制備GABA的方法有化學(xué)合成法、植物富集法、微生物發(fā)酵法及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法等。利用化學(xué)合成法生產(chǎn)GABA安全性較差，有化學(xué)殘留，不易達(dá)到醫(yī)藥及食品行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)[10]；植物富集法雖然安全性好，但制得的GABA濃度太低，無法用作醫(yī)藥、食品添加劑[11]；微生物發(fā)酵法具有成本低的優(yōu)點(diǎn)，但得到的GABA是一個(gè)多相的復(fù)雜體系，濃度低，下游分離成本高，是生產(chǎn)高純度、高濃度GABA的一個(gè)瓶頸問題；全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法則克服了微生物發(fā)酵法分離提純困難的缺點(diǎn)，具有產(chǎn)品濃度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

乳酸菌已廣泛用于食品行業(yè)，被公認(rèn)為是安全的(General Recognized As Safe, GRAS)食品級微生物[8]。中國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)已批準(zhǔn)短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)與希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)發(fā)酵制備的GABA為新食品原料。CATALDO等[12]采用LactobacillusbrevisCRL 2013制備GABA，產(chǎn)量達(dá)到265 mmol/L(27.3 g/L)；LYU等[13]采用Lactobacillusbrevis9530工程菌發(fā)酵制備GABA，最高產(chǎn)量達(dá)到104.38 g/L。孫麗慧等[14]以LactobacillusbrevisDLF-19076為發(fā)酵菌株，采用全細(xì)胞催化工藝使得GABA產(chǎn)量達(dá)到85.71 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為87.84%。本研究采用短乳桿菌GLB-127發(fā)酵制備GAD，利用短乳桿菌全細(xì)胞催化L-Glu制備GABA。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)GLB-127，革蘭氏陽性菌，為本實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0(單獨(dú)滅菌)，蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，K2HPO42.0，檸檬酸氫二銨2.0，乙酸鈉5.0，MgSO40.2，MnSO40.04，吐溫-80 1.0。pH 5.6，121 ℃滅菌15 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0(單獨(dú)滅菌)，蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，L-谷氨酸鈉10.0，K2HPO42.0，檸檬酸氫二銨2.0，乙酸鈉5.0，MgSO40.2，MnSO40.04，吐溫-80 1.0。pH 5.6，121 ℃滅菌15 min。

優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[15-16]:葡萄糖20.0(單獨(dú)滅菌)，蛋白胨10.0，玉米漿干粉15.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，L-谷氨酸鈉25.0，K2HPO42.0，檸檬酸氫二銨2.0，乙酸鈉5.0，MgSO41.0，MnSO40.04，吐溫-80 1.0。pH 5.6，121 ℃滅菌15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 短乳桿菌的分子鑒定

1.2.1.1 基因組DNA的提取[17]

將原始菌接種于液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后利用TIANGEN DNA KIT提取原始菌基因組DNA。

1.2.1.2 PCR擴(kuò)增

吸入適量基因組DNA，Taq酶，dNTPs及16S引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。引物序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′。引物由通用生物合成。

1.2.1.3 PCR產(chǎn)物電泳檢測及測序

待PCR擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。使用Axygen凝膠回收試劑盒回收所需PCR產(chǎn)物片段，采用3730XL測序儀進(jìn)行測序?qū)嶒?yàn)。

1.2.2 掃描電鏡制樣方法

采用德國蔡司公司的熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。將短乳桿菌濕菌體用2.5%戊二醛在4 ℃固定4 h。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2遍。最后采用乙醇梯度脫水，噴金觀測[18]。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序所得16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST，根據(jù)序列同源性，選取不同模式菌株，采用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株種屬關(guān)系[19]。

1.2.4 培養(yǎng)方法

1.2.4.1 靜置培養(yǎng)

將種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶，將發(fā)酵搖瓶在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。

1.2.4.2 搖床培養(yǎng)

將種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶，將發(fā)酵搖瓶在30 ℃搖床中以不同轉(zhuǎn)速培養(yǎng)一定時(shí)間。

1.2.4.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)

采用上海保興BIOTECH-10BGZ發(fā)酵罐進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，碳源為葡萄糖，氮源為氨水，補(bǔ)料碳源與氮源根據(jù)pH變化由蠕動(dòng)泵自動(dòng)補(bǔ)入。

1.2.5 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法

初始轉(zhuǎn)化體系組成為70.0 g/L的L-Glu，4.9 g/L MgSO4，1.0 g/L磷酸吡哆醛，全細(xì)胞催化酶質(zhì)量濃度為25.0 g/L。

1.2.6 檢測方法

1.2.6.1 菌體濃度[16]

取一定量的發(fā)酵液用純化水稀釋一定的倍數(shù)，用UV-1200分光光度計(jì)在600 nm下測定吸光值，計(jì)算得OD600。取一定體積發(fā)酵液離心去上清液稱量，計(jì)算得菌體濕重。

1.2.6.2 GABA與L-Glu

采用島津LC-20ADXR高效液相色譜儀測定，色譜柱為Inertsil ODS-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長為210 nm；流動(dòng)相為0.1%高氯酸與乙腈以體積比9∶1混合，pH 3.0；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；分析時(shí)間為12 min。GABA與L-Glu混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜檢測圖見圖1。

圖1 GABA與L-Glu混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測圖Fig.1 HPLC chromatogram of GABA and L-Glu standard substance

1.2.6.3 酶活力測定

配制pH為4.4的0.2 mol/L醋酸鈉溶液。用其配制50.0 g/L的L-谷氨酸鈉、5.0 g/L MgSO4、1.0 g/L磷酸吡哆醛混合反應(yīng)液。加入濕菌體于55 ℃條件下水浴反應(yīng)30 min，離心取上清液用HPLC檢測GABA，計(jì)算酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA序列分析法鑒定短乳桿菌

圖2為短乳桿菌GLB-127菌株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，可以看到菌株在1 500 bp處有一熒光條帶，并且沒有拖尾現(xiàn)象，滿足測序的要求。將菌株16S rDNA測序后，得到測序結(jié)果，序列長度為1 461 bp。將所得序列在NCBI進(jìn)行BLAST相似性比對，與Lactobacillusbrevis2651相似度最高，達(dá)99.86%，確定其為短乳桿菌。

1-GLB-127 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M-Marker圖2 短乳桿菌GLB-127 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of 16S rDNA amplified from L.brevis GLB-127

2.2 短乳桿菌GLB-127掃描電鏡觀察

通過掃描電子顯微鏡可以看到(圖3)，短乳桿菌呈短桿狀，表面光滑粗壯，無雜菌污染，菌體長度1～2 μm，寬度約0.6 μm。

圖3 短乳桿菌GLB-127掃描電鏡形態(tài)圖Fig.3 Scanning electron microscope image of L.brevis GLB-127

2.3 短乳桿菌系統(tǒng)分類

菌株LactobacillusbrevisGLB-127經(jīng)16S rDNA基因序列分析鑒定為短乳桿菌，短乳桿菌屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱里的乳桿菌目乳桿菌科乳桿菌屬[20]。采用MEGA-X軟件構(gòu)建該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出L.brevisGLB-127與L.brevis2560及L.brevis2651親緣關(guān)系最近，為屬內(nèi)同種。

圖4 短乳桿菌GLB-127 16 s rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of L.brevis GLB-127 based on its 16S rDNA sequences

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速優(yōu)化

轉(zhuǎn)速優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分4組進(jìn)行，對比4種不同轉(zhuǎn)速培養(yǎng)條件下OD600及酶活力的差別(圖5)。隨著轉(zhuǎn)速的不斷提高，菌體生物量不斷增加，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速的增加有利于菌體的供氧，促進(jìn)了菌體的生長。在150 r/min培養(yǎng)條件下，短乳桿菌OD600達(dá)到了7.05，超過了靜止發(fā)酵時(shí)的3.45，但是GAD活性卻是在靜置時(shí)最高，為191.1 U/g菌體濕重，是50 r/min培養(yǎng)條件下的2.8倍，這與短乳桿菌為厭氧菌相吻合。高轉(zhuǎn)速有利于菌體的生長，卻不利于GAD的表達(dá)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇靜置培養(yǎng)。

圖5 轉(zhuǎn)速對酶活力及生物量的影響Fig.5 Effect of rotation speed on enzyme activity and biomass

2.4.2 培養(yǎng)溫度優(yōu)化

隨后又考察了誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對OD600及酶活力的影響(圖6)。培養(yǎng)溫度控制在37 ℃菌體生物量最高，OD600為4.21，比25 ℃培養(yǎng)條件下高出63.2%；培養(yǎng)溫度控制在30 ℃時(shí)GAD酶活力最高，達(dá)到了200.1 U/g菌體濕重，比37 ℃條件下高出25.6%。這是因?yàn)槊傅鞍咨伤俾逝c酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成存在關(guān)系，低溫放緩了蛋白質(zhì)的生成速率，利于形成酶蛋白正確的空間構(gòu)象，但過低的溫度不利于生物量的積累，綜合考慮誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度控制在30 ℃最合適[21]。

圖6 誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對酶活力及生物量的影響Fig.6 Effect of culture temperature onenzyme activity and biomass

2.5 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.5.1 轉(zhuǎn)化溫度的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)條件確定后，對轉(zhuǎn)化溫度進(jìn)行了優(yōu)化(圖7)。在45 ℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化效果最好，GABA為66.4 g/L，比37 ℃高出33.9%，這是因?yàn)闇囟壬撸欣诿复俜磻?yīng)速度的提升；與45 ℃相比，在50 ℃轉(zhuǎn)化條件下，GABA降低了21.2%，這是因?yàn)檫^高的溫度影響了全細(xì)胞催化酶的半衰期，使GAD快速失活，不利于GABA產(chǎn)量的積累[22]。

圖7 溫度對轉(zhuǎn)化效果的影響Fig.7 Effect of temperature on the conversion rate

2.5.2 全細(xì)胞催化酶加量優(yōu)化

隨后對轉(zhuǎn)化體系中全細(xì)胞催化酶添加量進(jìn)行了優(yōu)化(圖8)，隨著全細(xì)胞催化酶用量增加，反應(yīng)速率大大加快，轉(zhuǎn)化體系中不溶的L-Glu消失，經(jīng)補(bǔ)加L-Glu，當(dāng)全細(xì)胞用量為75 g/L時(shí)，GABA達(dá)到160.5 g/L，比全細(xì)胞用量為50 g/L時(shí)高出38.9%。當(dāng)全細(xì)胞催化酶加量超過75 g/L時(shí)，GABA不再增加，說明此時(shí)GAD活性位點(diǎn)已經(jīng)全部被底物L(fēng)-Glu占據(jù)，過量的酶無益于產(chǎn)量的繼續(xù)增加[23]，考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際需求，為節(jié)約成本，全細(xì)胞菌體選取75 g/L的添加量。

圖8 全細(xì)胞催化酶加量對轉(zhuǎn)化效果的影響Fig.8 Effect of whole cell catalytic enzyme amount on conversion rate

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

為進(jìn)一步提高GABA產(chǎn)量，滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求，特進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為2組進(jìn)行，分別采用1.1.2中初始發(fā)酵培養(yǎng)基與優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。由表1可知，培養(yǎng)基經(jīng)過優(yōu)化，GABA得到了提升，達(dá)到了240.6 g/L，產(chǎn)量比初始培養(yǎng)基提高了55.3%，轉(zhuǎn)化率達(dá)98.1%。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)Table 1 Optimization of fermentation medium

2.7 發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

2.7.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了10 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵罐底料量按照6 L稱量，加入5 L純化水溶解。種子液OD600為2.4，鏡檢短桿無雜菌。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，用氨水控制發(fā)酵液pH為6.6，攪拌轉(zhuǎn)速0 r/min。流加500 g/L葡萄糖使發(fā)酵液初始碳源為50 g/L，3 h后繼續(xù)流加葡萄糖，共計(jì)1 000 mL，氨水共補(bǔ)入115 mL，發(fā)酵時(shí)間為48 h[24]。放罐時(shí)菌體OD600為7.9，酶活力為315.9 U/g菌體濕重。

2.7.2 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵結(jié)束后，將2.7.1中離心所得菌體按照濕重75 g/L的添加量加入轉(zhuǎn)化液中，然后再加入500 g/L的L-Glu，其余成分的添加量見1.2.5。溫度控制在45 ℃，pH用磷酸控制在4.6。轉(zhuǎn)化液HPLC色譜圖如圖9所示，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，經(jīng)HPLC檢測轉(zhuǎn)化液中GABA為345.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為98.5%。將轉(zhuǎn)化液離心后收集全細(xì)胞菌體，可加入新的轉(zhuǎn)化體系中繼續(xù)轉(zhuǎn)化L-Glu生產(chǎn)GABA，收集離心上清液用于后續(xù)的提取純化。

圖9 轉(zhuǎn)化液HPLC檢測色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of conversion liquid

3 結(jié)論

本研究以短乳桿菌發(fā)酵表達(dá)GAD制備GABA，經(jīng)掃描電子顯微鏡與分子生物學(xué)鑒定所用微生物為短乳桿菌，系統(tǒng)分類為乳桿菌屬的一種。通過發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定了短乳桿菌GLB-127在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)所產(chǎn)GAD活性最高，達(dá)到了200.1 U/g菌體濕重。進(jìn)一步對轉(zhuǎn)化條件及發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定了轉(zhuǎn)化體系的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，全細(xì)胞最佳用量為75 g/L；在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15 g/L玉米漿干粉及1.0 g/L MgSO4，使得搖瓶中GABA達(dá)到了240.6 g/L，比初始培養(yǎng)基提高了55.3%。最后在10 L發(fā)酵罐成功放大，GAD活性較搖瓶發(fā)酵有了明顯提升，達(dá)到了315.9 U/g，GABA達(dá)345.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為98.5%。該研究大幅度提高了短乳桿菌發(fā)酵制備的新食品原料GABA產(chǎn)量，對其產(chǎn)業(yè)化具有重要的指導(dǎo)作用。