韓濤 王陵 裴國清 李小康 郭征 石磊

距骨骨壞死是臨床上困擾外科醫(yī)生的一種慢性疾病，其病因多種多樣，目前認(rèn)為主要與創(chuàng)傷、飲酒、大劑量使用激素、特發(fā)性距骨壞死等因素相關(guān)，但其最主要的誘因還是創(chuàng)傷后距骨壞死[1-4]。雖然該病的發(fā)生率較低，但是一旦發(fā)生距骨壞死，可出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)疼痛，活動困難，隨著病情加重，最終可出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能喪失[5]。根據(jù)距骨壞死的不同分期，其治療方法各異，隨著距骨壞死程度的加重，療效的不確定性也隨之增加，因而對于距骨壞死的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療就顯得尤為重要[6]。目前對于早期距骨壞死，多采用髓芯減壓的方法，雖然取得了一定的療效，但是與股骨頭壞死治療研究相比，新型植入物對距骨壞死治療方面研究較少，特別是基于動物實驗的基礎(chǔ)研究更鮮有報道。因此，本研究依托課題組前期成功建立的羊距骨壞死模型[7]，在髓芯減壓的基礎(chǔ)上，置入微弧氧化改性的新型3D打印多孔鈦合金支撐棒，用以觀察其對于早期距骨骨壞死的修復(fù)情況，為其進一步臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所采用的3D打印多孔鈦合金支撐棒由沈陽中科院金屬研究所提供。該支撐棒為直徑4 mm、長度12 mm的多孔鈦合金圓柱狀棒體。支撐棒孔隙率約為50%，孔徑大小約為1 mm。

主要試劑：DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國Gibco 公司）、MTT（美國Sigma 公司）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）、PBS磷酸鹽緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）、堿性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

實驗動物：6 只新生SD 大鼠仔鼠用于原代細(xì)胞培養(yǎng)。6只雌性小尾寒羊用于距骨骨壞死模型建立，羊的平均年齡約20個月（18 ～26個月），平均體重約45 kg（42 ～52 kg）。所有實驗動物由西京醫(yī)院動物實驗中心提供，并嚴(yán)格遵守第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會關(guān)于實驗動物保護法的相關(guān)要求（實驗動物倫理批準(zhǔn)號：IACUC-20190305）。

1.2 實驗儀器

全自動顯微鏡（Leica-LA，德國Leica 公司），硬組織切片機（Leica1600，德國Leica 公司），Explore Locus SP型顯微CT（Healthcare，美國GE 公司），微弧氧化電源MAO-100（西安威思曼高壓電源有限公司），掃描電子顯微鏡（S-3400，日本HITACHI 公司），能譜分析儀（S-3400，日本HITACHI公司），超聲波清洗器（KQ250B，昆山舒美超聲儀器有限公司），X 射線衍射儀（XRD-7000，日本島津公司），醫(yī)用離心機（北京京立離心機有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 MAO改性后材料表面的理化性質(zhì)研究

將3D打印多孔鈦合金支撐棒依次用丙酮、乙醇、蒸餾水超聲各清洗10 min。在去離子水中加入CA 和β-GP，濃度為CA 0.2 mol/L，β-GP 0.04 mol/L 制成電解液，充分?jǐn)嚢韬蟠?。以Ti6Al4V合金試件為陽極，不銹鋼片為陰極，頻率200 Hz，占空比15%，在恒定350 V 電壓下脈沖-直流電源對試件進行微弧氧化改性，恒溫水浴，改性時間5 min，改性完成后依次用丙酮、無水乙醇、75%乙醇及去離子水超聲清洗15 min，干燥備用。隨后將經(jīng)MAO 改性的多孔鈦合金支撐棒置于真空條件下，采用電子顯微鏡觀察試件表面表層的結(jié)構(gòu)和形貌，并用電子顯微鏡自帶的能譜分析系統(tǒng)分析表面的化學(xué)元素組成，以X射線衍射儀分析其表面的晶像結(jié)構(gòu)。

1.3.2 大鼠成骨細(xì)胞在MAO改性3D打印多孔鈦合金支撐棒的體外生物學(xué)行為

將出生7 d的SD大鼠處死后，取顱蓋骨行原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲取大鼠成骨細(xì)胞。將成骨細(xì)胞分別接種于MAO 改性組支撐棒及對照組支撐棒。采用MTT法于接種后2、4、8 h 檢測細(xì)胞黏附情況，于1、4、7 d 后測定細(xì)胞的增殖情況，并于1、4、7 d 通過檢測成骨細(xì)胞ALP 活性來觀察成骨細(xì)胞的分化能力。

1.3.3 MAO改性3D打印多孔鈦合金支撐棒對羊距骨壞死的體內(nèi)修復(fù)研究

根據(jù)課題組前期研究，在羊后肢距骨內(nèi)側(cè)中心，加壓注射無水乙醇，4 周后可以建立早期雙側(cè)距骨壞死動物模型[7]。模型建立成功后，于左側(cè)踝關(guān)節(jié)距骨頭內(nèi)側(cè)面中心點為中心取直切口長約3 cm，切開皮膚、皮下組織和深筋膜顯露距骨頭，以4 mm直徑鉆頭垂直骨面鉆孔，深約14 mm，沖洗后置入實驗組MAO 改性多孔鈦合金內(nèi)植物，而后再次沖洗術(shù)區(qū)后逐層縫合傷口。以相同方法于右側(cè)距骨置入對照組多孔鈦合金內(nèi)植物，術(shù)畢[8]。術(shù)后3 d持續(xù)肌內(nèi)注射頭孢唑林鈉30 mg/kg。

術(shù)后12周，處死動物后取雙側(cè)距骨，行X線檢查，福爾馬林固定，行顯微CT檢測，以內(nèi)植物為中心5 mm為直徑的圓柱體作為顯微CT 的感興區(qū)，檢測骨體積分?jǐn)?shù)及骨小梁厚度。而后放入100%丙酮、2%戊二醛中，標(biāo)本經(jīng)逐次脫水、塑料包埋后，在Leica sp1600 型硬組織切片機上切成150 μm厚的切片，砂紙仔細(xì)打磨使切片最終磨成厚度約為30μm后超聲清洗，然后進行VG染色（Van-Gieson染色）。并采用與顯微CT相同感興區(qū)，檢測新生骨小梁分?jǐn)?shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAO改性后材料表面的理化性質(zhì)

掃描電鏡結(jié)果顯示，MAO改性后，在3D打印多孔鈦合金支撐棒孔架結(jié)構(gòu)表面形成了微米孔結(jié)構(gòu)，孔徑大約為2 μm，分布比較均勻，孔洞之間存在著一定的交通，形成了立體樣的孔隙結(jié)構(gòu)（見圖1A）。表面元素分析結(jié)果顯示，Ca、P、O元素被整合到MAO改性后的多孔鈦合金支撐棒表面膜層內(nèi)（見圖1B）。表面元素晶像結(jié)果顯示，MAO改性后表面Ti元素以TiO2形式存在于多孔鈦合金支撐棒表面，主要由金紅石型TiO2和銳鈦礦型TiO2組成（見圖1C）。

圖1 MAO改性后3D打印多孔鈦合金支撐棒表面理化性質(zhì)：A.電鏡下材料表面多孔形態(tài)（×8000）；B.材料表面元素分析結(jié)果；C.材料表面晶像分析結(jié)果

2.2 大鼠成骨細(xì)胞在MAO改性3D打印多孔鈦合金支撐棒上的黏附、增殖、分化能力

細(xì)胞在支撐棒上接種2、4 h后，MAO改性組和對照組之間細(xì)胞黏附計數(shù)之間無明顯區(qū)別（P＞0.05）；當(dāng)細(xì)胞在材料表面培養(yǎng)8 h后，細(xì)胞黏附計數(shù)MAO改性表面優(yōu)于對照組表面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞接種后1、4、7 d，在兩組材料表面均持續(xù)性增殖，分化能力也逐漸增高，同時在MAO 改性組各個時間點的細(xì)胞計數(shù)值均顯著優(yōu)于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但是MAO 改性組細(xì)胞分化能力在1、4 d 時與對照組無明顯差異，7 d時MAO 改性組細(xì)胞分化能力顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 成骨細(xì)胞在材料表面附著MTT吸光度值（n=6，±s）

表1 成骨細(xì)胞在材料表面附著MTT吸光度值（n=6，±s）

注：*與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

MAO改性組指標(biāo)時間點對照組0.041±0.0060.054±0.0070.081±0.009*0.084±0.009*0.151±0.013*0.214±0.019*0.051±0.0070.126±0.0160.198±0.023*黏附增殖分化2 h 4 h 8 h 1 d 4 d 7 d 1 d 4 d 7 d 0.038±0.0070.051±0.0080.067±0.0070.062±0.0070.114±0.0110.165±0.0130.052±0.0080.116±0.0120.155±0.018

2.3 MAO 改性3D 打印多孔鈦合金支撐棒對羊距骨壞死的修復(fù)研究

2.3.1 一般結(jié)果

術(shù)后所有實驗動物恢復(fù)良好，傷口無感染及壞死等并發(fā)癥。術(shù)后12 周處死實驗動物取材時，可見內(nèi)植物表面被新生骨質(zhì)包繞，周圍無炎性反應(yīng)及骨壞死發(fā)生。

2.3.2 X線結(jié)果

術(shù)后12周X線檢查提示雙側(cè)距骨支撐棒固定良好，無松動滑脫，支撐棒周圍可見骨質(zhì)包繞，兩者從X線上看無明顯差異（見圖2）。

圖2 術(shù)后12周時X線檢查結(jié)果：A.MAO改性組；B.對照組

2.3.3 Micro-CT結(jié)果

術(shù)后12 周時Micro-CT 結(jié)果顯示，兩組支撐棒對距骨壞死均有不同程度的修復(fù)作用，兩組支撐棒周圍和內(nèi)部均有不同程度的新生骨長入，MAO 改性組支撐棒的骨長入及骨修復(fù)能力更強，與對照組相比其周圍有更多的新生骨長入。從半定量分析中也可發(fā)現(xiàn)MAO 改性組的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）均優(yōu)于對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖3A、3B，表2）。

2.3.4 組織學(xué)檢測結(jié)果

術(shù)后12 周時組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，兩組支撐棒周圍和內(nèi)部均有不同程度的新生骨長入，MAO 改性組支撐棒與對照組相比其周圍有更多的新生骨長入。半定量分析結(jié)果顯示，MAO 改性組新生骨小梁分?jǐn)?shù)優(yōu)于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖3C、3D，表2）。

圖3 術(shù)后12周時Micro-CT和組織學(xué)切片結(jié)果：A.MAO改性組Micro-CT結(jié)果；B.對照組Micro-CT結(jié)果；C.MAO改性組組織學(xué)切片結(jié)果（×16）；D.對照組組織學(xué)切片結(jié)果（×16）

表2 兩組支撐棒Micro-CT和組織學(xué)結(jié)果半定量分析（n=3，± s）

表2 兩組支撐棒Micro-CT和組織學(xué)結(jié)果半定量分析（n=3，± s）

注：BV/TV為骨體積分?jǐn)?shù)，Tb.Th為骨小梁厚度。

P值0.020.030.04指標(biāo)BV/TV（%）Tb.Th（mm）新生骨小梁分?jǐn)?shù)MAO改性組83.54±7.140.58±0.070.452±0.062對照組62.32±6.510.41±0.060.317±0.051 t值3.753.192.91

3 討論

距骨是踝關(guān)節(jié)的重要組成部分，一旦發(fā)生壞死將會造成踝關(guān)節(jié)疼痛、畸形、活動受限，嚴(yán)重影響踝關(guān)節(jié)的功能。創(chuàng)傷并發(fā)距骨骨折是引起距骨壞死最主要的原因，約75%的距骨壞死由創(chuàng)傷引起，同時隨著距骨骨折的Hawkins 分型的提高，距骨壞死的發(fā)生率也逐漸增高[9-10]。

由于非創(chuàng)傷因素引起的距骨壞死發(fā)生率較低，其發(fā)生隱匿，發(fā)病呈漸進性，因而治療更加困難。目前對于距骨骨壞死的治療主要包括保守治療和手術(shù)治療。保守治療主要是通過休息、理療、藥物、高壓氧及功能鍛煉，以期改善距骨血運，阻止或減緩距骨壞死，但整體效果有限。對于手術(shù)治療而言，可以采取髓芯減壓、骨瓣移植、關(guān)節(jié)融合、關(guān)節(jié)置換等常規(guī)手術(shù)方式[11]，以及近年來興起的3D打印距骨置換[12]，不同手術(shù)方式治療距骨壞死的手術(shù)效果各家報道不一，目前還沒有定論。對于早期距骨壞死的患者，髓芯減壓這種簡單易行的方法取得了一定的療效[13-15]，減壓后患者的早期功能鍛煉有利于距骨的血供恢復(fù)，但是由于距骨內(nèi)部缺乏足夠強度的支撐，可能會造成骨小梁斷裂，從而導(dǎo)致距骨軟骨塌陷。為了減少這種情況，有學(xué)者開始嘗試髓芯減壓后，置入內(nèi)植物來提高距骨局部強度，減少距骨軟骨面的塌陷，取得了比較滿意的效果[16]。

以前關(guān)于距骨壞死的基礎(chǔ)研究比較少，主要原因是與成熟的股骨頭壞死的動物模型比較[17-18]，距骨壞死沒有穩(wěn)定的動物模型建立方法。本課題組借鑒無水乙醇注入建立股骨頭壞死模型的方法，通過改良此方法已經(jīng)成功建立了羊距骨壞死的動物模型，之所以選擇羊作為實驗動物，主要是因為羊距骨的解剖形態(tài)及運動過程中的受力情況與人類距骨更為接近[7,19]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)隨著模型建立時間的延長，可以有效模擬距骨壞死早期到中晚期的病理變化過程，為后續(xù)距骨壞死的研究提供基礎(chǔ)[7]。本研究在此動物模型的基礎(chǔ)上，選取模型建立后4 周，即模擬距骨壞死早期時的情況，通過對新型3D打印多孔鈦合金支撐棒進行微弧氧化改性，進一步提高支撐棒的生物學(xué)性能，以期能夠在早期距骨壞死的治療中發(fā)揮更好的作用。

本研究是課題組前期利用3D打印多孔鈦合金支撐棒治療羊距骨壞死的序貫性研究，通過前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于早期距骨壞死，支撐棒的置入可以有效改善距骨壞死之后骨壞死和骨吸收的進程，促進局部骨的改建和修復(fù)，對于距骨壞死的治療有著積極的作用[8]。同時課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)疏松條件下，通過微弧氧化改性的椎弓根釘可以有效提高螺釘與周圍骨質(zhì)的結(jié)合強度，促進螺釘周圍的骨質(zhì)生長，提高螺釘?shù)姆€(wěn)定性[20]。由于骨壞死和骨質(zhì)疏松在一定程度上都存在骨量減少的特性，因此在骨壞死的條件下，微弧氧化表面改性3D打印多孔鈦合金支撐棒理論上可以提高其對周圍骨修復(fù)和骨長入的能力，延緩骨壞死的進程，改善骨壞死的治療效果。

本研究的體外細(xì)胞實驗結(jié)果表明，3D打印多孔鈦合金支撐棒具有良好的生物學(xué)相容性，大鼠成骨細(xì)胞在其表面均可以很好地黏附、增殖、分化，同時MAO 改性組在黏附、增殖、分化能力上均不同程度優(yōu)于對照組，體現(xiàn)出更好的生物學(xué)性能。類似的結(jié)果在羊體內(nèi)動物實驗中也得到了證實，在支撐棒置入12周時，Micro-CT檢測結(jié)果提示骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度MAO 改性組均優(yōu)于對照組，同時硬組織切片結(jié)果也顯示，更多的新生骨及更好的骨接觸情況發(fā)生在MAO改性組，表明微弧氧化改性優(yōu)化了3D打印多孔鈦合金支撐棒的生物學(xué)性能，更有利于骨的長入和修復(fù)。優(yōu)化的多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的長入[21]，本研究使用的支撐棒孔隙率約為70%，該支撐棒抗壓強度36.36 MPa，明顯高于松質(zhì)骨的抗壓縮強度，彈性模量約為2.2 GPa，與松質(zhì)骨彈性模量接近[22]。在保證支撐棒強度的前提下，降低支撐棒的彈性模量，減少由于支撐置入所帶來的的應(yīng)力遮擋效應(yīng)，有利于支撐棒周圍的骨質(zhì)生長。在此基礎(chǔ)上對多孔鈦合金支撐棒進行微弧氧化改性，使得在毫米級的多孔上復(fù)合了微米級的小孔，形成了“毫米—微米”級的復(fù)合結(jié)構(gòu)。這種新型的復(fù)合結(jié)構(gòu)一方面增加了支撐棒的表面積，增大了其與周圍組織的接觸面積；另一方面增大了支撐棒表面的粗糙度，從而提高了周圍細(xì)胞與支撐棒的黏附及增殖能力，增加了內(nèi)植骨的穩(wěn)定性及支撐強度[23]。與此同時，微弧氧化改性之后，支撐棒的表面融入了Ca、P、O 元素，提高了支撐棒表面的生物活性[24]，改善了支撐棒的生物相容性，促進周圍骨質(zhì)的生長和改建，使得支撐棒與周圍骨質(zhì)更好地發(fā)生整合，進一步提高了其穩(wěn)定性。

綜上，仿生的3D打印多孔結(jié)構(gòu)為支撐棒提供了優(yōu)良的力學(xué)性能，微弧氧化表面改性進一步提高了支撐棒的生物活性，使其在治療羊距骨早期骨壞死過程中充分發(fā)揮了力學(xué)和生物學(xué)的優(yōu)勢，取得了滿意的效果。這一探索性研究為距骨壞死的治療提供了新的思路，為其進一步應(yīng)用于臨床提供了堅實的實驗基礎(chǔ)。但本研究只是一個初步的、探索性的研究，因而存在體內(nèi)實驗研究動物數(shù)量較少、時間點較少、體外實驗未能進行機制方面的深入探討等不足。僅僅是觀察了MAO處理3D打印多孔鈦合金支撐棒在骨壞死條件下，其可以有效促進成骨細(xì)胞的生長，有利于內(nèi)植物周圍的壞死骨的改建修復(fù)的現(xiàn)象。下一步研究中，將會重點關(guān)注MAO 處理多孔鈦合金對促進成骨細(xì)胞增殖、分化的機制，以及破骨細(xì)胞在這一過程中發(fā)揮的作用。