鐘厚成 朱宇凡 楊敏 魏任雄

骨肉瘤是骨科最常見的原發(fā)實體惡性腫瘤之一，其發(fā)病有兩個高峰期，一個為青少年時期，另一個為老年期[1-2]。有研究表明，男性骨肉瘤的發(fā)病率是女性的1.27倍[3-4]。在20 世紀60 年代，骨肉瘤治療為單獨手術(shù)治療，術(shù)后1 年約90%的患者腫瘤復(fù)發(fā)，其中部分患者伴有骨肉瘤的肺部轉(zhuǎn)移。20世紀70年代，隨著輔助化療的引入，原發(fā)非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的5 年總生存率可達68%[3,5]，而轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的5 年總生存率不超過20%[6]，術(shù)后10 年生存率從30%上升至50%左右[1,7]。然而，自20 世紀90 年代以來，即便診療方法不斷改進，術(shù)后10年生存率也無明顯改善，而復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者的5年生存率仍低于28%[1,8]。鑒于骨肉瘤的治療現(xiàn)狀，為骨肉瘤患者尋找新的治療策略是必要和迫切的。

高三尖杉堿（homoharringtonine，HHT）是一種細胞毒性生物堿，可以抑制蛋白質(zhì)合成，HHT可以從三尖杉科植物或其同屬植物中提取分離，該藥已獲美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準，臨床可用于治療慢性粒細胞白血?。╟hronic myelocytic leukemia，CML）[9]，HHT 可以顯著促進CML 細胞的凋亡[10]。同時，根據(jù)目前研究，HHT 可以通過調(diào)控NF-κb 通路、HSP90 等對急性淋巴細胞白血病發(fā)揮治療作用[11-13]。在HHT相關(guān)的實體腫瘤研究中，其也表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤效果。如在三陰乳腺癌的研究中表明，HHT可以顯著抑制多種細胞系的體外生長能力，其動物實驗也進一步證實HHT在體內(nèi)也有良好的抗腫瘤效應(yīng)[14]。

化療包括中醫(yī)藥作為治療骨肉瘤的重要手段，在緩解骨肉瘤進展、延長患者生存期方面發(fā)揮作用，但是傳統(tǒng)的化療藥物由于不良反應(yīng)大及容易產(chǎn)生耐藥作用，嚴重限制了其臨床應(yīng)用[15]。因此，尋找新的骨肉瘤治療藥物、腫瘤的免疫治療及聯(lián)合用藥是目前研究的熱點[16]。在本研究中，筆者探究了高三尖杉酯堿的抗骨肉瘤細胞系143b、U2-OS的作用機制，研究HHT對骨肉瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等的影響，為骨肉瘤的化療提供更多的治療思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細胞株

高三尖杉酯堿（北京索萊寶科技有限公司），分子式為C29H39NO9，分子量為545.62，純度≥98%。人骨肉瘤細胞株143b和U2-OS（中國典型培養(yǎng)物保藏中心），CCK-8試劑盒（日本同仁生物科技有限公司），細胞凋亡試劑盒及細胞周期試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。PCR 引物（北京擎科生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

143b 細胞培養(yǎng)于含有1%雙抗（青霉素和鏈霉素）及10%胎牛血清（澳大利亞Gibco 公司）的RPMI-1640（美國Gibco公司）完全培養(yǎng)基中，U2-OS細胞培養(yǎng)于含有1%雙抗（青霉素和鏈霉素）及10%胎牛血清的M5A（美國Gibco公司）完全培養(yǎng)基中并置于普通細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，正常培養(yǎng)及傳代。

1.3 CCK-8實驗檢測細胞存活率

取對數(shù)期生長的細胞，根據(jù)培養(yǎng)時間接種不同數(shù)量的細胞密度，HHT 處理24 h 的接種5000 個/孔、處理48 h 的4000個/孔、處理72 h的3000個/孔的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，每孔加入不同濃度HHT處理，設(shè)置濃度梯度為0、10、20、50、100 ng/mL，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在24、48、72 h后取出，吸出培養(yǎng)液加入含10%CCK-8 的培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱，2 h 后使用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率計算公式：細胞存活率＝（實驗組吸光度值－空白對照組吸光度值）/（對照組吸光度值－空白對照組吸光度值）。

1.4 細胞集落實驗檢測細胞集落形成情況

取對數(shù)生長期的143b 細胞取500 個/孔接種于6 孔板、取對數(shù)生長期的U2-OS的2000個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)1 d后，加入不同濃度HHT，處理24 h后，PBS洗滌液繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d；PBS清洗4%多聚甲醛固定15 min后結(jié)晶紫染液染色，去盡染液、PBS清洗，干燥后拍照計數(shù)。

1.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移情況

取對數(shù)生長期的細胞以3×105/孔接種于6孔板，待細胞長滿后，然后用無菌移液器槍頭在6孔板每孔劃出4條平行線；吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入含有不同濃度HHT的1%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在0 h和24 h通過倒置顯微鏡拍攝計算細胞遷移率。計算公式：細胞劃痕愈合率＝（0 h劃痕寬度－培養(yǎng)后劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%；細胞遷移率＝實驗組劃痕愈合率/對照組劃痕愈合率。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲情況

在4℃條件下將Matrigel膠用無血清的細胞培養(yǎng)基稀釋至300 μL/mL，取100 μL 均勻涂抹一層于細胞培養(yǎng)池的PET膜上表面，然后將培養(yǎng)池輕輕放入24孔板孔內(nèi)，37℃放置3 h左右；取出于超凈工作臺過夜干燥。取對數(shù)生長期的細胞，取1×105/mL濃度的細胞200 μL加入上室；下室加入含不同濃度HHT的培養(yǎng)基500 μL，繼續(xù)在孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；將其下表面浸泡在4%多聚甲醛溶液中，固定30 min，PBS洗滌后用結(jié)晶紫染色，充分洗滌后通過倒置顯微鏡拍攝，并計算膜下表面的細胞數(shù)。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平及周期分布

取對數(shù)生長期的細胞，取2×105個細胞接種于6 孔板，待細胞貼壁后加入含不同濃度HHT的完全培養(yǎng)基，24 h后使用碧云天試劑盒檢測細胞凋亡水平及周期分布。

1.8 PCR驗證casp3和casp8表達

提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行qRT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄擴增檢測，應(yīng)用SYBR Green I熒光染料技術(shù)進行實時定量PCR反應(yīng)，獲取各組標準曲線，計算并分析結(jié)果值。引物序列如下，casp3 F：CTTGGCGAAATTCAAAGGATGG，R：CCCGGGTAAGAATGTGCATAA；casp8 F：AGAGATGGAGAAGAGGGTCAT，R：CAGCAGGCTCTTGTTGATTTG。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HHT對骨肉瘤細胞存活率的影響

分別在不同藥物濃度（0、10、20、50、100 ng/mL）下用CCK-8 檢測并計算細胞存活率，如圖1 所示，24 h 50%抑制濃度在50 ～100 ng/mL之間，72 h 50%抑制濃度在20 ～50 ng/mL 之間。與對照組相比，隨著濃度增大，HHT對骨肉瘤細胞的抑制效果增強，各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 CCK-8實驗：A.143b細胞經(jīng)過不同濃度（0、10、20、50、100 ng/mL）培養(yǎng)24、48、72 h后測量的細胞存活率；B.U2-OS細胞經(jīng)過不同濃度（0、10、20、50、100 ng/mL）培養(yǎng)24、48、72 h后測量的細胞存活率

2.2 HHT對骨肉瘤細胞集落形成的影響

通過細胞克隆實驗探討不同濃度HHT作用下骨肉瘤細胞系143b和U2-OS的集落形成的變化，如圖2所示，HHT可以減少143b 和U2-OS 的集落形成數(shù)目，且隨著HHT 濃度增大，形成的集落面積逐漸減小。如圖2A 所示，在143b中，當濃度為20 ng/mL時，克隆數(shù)目與對照組比值為69.92%±0.73%；當HHT 濃度為50 ng/mL 時，克隆數(shù)目與對照組比值為15.52%±1.36%；當HHT 濃度為100 ng/mL時，克隆數(shù)目與對照組比值為3.59%±0.26%。如圖2B 所示，在U2-OS 中，當濃度為20 ng/mL 時，克隆數(shù)目與對照組比值為41.24%±1.71%；當HHT 濃度為50 ng/mL 時，克隆數(shù)目與對照組比值為12.11%±1.24%；當HHT 濃度為100 ng/mL 時，克隆數(shù)目與對照組比值為3.30%±0.53%。隨著濃度增高，HHT對骨肉瘤細胞的集落形成抑制作用逐漸增強，表明HHT對骨肉瘤集落形成的抑制作用存在劑量相關(guān)性，各組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 集落形成實驗：A.143b集落形成實驗及定量分析；B.U2-OS集落形成實驗及定量分析，濃度分別為0、20、50、100 ng/mL

2.3 HHT對骨肉瘤細胞系的遷移能力的影響

通過劃痕實驗檢測骨肉瘤細胞系143b和U2-OS的遷移距離。如圖3 所示，在143b 和U2-OS 細胞的劃痕實驗中，對照組中可見143b 及U2-OS 細胞遷移率較實驗組遷移率高。隨著HHT濃度增加，骨肉瘤細胞遷移率逐漸減小。如圖3A所示，在143b中，當濃度為20 ng/mL時，遷移率與對照組比值為48.54%±4.59%；當HHT濃度為50 ng/mL時，遷移率與對照組比值為27.72%±1.81%；當HHT濃度為100 ng/mL時，遷移率與對照組比值為13.37%±0.95%。如圖3B所示，在U2-OS中，當濃度為20 ng/mL時，遷移率與對照組比值為81.16%±1.45%；當HHT濃度為50 ng/mL時，遷移率與對照組比值為24.35%±3.79%；當HHT 濃度為100 ng/mL 時，遷移率與對照組比值為6.52%±1.25%。隨著濃度增高，HHT 對骨肉瘤細胞的遷移能力抑制作用逐漸增強，表明HHT 對骨肉瘤遷移能力的抑制作用存在劑量相關(guān)性，各組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 劃痕實驗：A.143b劃痕實驗及對應(yīng)遷移率；B.U2-OS劃痕實驗及對應(yīng)遷移率

2.4 HHT對骨肉瘤細胞系侵襲能力的影響

通過Transwell 實驗檢測骨肉瘤細胞系143b 和U2-OS穿過Transwell 小室的細胞數(shù)目，如圖4 所示，隨著HHT濃度增加，細胞數(shù)目逐漸減少。如圖4A 所示，在143b中，當濃度為20 ng/mL 時，細胞數(shù)目與對照組比值為31.79%±2.60%；當HHT 濃度為50 ng/mL 時，細胞數(shù)目與對照組比值為10.18%±0.99%；當HHT濃度為100 ng/mL時，細胞數(shù)目與對照組比值為1.33%±0.23%。如圖4B所示，在U2-OS 中，當濃度為20 ng/mL 時，細胞數(shù)目與對照組比值為28.16%±4.71%；當HHT 濃度為50 ng/mL 時，細胞數(shù)目與對照組比值為6.58%±0.97%；當HHT濃度為100 ng/mL時，細胞數(shù)目與對照組比值為2.20%±0.38%。隨著濃度增高，HHT 對骨肉瘤細胞的侵襲能力抑制作用逐漸增強，表明HHT 對骨肉瘤侵襲能力的抑制作用存在劑量相關(guān)性，各組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 Transwell實驗：A.143b的Transwell實驗；B.U2-OS的Transwell實驗

2.5 HHT對骨肉瘤細胞凋亡水平和周期分布的影響

通過流式細胞技術(shù)檢測骨肉瘤細胞系143b和U2-OS的凋亡水平及周期分布，結(jié)果如圖5所示，HHT對143b細胞和U2-OS細胞的凋亡水平存在劑量相關(guān)性。如圖5A所示，HHT在0、20、50、100 ng/mL濃度下，143b對應(yīng)的凋亡率為5.57%±1.92%、19.74%±1.18%、27.92%±1.83%、59.15%±5.33%；如圖5B所示，HHT在0、20、50、100 ng/mL濃度下，U2-OS對應(yīng)的細胞凋亡率為7.97%±0.88%、16.16%±1.35%、21.85%±2.87%、34.76%±2.24%。隨著HHT 濃度增加，骨肉瘤細胞143b和U2-OS的凋亡率也增加，該差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。如圖5C和5D所示，HHT對143b和U2-OS的周期分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 流式細胞技術(shù)：A.143b凋亡實驗；B.U2-OS凋亡實驗；C.143b周期檢測；D.U2-OS周期檢測

2.6 HHT對骨肉瘤細胞中casp3和casp8表達的影響

為進一步探討HHT 對骨肉瘤細胞系作用的可能機制，筆者檢測了經(jīng)過HHT 處理后的骨肉瘤細胞系中casp3 和casp8 的表達差異。如圖6 所示，RT-qPCR 實驗結(jié)果證實，HHT 處理后的骨肉瘤細胞系中casp3 和casp8 的表達均增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖6 實時定量PCR實驗：A.不同濃度（0、20、50、100 ng/mL）HHT處理143b 24 h后casp3和casp8的相對表達量；B.不同濃度（0、20、50、100 ng/mL）HHT處理U2-OS 24 h后casp3和casp8的相對表達量

3 討論

骨肉瘤的治療需要根據(jù)骨肉瘤的分期和病理結(jié)果提示的惡性程度選擇治療方案，理想目標是根治或者大范圍切除腫瘤，盡可能保留肢體功能[2,17]。目前，較常應(yīng)用于骨肉瘤治療的化療藥物包括順鉑、多柔比星、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺等化療藥物及放療等手段，但是對骨肉瘤易耐藥或部分臨床療效差的問題仍未解決[7,18]。

自古以來，人們就認識到植物的治療特性，許多病理狀況已經(jīng)用植物來源的藥物進行了治療，這些藥物被用作混合物或濃縮的植物提取物，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)需要分離和純化一種或兩種活性化合物[19]。現(xiàn)有研究已證實，多種植物提取物可以在骨肉瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用，如左旋含羞草堿可以通過調(diào)控細胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白發(fā)揮對骨肉瘤細胞系MG-63和U2-OS的抗骨肉瘤作用[20]，也有研究表明黃豆苷元可以通過Src-ERK通路發(fā)揮抗骨肉瘤作用[21]。HHT 作為一種抗腫瘤藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床，在治療各型急慢性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征、急性粒細胞白血病中具有一定的治療效果[10-11,22]。通過現(xiàn)有研究表明，HHT對多種實體腫瘤也具有一定的抗腫瘤作用，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、黑色素瘤等[14,23-25]。而在黑色素瘤的研究中，HHT可以介導(dǎo)腫瘤細胞的DNA損傷、促進腫瘤細胞的凋亡等，同時，casp3的表達增高，與本研究結(jié)果相符[24]。

半胱天冬酶3（casp3）和半胱天冬酶8（casp8）是細胞凋亡中重要的蛋白酶，在細胞凋亡過程中casp3 和casp8被激活。而當腫瘤細胞暴露在細胞毒性物質(zhì)、射線及腫瘤的免疫治療中，casp3 和casp8 的激活可以促進細胞凋亡[26-28]。近年來，有研究報道在HER2 突變的乳腺癌中，HER2 通過下調(diào)casp3 和casp8 抑制腫瘤細胞的凋亡[29]?？偟膩碚f，針對casp3 和casp8 的治療，不僅可以提高如HCT、HT29 和MBA MD231 等腫瘤細胞放化療的敏感程度，也可以抑制其增殖和遷移能力等。本研究也證實HHT對骨肉瘤細胞系也存在抗腫瘤作用，可以促進casp3 和casp8的表達，抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移能力，誘導(dǎo)細胞的凋亡等。有研究表明，casp3可以通過多種作用機制影響腫瘤細胞的增殖凋亡，隨著放療劑量的增加，casp3的表達明顯增加，細胞凋亡明顯增加，casp3-/-的腫瘤細胞凋亡數(shù)目明顯下降，證實了casp3 在腫瘤凋亡中的重要作用[27]。同時，藥物之間的協(xié)同作用可以增強部分藥物的抗腫瘤效果。有研究證明，紫草素可以通過上調(diào)凋亡相關(guān)通路中casp3 及casp8 的表達，進而增強阿霉素對骨肉瘤細胞系U2-OS 及MG63 的抗腫瘤效果[30]。類似的，在本研究中，HHT 處理后的骨肉瘤細胞的casp3 及casp8 表達也明顯上調(diào)，同時凋亡比例隨著濃度增大而增大，表明HHT可能通過上調(diào)casp3及casp8通路進而導(dǎo)致骨肉瘤細胞凋亡。

本研究證實了HHT對骨肉瘤細胞系的抗腫瘤作用，但是由于缺乏動物實驗?zāi)Ｐ图昂笃谂R床的進一步驗證，該研究還存在一定的局限性。由于骨肉瘤的異質(zhì)性，在臨床的診斷和治療都具有一定的難度[31]，在本實驗中，由于使用的為骨肉瘤細胞系，實驗對象的異質(zhì)性與臨床患者具有一定差異，目前較為理想的解決方法為使用患者來源的移植瘤動物模型[32-33]。同時，由于本研究并未對細胞系進行測序，未全面研究HHT影響骨肉瘤細胞系的作用機制，僅探討了部分可能的作用機制。本研究表明HHT可以顯著抑制骨肉瘤細胞系的增殖、遷移、侵襲及克隆形成能力，與既往HHT在乳腺癌等實體瘤中具有相似的表型[14,23-25]。

綜上所述，研究證明高三尖杉酯堿可通過上調(diào)casp3及casp8 的表達，促進骨肉瘤細胞凋亡，抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等，提示高三尖杉酯堿可能是潛在的抗骨肉瘤藥物，可以為骨肉瘤治療提供新的思路。