周子寒，劉琦琦，郝海寧，仝令君，劉同杰，公丕民，張?zhí)m威，易華西

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266000)

外泌體是直徑在40～160 nm，由細(xì)胞內(nèi)體形成的胞外囊泡，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，主要成分包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA、氨基酸及各種代謝產(chǎn)物等[1]。研究表明，外泌體中的核酸、蛋白質(zhì)等成分具有傳遞遺傳信息，調(diào)節(jié)生理功能等特性[2-3]。不同來源的外泌體對(duì)不同受體細(xì)胞的影響存在差異[4]。目前對(duì)外泌體的應(yīng)用研究主要集中在疾病診斷、藥物輸送等方面[5]。

乳汁作為哺乳動(dòng)物幼體的主要營養(yǎng)來源，含有多種營養(yǎng)素及生長調(diào)節(jié)因子、免疫相關(guān)因子等重要生理活性物質(zhì)[6]。WALSH等[7]指出，母乳能夠?yàn)閶胗變簶?gòu)建最為理想的腸道菌群。外泌體作為乳汁重要成分之一，能夠攜帶和傳遞miRNA等信號(hào)分子，已成為目前食源外泌體的研究熱點(diǎn)[8]。人體在攝入乳汁的過程中，乳源外泌體與腸道菌群間的相互作用不可避免，因此牛乳外泌體可能會(huì)對(duì)腸道內(nèi)的各種益生菌生長及功能產(chǎn)生影響。

牛乳或母乳等乳源外泌體已被證明具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖等生理功能[9-10]。YU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳源外泌體可以促進(jìn)大腸桿菌K-12 MG1655以及植物乳桿菌WCFS1的生長，調(diào)節(jié)細(xì)菌的基因表達(dá)。TONG等[12]指出，口服牛乳胞外囊泡調(diào)節(jié)了小鼠的腸道菌群，增強(qiáng)了小鼠的腸道免疫力。TENG等[13]證實(shí)，外泌體可調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、影響腸道菌群生長。腸道菌群作為人體的一種重要“消化器官”，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、腸道穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)吸收、能量獲取等過程進(jìn)一步影響人體健康[14]，同時(shí)擁有自己獨(dú)特的調(diào)節(jié)方式，維持著正常的動(dòng)態(tài)平衡。

雙歧桿菌是益生菌的重要組成部分，對(duì)人體生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等益生功能有較多影響[15]。關(guān)于牛乳外泌體對(duì)腸道菌群中雙歧桿菌等益生菌影響的研究報(bào)道不多，且大多并未探究牛乳外泌體對(duì)益生菌益生特性的影響，因此進(jìn)一步探究牛乳外泌體對(duì)腸道益生菌生長及其功能的影響對(duì)研究與開發(fā)乳源外泌體具有重要意義。動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2是本實(shí)驗(yàn)室前期從嬰幼兒糞便中分離得到的1株具有改善炎癥等生理功能的益生菌。而耐受人體消化道是益生菌在腸道定植并進(jìn)一步發(fā)揮作用的前提條件之一，益生菌必須能通過消化道等特殊生理環(huán)境并保持一定濃度方可發(fā)揮益生功能。此外，利用體外細(xì)胞模型的黏附性可間接反映出菌株黏附腸道上皮細(xì)胞的能力，細(xì)胞黏附性越強(qiáng)，菌株定植能力越強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探索了牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2生長及其益生特性的影響，旨在為牛乳外泌體作為新型益生元的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：CCK-8、2%磷鎢酸、胰酶、胃蛋白酶、Triton X-100，北京索萊寶生物有限公司；BCA試劑盒、蛋白Marker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；TSG101抗體(一抗)，上海Abcam公司；CD81抗體(一抗)，美國Gene Tex公司；HRP二抗，上海斯信生物科技有限公司。

主要儀器：TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀有限公司；CP70ME超高速落地離心機(jī)，日本Hitachi公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，Thermo Fisher公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海精宏有限公司；DYCZ-24F雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠；ZetaView PMX 110 納米粒度追蹤儀，德國Particle Metrix 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛乳外泌體的提取鑒定

4 ℃條件下，參照TONG等[16]的方法，通過超速離心法提取牛乳外泌體。通過BCA試劑盒測定牛乳外泌體濃度。之后通過透射電鏡、納米顆粒追蹤技術(shù)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)提取到的牛乳外泌體溶液進(jìn)行鑒定，具體操作如下：

(1)超速離心法：通過凝乳酶分離鮮牛乳中的乳清，過0.22 μm濾膜后備用。使用超速離心機(jī)以100 000×g離心60 min，吸取上清液后再以135 000×g離心90 min，最后將沉淀的外泌體重懸于PBS中，100 000×g離心60 min。將完成離心的牛乳外泌體溶液移至100 kDa超濾管進(jìn)行超濾，PBS復(fù)溶后于-80 ℃保存。

(2)透射電鏡：移取10 μL溶解于PBS的外泌體及磷鎢酸溶液，滴加至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，夾取銅片，將碳面浸入外泌體溶液浸染1 min后夾取銅片，用濾紙吸去多余外泌體，再將碳面浸入磷鎢酸溶液負(fù)染1 min，吸去多余磷鎢酸后放入培養(yǎng)皿，常溫干燥，干燥后在透射電鏡80 kV下觀察外泌體形態(tài)及大小。

(3)納米顆粒追蹤技術(shù)：使用PBS稀釋外泌體樣品后，使用110 nm聚苯乙烯顆粒校準(zhǔn)ZetaView系統(tǒng)，使用ZetaView PMX 110進(jìn)行檢測，通過ZetaView 8.04.02軟件分析粒度及濃度。

(4)免疫印跡法：提取牛乳外泌體蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。制備5%/10%SDS-PAGE，上樣20 μL后，在80 V條件下使樣品達(dá)到分離膠，120 V條件下使樣品達(dá)到分離膠底部。電泳完成后，根據(jù)Marker確定CD81、TSG101、Alix對(duì)應(yīng)條帶，PVDF膜浸入甲醇溶液激活后在80 V條件下轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜置入5%牛血清白蛋白的TBST緩沖液中封閉60 min；再次加入TBST洗滌3次，每次15 min。按V(一抗)∶V(一抗稀釋液)=1∶1 000加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜。再次用TBST洗滌3次后，按V(一抗)∶V(二抗稀釋液)=1∶5 000加入二抗，室溫?fù)u床孵育60 min，TBST洗滌3次。按照V(A液)∶V(B液)=1∶1的比率配制發(fā)光液，將發(fā)光液滴加在PVDF膜上曝光拍照。

1.2.2 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2生長過程的影響

將凍存管保存的菌株以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接至10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，復(fù)蘇后傳代使用。實(shí)驗(yàn)組中添加外泌體溶液使其蛋白質(zhì)量濃度為100 μg/mL，對(duì)照組中添加等量PBS，48 h內(nèi)每隔4 h取樣，在600 nm處測定吸光度，繪制生長曲線。

設(shè)置外泌體低、中、高劑量組，溶液蛋白濃度100 μg/mL(EXO-LOW)、150 μg/mL(EXO-MID)、200 μg/mL(EXO-HIGH)，干預(yù)24 h后與對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測定不同濃度牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2生長的影響。

1.2.3 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2胃腸環(huán)境耐受性的影響

向PBS中不斷滴加0.1 mol/L的鹽酸至pH=3為止，用以模擬胃腸道酸性環(huán)境。向PBS中添加豬膽鹽，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的膽鹽溶液備用。向PBS中添加胰酶，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的胰酶溶液用以模擬胃腸道胰酶消化環(huán)境。向pH 2的PBS中添加胃蛋白酶，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的胃蛋白酶溶液用以模擬胃蛋白酶消化環(huán)境。

將活化后的動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌株轉(zhuǎn)接至酸性環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)組添加低、中、高劑量牛乳外泌體，對(duì)照組添加等量PBS。37 ℃下1.5、3 h后分別取出，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測定牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2耐酸性的影響。

將活化后的動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌株轉(zhuǎn)接至MRS肉湯培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%，用以模擬胃腸道膽鹽環(huán)境。實(shí)驗(yàn)組添加低、中、高劑量牛乳外泌體，對(duì)照組添加等量PBS，37 ℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h后取出，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測定牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2膽鹽耐受性的影響。

將活化后的動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌株分別轉(zhuǎn)接至胰酶及胃蛋白酶消化環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)組添加低、中、高劑量牛乳外泌體，對(duì)照組添加等量PBS。37 ℃環(huán)境中1.5、3 h后分別取出，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測定牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2胰酶及胃蛋白酶耐受性的影響。

1.2.4 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2細(xì)胞黏附性的影響

根據(jù)SIDIRA等[17]的方法，將活化后的Caco-2細(xì)胞傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以各孔細(xì)胞數(shù)1×105鋪板，37 ℃培養(yǎng)24 h后各孔添加動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌體至109CFU/mL，實(shí)驗(yàn)組添加牛乳外泌體使其質(zhì)量濃度為100、150、200 μg/mL；對(duì)照組添加等量PBS，于CO2培養(yǎng)箱中共孵育16 h。用無菌PBS洗滌5次，除去未黏附的雙歧桿菌，1 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Triton X-100裂解細(xì)胞20 min，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測定牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2細(xì)胞黏附性的影響。

1.2.5 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2抗炎特性的影響

將活化后的Caco-2細(xì)胞傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以各孔細(xì)胞數(shù)1×105鋪板，37 ℃培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組各孔以細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù)=100∶1的數(shù)量添加動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌體，之后添加牛乳外泌體使其質(zhì)量濃度分別為0、100、150、200 μg/mL；空白對(duì)照組為等量PBS，37 ℃干預(yù)16 h后各孔添加10% CCK-8溶液，孵育1 h后使用酶標(biāo)儀測量450 nm處吸光度，細(xì)胞存活率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中,A0，空白對(duì)照組450 nm處吸光度；A，實(shí)驗(yàn)組450 nm處吸光度。

將活化后的Caco-2細(xì)胞傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以各孔細(xì)胞數(shù)1×105鋪板，37 ℃培養(yǎng)24 h后使用2 μg/mL的脂多糖誘導(dǎo)構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組各孔以細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù)=100∶1的數(shù)量添加動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌體，之后添加牛乳外泌體使其質(zhì)量濃度分別為0、100、150、200 μg/mL；空白對(duì)照組為等量PBS，37 ℃干預(yù)16 h，收集炎癥細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心10 min收集培養(yǎng)上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，測定各培養(yǎng)液中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的水平。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。相同字母代表無顯著差異，不同字母代表差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳外泌體的提取與鑒定

采用超速離心法提取牛乳外泌體后，利用透射電鏡觀察牛乳外泌體形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。提取的牛乳外泌體為雙層膜結(jié)構(gòu)的近似球體，其直徑為30～200 nm，具有外泌體的典型形態(tài)特征，同時(shí)提取的外泌體雜質(zhì)較少。目前，外泌體的提取方法主要包括超速離心法、免疫親和捕獲法、化學(xué)沉淀法等[18]。本研究結(jié)果表明超速離心法可以實(shí)現(xiàn)牛乳外泌體的提取分離。

圖1 牛乳外泌體透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of bovine milk exosomes

粒度大小是外泌體鑒定的重要指標(biāo)之一。圖2為牛乳外泌體粒徑分布圖及其顆粒濃度。通過超速離心法提取獲得的牛乳外泌體粒徑分布在100～200 nm，與透射電鏡觀察到的結(jié)果基本一致，粒徑大小符合外泌體的定義。

圖2 牛乳外泌體粒徑分布及其濃度Fig.2 Particle size distribution and concentration of bovine milk exosomes

特異性標(biāo)記蛋白是外泌體鑒定的另一重要指標(biāo)。外泌體外膜及內(nèi)容物中存在許多特異性標(biāo)記蛋白，這些特異性蛋白可以輔助鑒定外泌體，包括CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix等[19]。利用免疫印跡法對(duì)提取的牛乳外泌體的標(biāo)志性蛋白進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖3所示。提取的牛乳外泌體樣本中檢測到了外泌體標(biāo)志性蛋白CD81、TSG101、Alix，表明超速離心法可成功提取牛乳外泌體。

圖3 牛乳外泌體特異性標(biāo)記蛋白Fig.3 Specific marker protein of bovine milk exosomes

2.2 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2生長過程的影響

牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2生長的影響如圖4-a所示，牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2的生長促進(jìn)顯著，在24、28 h時(shí)促進(jìn)效果最為顯著，添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，菌濃度提升了1.8倍。進(jìn)一步對(duì)外泌體濃度是否會(huì)影響促生長效果進(jìn)行了探究，結(jié)果如圖4-b所示。牛乳外泌體在低、中、高劑量下均對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2生長有顯著促進(jìn)效果(P<0.05)，但牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2的促生長效果無明顯劑量依賴性。

a-生長曲線；b-牛乳外泌體劑量對(duì)活菌數(shù)的影響圖4 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2生長過程的影響Fig.4 Effects of bovine milk exosomes on the growth of B.animalis F1-3-2

2.3 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2腸胃環(huán)境耐受性的影響

如圖5所示，牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在酸性環(huán)境(pH 3.0)中存活率具有明顯的改善作用。添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在酸性環(huán)境保持1.5 h的存活率由43.0%提升至76.3%(P<0.05)，保持3.0 h后，存活率由34.3%提升至74.4%(P<0.05)。牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2酸性條件下的保護(hù)作用無明顯劑量依賴性。

a-1.5 h存活率；b-3.0 h存活率圖5 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2耐酸性的影響Fig.5 Effects of bovine milk exosomes on the acid resistance of B.animalis F1-3-2

牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境存活率的影響如圖6所示。

圖6 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2膽鹽耐受性的影響Fig.6 Effects of bovine milk exosomes on the bile salt resistance of B.animalis F1-3-2

牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境中的存活率具有明顯的提高作用。添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境24 h存活率由原來的34.1%提升至90.1%(P<0.05)。牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境的保護(hù)作用無明顯劑量依賴性。

牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在胃腸道蛋白酶環(huán)境下存活率的影響如圖7所示。牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在胰酶環(huán)境中的存活率具有一定程度的提高作用，中劑量牛乳外泌體(150 μg/mL)改善作用最為顯著，動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在胰酶環(huán)境中保持1.5 h后的存活率提升了38%(P<0.05)，保持3.0 h后的存活率提升了20%。

a-1.5 h存活率；b-3.0 h存活率圖7 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2胰酶耐受性的影響Fig.7 Effects of bovine milk exosomes on the trypsin resistance of B.animalis F1-3-2

牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在胃蛋白酶環(huán)境下存活率的影響如圖8所示。F1-3-2在胃蛋白酶(pH=3.0)條件下作用3 h后存活率幾乎為0，而牛乳外泌體有效提升了其在胃蛋白酶環(huán)境中的存活率。添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2在胃蛋白酶環(huán)境保持1.5 h的存活率由18.8%提升至35.7%(P<0.05)，保持3.0 h的存活率由0.5%提升至20.7%(P<0.05)。

a-1.5 h存活率；b-3.0 h存活率圖8 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2胃蛋白酶耐受性的影響Fig.8 Effects of bovine milk exosomes on the pepsin resistance of B.animalis F1-3-2

2.4 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2黏附性的影響

由圖9可知，牛乳外泌體能夠顯著提高動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能(P<0.05)。隨著牛乳外泌體劑量增大，影響效果更為顯著。相比于對(duì)照組，高劑量牛乳外泌體(200 μg/mL)干預(yù)后，動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力上升了1.16倍(P<0.05)。

圖9 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2黏附性的影響Fig.9 Effects of bovine milk exosomes on the adhesion of B.animalis F1-3-2

2.5 牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2抗炎特性的影響

牛乳外泌體和動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2前期均已被證實(shí)具有一定的抗炎活性。由圖10可知，低劑量牛乳外泌體與動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2共同作用表現(xiàn)出了最佳抗炎效果。與對(duì)照組相比，其細(xì)胞上清液中TNF-α含量下降了29.3%(P<0.05)，IL-1β含量下降了14.5%(P<0.05)，抗炎效果優(yōu)于動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2。隨著牛乳外泌體劑量增大，牛乳外泌體與動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2協(xié)同抗炎效果反而降低，可能是由于牛乳外泌體同時(shí)促進(jìn)了Caco-2細(xì)胞的生長所導(dǎo)致，炎癥細(xì)胞的增多導(dǎo)致了炎癥細(xì)胞因子水平的升高。

a-TNF-α水平；b-IL-1β水平圖10 牛乳外泌體及動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2對(duì)炎癥因子水平影響Fig.10 Effects of bovine milk exosomes and B.animalis F1-3-2 on the level of inflammatory cytokines

3 結(jié)論

牛乳外泌體對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2的生長具有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)也能夠提高動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2對(duì)腸胃環(huán)境的耐受性和黏附性能。牛乳外泌體與動(dòng)物雙歧桿菌F1-3-2體現(xiàn)出協(xié)同抗炎特性，相關(guān)炎癥因子水平顯著下調(diào)。牛乳外泌體有望作為一種新型益生元，發(fā)揮促進(jìn)益生菌生長、提高益生功能等作用。