劉小航，阮玉磊，宿萌，付曉芬，賀秀麗，郭立蕓，武曉樂,2，郭學武,2，肖冬光,2，陳葉福,2*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457) 3(北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點實驗室，北京，101300)

在啤酒工業(yè)中，啤酒酵母菌株的絮凝能力是評價啤酒酵母菌株優(yōu)劣的一個重要指標[1]。在啤酒主發(fā)酵結(jié)束前，強絮凝性酵母對酵母泥分離回用有利，但若酵母提前絮凝，則會引起發(fā)酵遲緩或停滯，最終嫩啤酒含糖量高，風味不理想。此外，絮凝太完全也會降低嫩啤酒中的酵母數(shù)，影響二次發(fā)酵等后熟進程[2-5]。選育弱絮凝性啤酒酵母菌株可達到延長酵母增殖穩(wěn)定期，降低啤酒中乙醛含量，提升風味質(zhì)量等目的。

研究顯示，涉及到啤酒絮凝性相關(guān)研究多為強絮凝性酵母菌株選育，弱絮凝性啤酒酵母育種實例較少。張建早等[6]先通過甲基磺酸乙酯誘變后利用連續(xù)培養(yǎng)方法對酵母進行馴化，得到了1株突變株S16，其絮凝能力比出發(fā)菌株提高了2.21倍。隨著絮凝相關(guān)遺傳機制不斷清晰，基因工程和代謝工程手段不斷豐富，通過分子操作可有效調(diào)控酵母的絮凝特性[7-8]，如通過不同啟動子控制絮凝基因的表達，可成功對絮凝時機和強度進行控制[9]。但當前由于消費者和行業(yè)本身負面態(tài)度，通過基因工程手段育種在食品行業(yè)仍難以被接受[10]。目前酵母育種途徑多樣，相比于傳統(tǒng)物理化學誘變選育等方法，常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)以操作簡便、安全性高等優(yōu)勢在微生物遺傳與育種領(lǐng)域上備受青睞[11-12]。WANG等[13]以KF-7為出發(fā)株，通過ARTP結(jié)合基因組改造和雜交策略，獲得1株耐多種脅迫的絮凝工業(yè)釀酒酵母菌株E-158。馮鵬鵬等[14]以工業(yè)酵母680bg為出發(fā)株進行ARTP誘變，獲得誘變菌株ARTP-162，其高級醇產(chǎn)量比出發(fā)株降低了約21%，且其他基本發(fā)酵性能無太大變化。

本研究以下面啤酒酵母L-1為出發(fā)菌株，對其進行ARTP誘變，并結(jié)合優(yōu)化后的絮凝能力檢測方法對誘變菌株進行初篩與二輪復篩，以期篩選出絮凝能力減弱且其他發(fā)酵性能較優(yōu)、遺傳性能較穩(wěn)定的菌株，為后續(xù)工業(yè)啤酒酵母的選育和投入到工業(yè)啤酒的生產(chǎn)應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

啤酒酵母菌株L-1，由北京燕京啤酒股份有限公司提供。

冰乙酸，天津化學試劑一廠；醋酸鈉，天津大茂化學試劑廠；次甲基藍，天津百世化工有限公司；CaSO4，天津市風船化學試劑科技有限公司；水合茚三酮、乙醛標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；麥芽糖標準品、麥芽三糖標準品，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：14°P 麥芽汁，由北京燕京啤酒股份有限公司提供；CaSO4緩沖液：將6.80 g醋酸鈉、0.51 g CaSO4、4.05 g冰乙酸溶于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至4.5。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ARTP-Ⅱ型誘變儀，北京思清源生物科技有限公司；ZXJD-A1270生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；Agilent 7890C氣相色譜儀、Agilent 1100 液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-1200型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；BX43 型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變

將L-1菌株培養(yǎng)至對數(shù)前中期并對其進行誘變，誘變過程及儀器參數(shù)參考文獻[14]。

1.2.2 啤酒發(fā)酵實驗

1.2.2.1 種子液擴培

一級種子液：取1環(huán)酵母菌株，接種于含5 mL 14°P麥汁的試管中，25 ℃靜置培養(yǎng)12 h。二級種子液：將一級種子液接種至含45 mL 14°P麥汁的250 mL三角瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)24 h。三級種子液：將二級種子液接種至含250 mL 14°P麥汁的500 mL三角瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 啤酒發(fā)酵

初篩：將二級種子液離心后按1.6×107CFU/mL 的接種量接種至含70 mL 14°P麥汁的大試管中(規(guī)格為：30 mm×200 mm)，10 ℃靜置培養(yǎng)4 d。第一輪復篩：發(fā)酵體系與接種量同于初篩，培養(yǎng)時間由4 d增至7 d，每個樣品3個平行。第二輪復篩：將三級種子液離心后并用無菌水洗滌1次獲得菌泥，按1.6×107CFU/mL的接種量接種至含有900 mL 14°P麥汁的1 L量筒，10 ℃靜置培養(yǎng)，每個樣品3個平行。

1.2.3 絮凝能力的檢測

將ASBC(American Society of Brewing Chemists)吸光度法[15]進行優(yōu)化后對酵母菌株的絮凝能力進行檢測。將發(fā)酵液混勻，分別取相同菌濃度(OD600值為6.5～7)發(fā)酵液于15 mL離心管，記為A、B;A管離心取沉淀，分別移取9 mL 蒸餾水和1 mL 250 mmol/L EDTA(pH=4.5)，使菌泥懸浮且振蕩混勻，取1 mL懸液稀釋10倍，測OD600并將該值記為ODA；B管離心取沉淀，先加10 mL 0.051%CaSO4溶液懸洗菌泥后并離心取沉淀，之后再加CaSO4緩沖液洗滌，渦旋振蕩器上振蕩15 s后離心管豎直放置6 min。取1 mL頂部液體稀釋3倍，測OD600并將該值記為ODB。絮凝值F按公式(1)計算：

(1)

式中：F，酵母菌株的絮凝能力，%；ODA，對A管處理后所測得的OD600值；ODB，對B管處理后所測得的OD600值

1.2.4 啤酒酵母死亡率的測定

使用次甲基藍染色法[16]測定酵母細胞死亡率。

1.2.5 α-氨基氮含量的測定

根據(jù)茚三酮顯色法[17]對發(fā)酵液中游離的α-氨基氮進行測定。

1.2.6 糖類含量的測定

使用液相色譜法測定發(fā)酵液中主要糖類含量[18]。

1.2.7 真正發(fā)酵度和酒精度的測定

根據(jù)GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》測定。

1.2.8 風味物質(zhì)含量的測定

使用氣相色譜儀對蒸餾后的發(fā)酵液中風味物質(zhì)進行測定。

氣相色譜條件：色譜柱Agilent CP-WAX(50 m×250 μm×0.25 μm)，載氣為高純氮氣(>99.999%)；柱流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度148.8 ℃；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min 升至70 ℃，保持15 min, 再以3.5 ℃/min 升至190 ℃，保持22 min；進樣體積1 μL；分流進樣，分流比30∶1。

1.2.9 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗

將誘變菌株于麥芽汁斜面培養(yǎng)基中連續(xù)15次傳代培養(yǎng)，挑取第1、5、15代菌株，通過1 L量筒發(fā)酵檢測其絮凝能力及其他各項性能的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP 誘變條件的確定

將出發(fā)株L-1培養(yǎng)至對數(shù)成長前中期，對其進行ARTP誘變并繪制致死曲線，結(jié)果如圖1所示。隨著誘變時長的增加，酵母細胞的致死率也隨之提高：誘變時間為40 s時，酵母細胞的致死率為90.9%，誘變時間為55 s時，酵母細胞的致死率為100%，因此選定40 s作為誘變的處理時間。

圖1 ARTP誘變L-1的致死率曲線Fig.1 Lethal curve of L-1 induced by ARTP

2.2 誘變菌株的篩選

2.2.1 弱絮凝性菌株的初篩

將出發(fā)株L-1進行ARTP誘變40 s后稀釋涂布于平板中(確保每個平板所長出來單菌落個數(shù)約為100個)。為獲得生長性能良好的誘變株，從平板上共近4 000個單菌落中挑選出630個形態(tài)較大且邊緣較為光滑的單菌落。此后將630株誘變株同出發(fā)株L-1分成15批次，置于大試管培養(yǎng)4 d后，對其絮凝能力進行檢測，所得絮凝值頻數(shù)分布結(jié)果如圖2所示。相比于L-1絮凝能力而言，有413株誘變株的絮凝能力未得到大幅度改變(增幅或降幅小于10%)，而所獲弱絮凝性誘變株個數(shù)較少，其中誘變株絮凝能力降幅大于5%的有82株，因此選擇此82株誘變株進入到后續(xù)的復篩過程中。

圖2 初篩菌株的絮凝值頻數(shù)分布圖Fig.2 Frequency distribution diagram of flocculation value of primary screening strains注：絮凝值比值=誘變株絮凝值/出發(fā)株L-1絮凝值

2.2.2 誘變菌株的第一輪復篩

因獲得的誘變菌株較多，且在初篩時未做平行，故將82株弱絮凝性初篩菌株進行第一輪復篩，同時增測死亡率這一指標。值得說明的是，在初篩中，培養(yǎng)4 d后各發(fā)酵液中CO2的累計排放量少，說明此時發(fā)酵液中仍有較多可發(fā)酵性糖未被消耗，基于此現(xiàn)象結(jié)合已有的文獻報道[19]，猜測這也許會導致初篩中絮凝能力指標的測定誤差較大。為此，在第一輪復篩中，將培養(yǎng)時間增至為7 d。

2.2.2.1 絮凝能力的測定

第一輪復篩實驗所測絮凝能力結(jié)果如圖3所示，同樣的，選擇絮凝能力降幅大于5%的誘變菌株進入到第二輪次復篩中，在第一輪復篩中，獲得了50株弱絮凝性第一輪復篩株。除菌株73外，大部分菌株絮凝能力相比于L-1降低了約6%～10%。

圖3 誘變菌株絮凝能力的第一輪復篩結(jié)果Fig.3 Flocculation ability of mutagenic strains in first re-screening

2.2.2.2 死亡率的測定

發(fā)酵結(jié)束時，將50株弱絮凝性第一輪復篩株酵母泥進行收集并測定其死亡率，結(jié)果如圖4所示。在大試管體系發(fā)酵中，大部分弱絮凝性第一輪復篩株的死亡率低于L-1，同時由于死亡率較高的菌株310在前階段發(fā)酵實驗中均表現(xiàn)出較好的發(fā)酵性能，考慮到實驗的誤差較大，為此選取死亡率降幅較大的35株弱絮凝性第一輪復篩株和菌株310，進行第二輪量筒復篩。

圖4 誘變菌株死亡率的第一輪復篩結(jié)果Fig.4 Mortality of mutagenic strains after first re-screening

2.2.3 誘變菌株的第二輪復篩

對獲得的36株弱絮凝性第一輪復篩株進行第二輪復篩，并在主酵結(jié)束時對酵母泥的絮凝能力、死亡率、發(fā)酵液中α-氨基氮、主要糖類及風味物質(zhì)的含量等指標進行檢測。由于菌株數(shù)目較多及發(fā)酵體系的擴大，采用三批次獨立的實驗來完成第二輪復篩。在三批次獨立的實驗中，由于第一批次發(fā)酵時長為9 d，考慮到發(fā)酵時間較長，在不改變絮凝能力等指標有效檢測時機條件下，將第二、三批二輪復篩主酵時長調(diào)為7 d。

2.2.3.1 絮凝能力的測定

在量筒發(fā)酵主酵結(jié)束時，對各菌株進行絮凝能力的檢測，各批次絮凝能力誤差較小，所得結(jié)果如圖5所示。在第二輪復篩中，36株第二輪復篩株的絮凝能力相比于L-1降低了2%～8%。

圖5 誘變菌株絮凝能力的第二輪復篩結(jié)果Fig.5 Flocculation ability of mutagenic strains in second re-screening

2.2.3.2 死亡率的測定

在量筒發(fā)酵主酵結(jié)束時，將36株弱絮凝性第二輪復篩株酵母泥進行收集并測定其死亡率，結(jié)果如圖6所示。L-1的死亡率為2.45%，相比于出發(fā)株，除了菌株310的死亡率(4.41%)有了較大幅度的提升以外，其余各誘變菌株的死亡率均有了不同程度的降低。

圖6 誘變菌株死亡率的第二輪復篩結(jié)果Fig.6 Mortality of mutagenic strain after second re-screening

2.2.3.3 α-氨基氮含量的測定

發(fā)酵液游離的α-氨基氮是影響啤酒中高級醇含量與啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，因此，啤酒酵母消耗α-氨基氮能力也是評價優(yōu)質(zhì)酵母的重要指標之一，為此通過測定主酵結(jié)束時發(fā)酵液中游離的α-氨基氮含量來判斷各菌株消耗α-氨基氮的能力。

在第二輪復篩時，對發(fā)酵液中α-氨基氮含量差異較大。在第一批主酵9 d時(圖7-a)，L-1發(fā)酵液中α-氨基氮含量為57.87 mg/L，菌株310發(fā)酵液中α-氨基氮含量為43.28 mg/L，相比于L-1降低了25.21%，說明菌株310消耗α-氨基氮的能力強于L-1。相比于第一批實驗，第二、三批主酵7 d時發(fā)酵液中的α-氨基氮含量均有了較大幅度的提升。在第二批二輪復篩中(圖7-b)，L-1發(fā)酵液中α-氨基氮含量為89.27 mg/L，菌株179發(fā)酵液中α-氨基氮含量為68.28 mg/L，相比于L-1降低了23.51%，說明菌株179消耗α-氨基氮的能力強于L-1。在第三批二輪復篩中(圖7-c)，L-1發(fā)酵液中α-氨基氮含量為88.2 mg/L，菌株450發(fā)酵液中α-氨基氮含量為121.3 mg/L，相比于L-1提高了37.53%，說明除菌株450外，其他各誘變株消耗α-氨基氮的能力均不弱于L-1。

a-第一批；b-第二批；c-第三批圖7 第二輪復篩α-氨基氮含量測定結(jié)果Fig.7 Determination results of α-amino nitrogen content in the second re-screening.

2.2.3.4 主要糖類含量的測定

啤酒酵母消耗碳源能力是評價優(yōu)質(zhì)酵母的重要指標之一。理論上在相同時間內(nèi)，消耗碳源能力越強的酵母，會產(chǎn)生更多乙醇。為此通過測定主酵結(jié)束時發(fā)酵液中主要糖類的含量來判斷各菌株消耗碳源的能力。

在第二輪復篩時，對發(fā)酵液中主要糖類的含量如圖8所示，同時由于在主酵7和9 d時，發(fā)酵液中的果糖及葡萄糖幾乎消耗完全，故未呈現(xiàn)。在第一批主酵9 d時，L-1發(fā)酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為10.89、11.09 g/L，低于各誘變株。菌株經(jīng)誘變后，碳源消耗能力不強于出發(fā)菌株L-1。在第二批主酵7 d時，L-1發(fā)酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為21.79、13.36 g/L，菌株179發(fā)酵液中的麥芽糖與麥芽三糖含量分別為19.52、10.95 g/L，由此可知菌株179消耗碳源的能力稍強于L-1。在第三批主酵7 d時，L-1發(fā)酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為26.66、14.35 g/L，菌株361發(fā)酵液中的麥芽糖與麥芽三糖含量分別為20.74、12.98 g/L，293的發(fā)酵液中麥芽糖與麥芽三糖含量分別為18.68、12.42 g/L，由此可知菌株293與361消耗碳源的能力稍強于L-1。

a-第一批；b-第二批；c-第三批圖8 第二輪復篩麥芽糖與麥芽三糖含量測定結(jié)果Fig.8 Content of maltose and maltotriose in the second re-screening

2.2.3.5 真正發(fā)酵度與酒精度的測定

主酵結(jié)束后測定了L-1及各誘變株的酒精度和真正發(fā)酵度，結(jié)果見表1～表3。

表1 第一批二輪復篩酒精度與真正發(fā)酵度測定結(jié)果Table 1 Alcohol content and true fermentation degree of the first batch of second re-screening

由表1可知，在第一批主酵9 d時，L-1酒精度為3.74%，真正發(fā)酵度為57.91%，以L-1為對照，除菌株25、571、692、672、7外，其余各誘變株的此兩項指標均有不同程度的提升，其中菌株7的基本發(fā)酵性能明顯弱于出發(fā)株L-1。

由表2可知，在第二批主酵7 d時，L-1酒精度為2.82%，真正發(fā)酵度為47.14%，以L-1為對照，菌株353、446、179、906此兩項指標均有不同程度的提升。

表2 第二批二輪復篩酒精度與真正發(fā)酵度測定結(jié)果Table 2 Alcohol content and true fermentation degree of the second batch of second re-screening

由表3可知，在第三批主酵7 d時，L-1酒精度為2.78%，真正發(fā)酵度為40.85%，以L-1為對照，除菌株450外，其余各誘變株的此兩項指標均有不同程度的提升。

表3 第三批二輪復篩酒精度與真正發(fā)酵度Table 3 Alcohol content and true fermentation degree of the third batch of second re-screening

2.2.3.6 風味物質(zhì)含量的測定

啤酒主酵結(jié)束后，檢測了各誘變株及L-1發(fā)酵液中主要的風味物質(zhì)。由表4可知，在第一批主酵7 d時，以L-1為對照，除菌株672與692外其余各突變株發(fā)酵液中的乙醛含量有了不小程度的提升，各主要高級醇含量變化差異不明顯。

表4 第一批二輪復篩各菌株主要風味物質(zhì) 單位：mg/L

由表5可知，在第二批主酵7 d時，菌株179發(fā)酵液中的乙醛與異戊醇等物質(zhì)含量均低于L-1。

表5 第二批二輪復篩各菌株主要風味物質(zhì) 單位：mg/L

由表6可知，在第三批主酵7 d時，菌株293、361發(fā)酵液中的乙醛含量明顯低于L-1，而主要高級醇含量無明顯變化。

表6 第三批二輪復篩各菌株主要風味物質(zhì) 單位：mg/L

2.3 目的菌株遺傳穩(wěn)定性實驗

在前階段初篩與二輪復篩實驗中，基于誘變菌株的絮凝能力、死亡率、消耗碳源與α-氨基氮能力、基本發(fā)酵能力以及對應(yīng)的發(fā)酵液中風味物質(zhì)的含量等一系列指標，挑選出了3株性能優(yōu)良的目的菌株進行遺傳穩(wěn)定性分析。如表7所示，隨著傳代次數(shù)的增加，目的菌株絮凝能力、死亡率及對應(yīng)的發(fā)酵液中主要風味物質(zhì)含量沒有太大的變化，表明了該3株目的菌株遺傳性能較為穩(wěn)定。

表7 目的菌株遺傳穩(wěn)定性分析實驗Table 7 The genetic stability analysis experiment of the target strain

3 結(jié)論

在啤酒行業(yè)中，良好絮凝能力的啤酒酵母決定著啤酒高質(zhì)量的生產(chǎn)。近年來，ARTP誘變育種在食品領(lǐng)域仍是較熱門的誘變育種方法。本研究以L-1為出發(fā)菌株對其進行ARTP誘變并獲得630株誘變株，結(jié)合優(yōu)化的絮凝能力檢測方法，通過大試管與1 L量筒體系進行初篩與第一、二輪次復篩，得到了179、293、361三株目的菌株，相比于出發(fā)菌株L-1，3株目的菌株絮凝能力分別降低了6.67%、6.67%和5.56%，死亡率分別降低了31.21%、34.57%和16.93%。同時其對應(yīng)發(fā)酵液中乙醛含量均有不同幅度的降低，降幅分別為19.53%、19.17%和15.83%，此外，3株目的菌株的基本發(fā)酵性能也有不同幅度的提升，其對應(yīng)的發(fā)酵液中高級醇含量變化不大，篩選出的菌株具有一定的實際應(yīng)用潛力。