陳璐，石俊，趙昊，張曉蒙，王妍凌，張晶晶，楊帆，盧灝澤，張鳳杰，金瑋鋆，于佳俊，薛潔*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 3(西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝，860000)4(酒類(lèi)品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京，100015)

葡萄醋是以葡萄、葡萄汁等為原料，經(jīng)酒精和醋酸雙重發(fā)酵而成，與糧食醋相比，葡萄醋色美味佳又兼具保健功能，其成分與葡萄酒相似，含有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、多酚類(lèi)物質(zhì)、礦物質(zhì)等有益成分[1]。葡萄醋中的有機(jī)酸能促進(jìn)新陳代謝,加快肌肉中乳酸的分解，從而消除疲勞[2-3]；葡萄醋中的氨基酸等物質(zhì)能刺激神經(jīng)中樞，促使胃分泌更多的胃液，從而促進(jìn)消化；葡萄醋還具有利尿、降血糖、降血脂、抗氧化、延緩衰老的功能[4-5]；另外，它還能夠破壞亞硝酸鹽，抑制堿性細(xì)菌的繁殖，起到防癌和抗癌的效果[6]。

由于高蛋白、高脂肪食物攝入量增加，高血脂癥患病人數(shù)也越來(lái)越多。高脂血癥是指血液中的一種或幾種脂質(zhì)水平異常。目前，臨床上常采用藥物治療和飲食干預(yù)的方法控制和降低血脂水平。藥物治療所用的藥物，如羥甲基戊二單酰輔酶A還原酶抑制劑、煙酸類(lèi)等，均存在一定的副作用，如肝臟功能損害、胃腸功能紊亂等[7-9]。飲食控制雖然能夠在一定程度上起到調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的作用，但長(zhǎng)期來(lái)看控制效果欠佳。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是長(zhǎng)期控制血脂更理想的方法。本研究以葡萄醋為研究對(duì)象，以健康大鼠作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯科咸汛讓?duì)大鼠血液、肝臟等健康指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，探討葡萄醋的作用機(jī)理，為后續(xù)深入探索葡萄醋與機(jī)體健康的關(guān)系提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為消費(fèi)者選擇葡萄醋提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)KM雄性大鼠120只，體質(zhì)量(30±2) g，購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境為每天12 h光照、12 h黑暗，溫度為(25±1) ℃，相對(duì)濕度為60%，自由飲水和進(jìn)食，無(wú)特定病原體。

所有動(dòng)物都被保存在無(wú)病原體的環(huán)境中，并臨時(shí)喂食。動(dòng)物的護(hù)理和使用程序得到了北京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵守所有適用的有關(guān)動(dòng)物倫理使用的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。

1.1.1 飼料與藥物

普通飼料，鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；辛伐他汀片,石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；膽固醇，天津原四通化工廠；膽酸鈉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；吐溫-80，河南亞統(tǒng)食品原料有限公司；丙二醇，武漢勝天宇生物科技有限公司；豬油，四川省青川縣川珍實(shí)業(yè)有限公司。

脂肪乳劑配方：20 g豬油、10 g膽酸鈉、20 g膽固醇于60 ℃水浴下混合均勻制成油相。稱(chēng)取30 g蔗糖，于60 ℃水浴下溶于30 mL蒸餾水制成水相。量取20 mL吐溫-80作為調(diào)和劑，20 mL 1，2-丙二醇作為表面活性劑，將油相、水相、調(diào)和劑以及表面活性劑于60 ℃水浴下混溶，攪拌至乳黃色。再使用研缽將乳黃色液體研至乳白色，制成乳劑。配制好后，冰箱冷凍儲(chǔ)藏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品A：葡萄醋(純葡萄汁發(fā)酵)、樣品B：葡萄醋[V(葡萄汁)∶V(藥食同源產(chǎn)品)=1∶1發(fā)酵]、樣品C：市售葡萄醋。其中樣品A和樣品B均由中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀造；樣品B添加山楂、烏梅、陳皮、決明子、紫蘇、薄荷、茯苓中藥成分汁液。

總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒，南京建成生物工程研究所；基因組DNA提取試劑盒，Omega Bio Tek公司；高效RIPA裂解液，單去污劑裂解液(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)，北京索萊寶科技有限公司；0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.0～7.2)，通用型組織固定液(中性)，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX 50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BG subMIDI多用途水平電泳儀、BG Power600 h電泳儀電源，上海珂淮儀器有限公司；全波段酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；BC C57 PCR儀、Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN COULTER公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄醋生產(chǎn)工藝流程

樣品A制備流程：

釀酒葡萄→除梗壓榨→葡萄醪液→酒精發(fā)酵→過(guò)濾→調(diào)整酒精度(6%～6.5%)→醋酸發(fā)酵(34 ℃)→澄清過(guò)濾→葡萄原醋

樣品B制備流程：

釀酒葡萄→除梗壓榨→葡萄醪液→酒精發(fā)酵→過(guò)濾→調(diào)整酒精度(6%～6.5%)→加入藥食同源產(chǎn)品汁液→醋酸發(fā)酵(34 ℃)→澄清過(guò)濾→葡萄原醋

1.3.2 藥食同源產(chǎn)品汁液的制備方法

稱(chēng)量藥材(烏梅1.5%、山楂1%，陳皮0.75%、紫蘇0.1%、決明子0.1%、薄荷0.1%、茯苓0.1%,均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，加入蒸餾水，95 ℃浸提60 min，浸提完成過(guò)濾，再次加蒸餾水進(jìn)行二次浸提，過(guò)濾備用。

1.3.3 大鼠分組及灌胃

120只KM雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為12組(n=10)，分別為對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、樣品A高劑量組、樣品A中劑量組、樣品A低劑量組、樣品B高劑量組、樣品B中劑量組、樣品B低劑量組、樣品C高劑量組、樣品C中劑量組、樣品C低劑量組。除對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組均在普通飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上以脂肪乳劑灌胃造模，以6 mL/(kg·d)計(jì)，正常對(duì)照組每日以等量生理鹽水灌胃1次，共喂養(yǎng)4周后取各組動(dòng)物血清檢測(cè)TC、TG、LDL-C、HDL-C，判斷是否建模成功。

4周后，除對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組均在普通飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上以脂肪乳劑灌胃造模，以6 mL/(kg·d)計(jì)，正常對(duì)照組每日以等量生理鹽水在上午9點(diǎn)灌胃1次。陽(yáng)性組、樣品低劑量組、中劑量及高劑量組每天分別以4、1.25、2.5、5 mL/(kg·d)相應(yīng)藥物劑量在下午4點(diǎn)灌胃1次，對(duì)照組及模型組每天以等量生理鹽水灌胃。于8周末取動(dòng)物樣本。檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、載脂蛋白A1(apolipoprotein A1, ApoA1)及載脂蛋白B(apolipoprotein B, ApoB)含量，并制作肝臟病理切片觀察組織病理變化。

1.3.4 樣品收集

在灌胃結(jié)束后，所有大鼠禁食12 h但不禁水，依次將大鼠移至無(wú)菌間用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，采用眼眶取血法收集血液樣本于離心管中， 3 000 r/min離心15 min，取無(wú)溶血血清用于相應(yīng)指標(biāo)測(cè)定；配合頸椎脫臼法將大鼠處死后，解剖取出肝臟，用冷生理鹽水沖洗血漬，濾紙吸干后稱(chēng)重，選取肝臟左葉同一部位組織用通用型組織固定液(中性)固定，剩下肝臟組織置于離心管中放入液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 肝組織勻漿制備

取大鼠肝臟，每個(gè)樣品0.1 g，用經(jīng)過(guò)預(yù)冷的PBS洗滌組織，用消毒后的剪刀將組織剪成小塊放入勻漿器并加2 mL新鮮裂解緩沖液，低溫研磨。將研磨后的勻漿放入離心管，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液用于組織蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化酶3、總超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)，操作方法及步驟按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.6.1 體質(zhì)量增長(zhǎng)率和肝臟系數(shù)

喂養(yǎng)期間每周稱(chēng)量體質(zhì)量1次，記錄并計(jì)算每組平均體質(zhì)量；解剖大鼠后取肝臟，沖洗后稱(chēng)量質(zhì)量，按公式(1)計(jì)算肝臟指數(shù)：

(1)

1.3.6.2 血清相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

將離心后的大鼠血清樣本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C等指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)平行測(cè)定3次。

1.3.6.3 肝臟病理切片制作

取出固定后的肝臟組織，用石蠟包埋做冷凍切片，接著用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理切片的形態(tài)學(xué)變化，具體方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Qiime 1.9.1計(jì)算相應(yīng)指數(shù)；運(yùn)用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，結(jié)合單因素方差及顯著性進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著；數(shù)據(jù)分析方法：t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)高脂模型建立結(jié)果分析

血清總膽固醇或甘油三酯異常升高時(shí)，臨床分別診斷為“高膽固醇血癥”和“高甘油三酯血癥”，當(dāng)兩項(xiàng)指標(biāo)均異常升高時(shí)，診斷為“混合型高脂血癥”?；旌闲透咧Y是臨床上較為普遍，且存在高危因素較多的一種高脂血癥類(lèi)型[11-12]。

HDL-C被稱(chēng)為好脂蛋白、好膽固醇，有利于血脂降低、軟化血管[13]。其可將膽固醇運(yùn)輸?shù)窖苤?，運(yùn)送至肝臟，在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)換化為其他物質(zhì)或能量進(jìn)行代謝，從而達(dá)到清理血管的作用，不會(huì)形成血管黏稠度過(guò)高或者血管粥樣硬化等情況。LDL-C被稱(chēng)為壞膽固醇，它可以運(yùn)載膽固醇進(jìn)入外圍組織細(xì)胞，可攜帶膽固醇存積在動(dòng)脈壁上，積累后將引起動(dòng)脈硬化[14-16]。

試劑盒檢測(cè)造模4周后的大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量見(jiàn)表1。模型組與對(duì)照組對(duì)比，模型組大鼠血清中TC、TG含量均極顯著升高(P< 0.01)，造模成功。這也說(shuō)明，較長(zhǎng)時(shí)間的高脂肪、高蛋白的飲食會(huì)引起機(jī)體內(nèi)血清中的膽固醇與甘油三酯含量均升高，致使混合型高脂血癥的發(fā)生，達(dá)到混合型高脂血癥的判定標(biāo)準(zhǔn)，這也為下一步實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

2.2 不同樣品灌胃后對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量可以直觀反映動(dòng)物狀態(tài)、代謝水平，可作為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案的有力證據(jù)。如圖1所示。

a-樣品A；b-樣品B；c-樣品C圖1 各組大鼠每周體質(zhì)量變化曲線Fig.1 Weekly weight gain line chart of each group of rats

在通過(guò)飼喂樣品干預(yù)4周后，大鼠體質(zhì)量見(jiàn)表2：相對(duì)于模型組，3種樣品中各組大鼠體質(zhì)量均有不同程度的降低，其中高、中劑量組體質(zhì)量均有顯著降低(P<0.05)；相對(duì)于對(duì)照組，除陽(yáng)性組，其他組大鼠體質(zhì)量均顯著增長(zhǎng)(P<0.05)。其中A、B樣品大鼠在第5周～第7周普遍出現(xiàn)體質(zhì)量降低幅度較大情況，結(jié)合平時(shí)飼養(yǎng)情況，這可能與樣品發(fā)揮減脂作用及食欲有關(guān)，在此期間這幾組大鼠食欲均有降低的情況。研究表明，多酚類(lèi)物質(zhì)可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的食欲控制，通過(guò)5-羥色胺、組胺、多巴胺及其受體控制食物的沖動(dòng)和飽腹感[17]。本研究中各葡萄醋樣品對(duì)大鼠體質(zhì)量均有不同程度的控制作用。

表2 第8周各組大鼠體質(zhì)量Table 2 Final body weight of mice in each group

2.3 不同樣品灌胃后對(duì)大鼠血脂的影響

葡萄酒能增加HDL-C和載脂蛋白水平，作為“血管清道夫”，HDL-C能夠攝取血管壁內(nèi)膜底層沉浸下來(lái)的LDL-C、TC、TG等有害物質(zhì)，且使膽固醇構(gòu)成從細(xì)胞膜流向血漿脂蛋白的濃度梯度，使其移至肝臟并分解代謝出體外，減少血漿HDL中游離膽固醇的濃度，對(duì)心血管疾病具有保護(hù)作用[18-20]。本研究比較了不同樣品灌胃后對(duì)大鼠血脂功能指標(biāo)的影響，結(jié)果如表3所示。與模型組相比，樣品各組TC與TG均有降低。單就TC而言，樣品B高劑量組和樣品C高劑量組與模型組相比顯著降低(P<0.05)；就TG而言，樣品B高、中劑量組與模型組相比顯著降低(P<0.05)；就HDL-C而言，樣品各組有增高趨勢(shì)，樣品組中只有樣品B高劑量組與模型組差異性顯著(P<0.05)；對(duì)于LDL-C而言，樣品各組均有降低，樣品B各組與模型組差異顯著(P<0.05)。

綜上，樣品B對(duì)血脂各指標(biāo)影響程度相對(duì)于其他樣品較為明顯，說(shuō)明中藥葡萄醋中的中藥成分對(duì)血脂有改善作用；對(duì)于本實(shí)驗(yàn)采用的灌胃劑量，樣品C中、低劑量組對(duì)于血脂影響差異不明顯，樣品B高、低劑量組對(duì)于血脂影響不明顯。長(zhǎng)期飲用本實(shí)驗(yàn)中的中藥葡萄醋可預(yù)防血脂沉積、動(dòng)脈硬化、管腔變窄，以及缺血性心血管疾病，因此各組大鼠血脂中HDL-C升高、LDL-C指標(biāo)顯著降低再次證明了葡萄醋對(duì)心血管等具有保護(hù)作用。

表3 第8周各組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量 單位：mmol/L

2.4 不同樣品灌胃后對(duì)大鼠血清載脂蛋白的影響

血清ApoA作用和HDL-C相同，也是組成HDL-C的成分，它可以抑制動(dòng)脈硬化的發(fā)生，導(dǎo)致冠心病、腦血栓、下肢動(dòng)脈硬化發(fā)病率下降[21-22]。ApoB也由肝臟合成，是LDL-C的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占LDL-C總蛋白含量的97%，ApoB的測(cè)定可直接反映LDL-C的水平[23]。

如圖2所示，ApoA1、ApoB與HDL-C、LDL-C數(shù)據(jù)相呼應(yīng)，但與模型組對(duì)比，樣品各組差異均不顯著。3種樣品中，樣品B對(duì)于兩項(xiàng)指標(biāo)改善幅度最大，樣品A與樣品C基本無(wú)差異。通過(guò)ApoA1及ApoB指標(biāo)的變化可以說(shuō)明，各組樣品對(duì)血脂均有改善作用，依舊可以證明葡萄醋對(duì)心血管病具有保護(hù)作用。

1#-對(duì)照組；2#-模型組；3#-陽(yáng)性組；4#-樣品A高劑量組；5#-樣品A中劑量組；6#-樣品A低劑量組；7#-樣品B高劑量組；8#-樣品B中劑量組；9#-樣品B低劑量組；10#-樣品C高劑量組；11#-樣品C中劑量組；12#-樣品C低劑量組(下同)a-ApoA1；b-ApoB圖2 各組大鼠血清ApoA1和ApoB水平Fig.2 Effects of serum ApoA1 and ApoB levels in each group

2.5 不同樣品灌胃后對(duì)大鼠肝臟系數(shù)及組織病理學(xué)觀察

肝臟系數(shù)因其敏感度較高是毒理學(xué)中常用指標(biāo)[24]。當(dāng)肝臟系數(shù)增大時(shí)，可能出現(xiàn)肝臟充血、水腫或增生肥大等情況；當(dāng)肝臟系數(shù)減小時(shí)，表示肝臟萎縮或其他退行性病變[25]。本研究分析了不同樣品灌胃后對(duì)大鼠肝臟系數(shù)的影響，如圖3所示，與模型組相比，陽(yáng)性組大鼠差異顯著(P<0.05)；其他組差異不顯著；樣品組大鼠肝臟質(zhì)量及肝臟系數(shù)有不同程度的降低，但降低規(guī)律并不與樣品及劑量高低相關(guān)聯(lián)。

a-肝臟系數(shù)；b-肝臟質(zhì)量圖3 不同組別大鼠肝臟系數(shù)及肝臟質(zhì)量Fig.3 Liver coefficients and liver weight of each group

圖4是各組大鼠肝臟組織的病理學(xué)切片顯微觀察結(jié)果，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核，胞漿著色較為均勻，未見(jiàn)脂肪變性。模型組肝細(xì)胞排列松散，肝細(xì)胞排列混亂且有腫大，細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)許多大小不等的空泡，中央靜脈周?chē)∽儽容^明顯，并呈彌漫性重度脂肪變性而導(dǎo)致輕微的脂肪肝。樣品A、C的中、低劑量組肝細(xì)胞排列也較為整齊，肝細(xì)胞較正常稍有腫大的現(xiàn)象，肝細(xì)胞間隙也可見(jiàn)少量脂肪滴而形成的空泡，但脂變肝細(xì)胞數(shù)目較模型組明顯減少；樣品B各量及樣品A、C高劑量組肝細(xì)胞排列較整齊，接近于正常，基本上沒(méi)有脂肪滴空泡，肝細(xì)胞基本恢復(fù)正常。綜合分析得知，樣品B各組及樣品A、C的高劑量組對(duì)大鼠肝臟有不同程度的降脂功能。

圖4 肝臟病理組織學(xué)觀察Fig.4 Histopathology of liver tissues from rats in different groups

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同樣品灌胃后大鼠的體質(zhì)量均有不同程度的降低，其中A、B樣品大鼠在第5周～第7周體質(zhì)量降低幅度較大；通過(guò)對(duì)大鼠血脂的檢測(cè)可以看出3種樣品均有降血脂的作用，其中樣品B效果更加明顯；通過(guò)對(duì)大鼠血清載脂蛋白的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，樣品各組ApoA1指標(biāo)升高、ApoB指標(biāo)降低，其中樣品B對(duì)于ApoA1、ApoB兩項(xiàng)指標(biāo)改善幅度最大；不同樣品灌胃后各組大鼠肝臟質(zhì)量及肝臟系數(shù)均有降低，但降低規(guī)律并不與樣品及劑量高低相關(guān)聯(lián)；由肝臟切片可見(jiàn)，與模型組相比樣品B各劑量及樣品A、C高劑量組肝細(xì)胞基本恢復(fù)正常，其他各組肝細(xì)胞均有不同程度的損傷。攝入葡萄醋后，機(jī)體內(nèi)部脂質(zhì)含量降低，分解脂質(zhì)能力增強(qiáng)，由此可見(jiàn)葡萄醋對(duì)機(jī)體攝入脂質(zhì)引起的油膩感有控制作用，同時(shí)也說(shuō)明長(zhǎng)期適量攝入葡萄醋對(duì)健康大鼠的血脂水平有明顯改善，以及能有效預(yù)防心血管病。綜合各項(xiàng)指標(biāo)來(lái)看，3種樣品中加了藥食同源產(chǎn)品發(fā)酵的葡萄醋預(yù)防心血管病的作用最明顯。