0 引言

結直腸癌是我國常見的一種惡性腫瘤,雖然結直腸癌診斷與治療技術有所提高,但中晚期結直腸癌患者預后較差,因而仍需探究結直腸癌發(fā)生及發(fā)展的分子機制

.環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)在結直腸癌中表達異常,并可發(fā)揮重要調(diào)控作用

.circ_0000527在骨肉瘤組織中高表達,上調(diào)其表達可促進骨肉瘤細胞的增殖

.Circular RNA Interactome預測顯示circ_0000527與miR-1253存在互補序列.研究表明

,miR-1253在結直腸癌組織和細胞中表達下調(diào),抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲.因此,本研究主要探討circ_0000527是否通過靶向調(diào)控miR-1253表達影響結直腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲.

綜合考慮后，湯國安等[11]設計了一種借助ArcGIS軟件，利用歐氏區(qū)域分配提取面狀河流中軸線的方法，該方法所提取的中軸線連續(xù)、光滑，且與相鄰的線狀支流保持有拓撲關系。但該方法在實際應用中存在一些局限性，對于較大的水系其面狀河流的長寬比往往很大，河流最窄處的寬度相對于河流的長度非常小，因而在歐氏距離變換前選取變換分辨率時很難同時兼顧。實際提取運算中會出現(xiàn)無法有效柵格化面狀河流邊界線的情況最終導致方法失效的問題，在實際運用受到了較大限制。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2020-03/2020-08本院收治的經(jīng)病理學診斷確診為41例結直腸癌患者,癌組織及其癌旁組織標本,置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存.女20例,男21例,年齡(50-68)歲,平均年齡(56.32±4.19)歲.

人結直腸癌細胞SW620(美國ATCC);Trizol試劑、Lipofectamine? 3000轉染試劑(美國Invitrogen);反轉錄與熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化);si-NC、sicirc_0000527、miR-NC、miR-1253 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0000527、anti-miR-NC、anti-miR-1253(上海吉瑪);CCK-8試劑盒(北京索萊寶); Matrigel基質膠(美國BD);Transwell小室(美國Corning);兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗體、GAPDH(美國Abcam);二抗(北京中杉金橋生物).

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:將miR-NC、miR-1253 mimics、si-NC、si-circ_0000527分別轉染至SW620細胞,分別記為miRNC組、miR-1253組、si-NC組、si-circ_0000527組.采用脂質體轉染法將si-circ_0000527和anti-miR-NC、si-circ_0000527和anti-miR-1253分別共轉染至SW620細胞,分別記為si-circ_0000527+anti-miR-NC組、sicirc_0000527+anti-miR-1253組.

1.2.2 qRT-PCR檢測circ_0000527、miR-1253的表達水平:采用Trizol試劑分別提取癌旁組織、結直腸癌組織與SW620細胞總RNA.應用紫外分光光度計測定RNA濃度.反轉錄合成cDNA.qRT-PCR擴增反應體系:cDNA 2 μL,Real-Time Master Mix 10 μL,正反向引物各1 μL,RNase-Free ddH

O補足體系至20 μL;反應條件:95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s(循環(huán)40次).應用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測circ_0000527、miR-1253相對表達量.

液體冷卻介質對不同溫度下玉米種子發(fā)芽率有較大影響。在6種溫度下，利用液體冷卻介質處理玉米種子3 d，X1，F(xiàn)6，S10和H4的4 d平均發(fā)芽率較未處理的對照組發(fā)芽率分別有所下降，H1和K17的4d平均發(fā)芽率均高于對照組，除-25℃處理外，其余溫度處理的S10發(fā)芽率均低于對照組發(fā)芽率（見圖1）。S23，H1及K16經(jīng)6種溫度液體冷卻介質處理后的7 d平均發(fā)芽率均明顯高于對照組，F(xiàn)6號和S23在-10℃液體冷卻介質處理后發(fā)芽率最高，其余則是在-20～-30℃經(jīng)液體冷卻介質處理后達到最高（見圖2）。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖:各組SW620細胞接種于96孔板,每孔加CCK-8 10 μL,培養(yǎng)2 h,應用酶標儀檢測各孔在450 nm處的光密度值(OD).

1.2.4 平板克隆形成實驗:取各組SW620細胞接種于6孔板(500個/孔),于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)直至出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆團,每隔2 d更換一次培養(yǎng)基,棄培養(yǎng)基,預冷PBS洗滌,加入500 μL甲醇固定20 min,加入400 μL 1%結晶紫染色液染色15 min,蒸餾水洗滌后晾干,拍照并觀察細胞克隆形成數(shù).

1.2.5 劃痕實驗:收集各組SW620細胞接種于6孔板(2×10

個/孔),于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)直至細胞長滿,用200 μL移液槍槍頭在細胞單層劃一道痕,于顯微鏡下拍照并記錄(0 h),于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出6孔板后再次于顯微鏡下拍照,應用ImageJ軟件檢測各組細胞遷移距離并計算細胞劃痕愈合率[0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度×100%].

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲:取Matrigel基質膠稀釋液加入小室的上室(40 μL/孔),于培養(yǎng)箱內(nèi)固定5 h,收集各組SW620細胞接種于上室(1×10

個/孔),下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,棄培養(yǎng)液,PBS洗滌,加入500 μL 4%多聚甲醛固定20 min,1%結晶紫染色液染色10 min,PBS洗滌后晾干,于顯微鏡下統(tǒng)計侵襲細胞數(shù).

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0000527與miR-1253的靶向關系:美國Promega公司構建野生型載體WT-circ_0000527和缺失miR-1253結合區(qū)域的突變型載體MUT-circ_0000527,采用脂質體轉染法將miR-NC/WT-circ_0000527、miR-NC/MUT-circ_0000527、miR-1253 mimics/WT-circ_0000527、miR-1253 mimics/MUTcirc_0000527共轉染至SW620細胞,培養(yǎng)24 h后收集細胞并檢測細胞相對熒光素酶活性.采用脂質體轉染法將pcDNA、pcDNA-circ_0000527、si-NC、si-circ_0000527分別轉染至SW620細胞,培養(yǎng)48 h后收集細胞,用qRTPCR法檢測miR-1253的表達量.

1.2.8 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達量:PBS洗滌各組SW620細胞后加入400 μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白,采用BCA法檢測蛋白濃度.每孔道加入40 μg蛋白進行SDS-PAGE,將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜,用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h,分別加入E-cadherin(1:1000)、N-cadherin(1:1000)一抗與內(nèi)參GAPDH抗體(1:2000)稀釋液,4 ℃孵育24 h,TBST洗滌,加入1:3000稀釋的二抗后,37 ℃孵育2 h,滴加ECL,暗室內(nèi)曝光顯影,應用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量.

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以(mean±SD)表示,兩組間比較采用獨立樣本

檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較可用LSD檢驗,以

＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

段文瀚解釋說，第一個“綠色”之所以叫“綠色礦山”，是因為云天化采用最先進、效率最高的開采技術，極大提高了對磷礦石的利用率，做到了對資源的充分利用和循環(huán)利用。除此之外，云南的磷礦大都是膠磷礦，雜質含量較多，這就需要采用先進的浮選技術對膠磷礦進行加工，使其更干凈、有害因子更少。同時，礦產(chǎn)開采完之后，云天化還會對土壤進行回填，利用先進技術進行浮土植被的種植。浮土植被的種植聽起來簡單，實際上對技術有很高的要求，前期投入巨大。據(jù)段文瀚介紹，上個世紀80年代至今，云天化單是復墾植被，恢復綠色的投入就將近10億元，目的就是希望從源頭支撐整個綠色發(fā)展理念的運行。

2 結果

2.1 circ_0000527和miR-1253在結直腸癌組織中的表達結直腸癌組織中circ_0000527的表達量高于癌旁組織(

＜0.05),miR-1253的表達量低于癌旁組織(

＜0.05),表1.

2.3 干擾circ_0000527表達對結直腸癌SW620細胞遷移、侵襲的影響 轉染si-circ_0000527可降低劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù),促進E-cadherin表達,抑制N-cadherin表達(

＜0.05),見圖2、表3.

2.4 circ_0000527靶向調(diào)控miR-1253的表達 circ_0000527序列中與miR-1253存在互補核苷酸序列,圖3.與miR-NC組相比,miR-1253降低WT-circ_0000527熒光素酶活性(

＜0.05),表4.circ_0000527可負向調(diào)節(jié)miR-1253表達(

＜0.05),表5.

綜上所述，國內(nèi)尿素走勢并不如意，開工率下滑利好不斷被業(yè)內(nèi)炒作，或已透支；所謂的印度招標利好也不及預期。不可否認，當前行業(yè)低開工局面確實給低庫存或零庫存的尿素企業(yè)提供了挺價籌碼，但內(nèi)需疲軟，暫時不允許工廠去考慮“貨緊價揚”。換而言之，或許淡儲期間的供應量不及往年水平，下游經(jīng)銷商庫存量偏低，但并不能改變此時下游對高價尿素的不認可。當然，不排除眾多經(jīng)銷商在本輪尿素跌價期間等待新的抄底機會，但相應心理價位仍需進一步博弈。預計11月底，國內(nèi)尿素主產(chǎn)區(qū)報價2000元/噸左右。

1.2 Stroop色詞測試 其由Stroop[8]編制，是廣泛運用的視覺任務研究執(zhí)行功能的典范之一。測試包括卡片A、B、C，卡片A寫上黑色的隨機排列的紅、綠、黃、藍；卡片B采用4種不同于字的顏色寫上紅、綠、黃、藍；卡片C采用紅、綠、黃、藍色圓點。進行不同的測查完成所需的時間進行評分。該測驗反映認知控制、目標保持以及在不熟悉刺激中習慣性應答的抑制能力。

2.5 miR-1253過表達對結直腸癌SW620細胞增殖、遷移、侵襲的影響 轉染miR-1253 mimics可減弱SW620細胞OD值、克隆形成、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù),并可促進E-cadherin表達,抑制N-cadherin表達(

＜0.05),圖4、表6.

3 討論

circRNA是通過反向剪接形成的一種閉合環(huán)狀結構,其不易被核酸外切酶降解,circRNA具有穩(wěn)定性與保守性,circRNA可調(diào)控結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為

.circRNA與miRNA競爭性結合而調(diào)控基因表達從而參與結直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程,并可能作為結直腸癌靶向治療的潛在靶點

.

本研究結果顯示,結直腸癌組織中circ_0000527的表達量上升.circ_0000527在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織和細胞中高表達,過表達circ_0000527可促進視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制細胞凋亡

.circ_0000527在視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中表達上調(diào),并可通過充當miR-646的海綿分子而促進BCL-2表達從而促進視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞增殖、遷移及侵襲

.本研究結果顯示,干擾circ_0000527表達可降低結直腸癌細胞活力,細胞克隆形成數(shù)減少,提示干擾circ_0000527可抑制結直腸癌細胞增殖及克隆形成.間充質細胞標志物N-cadherin與上皮細胞標志物E-cadherin是上皮-間質轉化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的主要標志物,EMT轉化可促使遷移及侵襲發(fā)生

.本研究結果顯示,干擾circ_0000527可降低結直腸癌細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù),并可下調(diào)N-cadherin表達,上調(diào)E-cadherin表達,提示干擾circ_0000527表達可抑制結直腸癌細胞遷移及侵襲,其作用機制與調(diào)節(jié)EMT有關.

Circular RNA Interactome預測顯示circ_0000527與miR-1253可能存在靶向調(diào)控關系,miR-1253在結直腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用,circ_0000527/miR-1253軸是否可參與結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程尚需進一步闡明.

由于我國行政事業(yè)單位財務缺乏管理,易造成預算編制的不科學不合理，出現(xiàn)多預算或者少預算情況，同時，也容易造成資金去向不明，其對于人民而言都是不負責任的行為。

4 結論

綜上所述,circ_0000527可競爭性結合miR-1253,干擾circ_0000527表達可通過上調(diào)miR-1253表達而抑制結直腸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲,circ_0000527/miR-1253分子軸在結直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用.

2.2 干擾circ_0000527表達對結直腸癌SW620細胞增殖的影響 轉染si-circ_0000527可降低細胞增殖、克隆形成能力(

＜0.05),見圖1、表2.

可以看出，不同粗糙度下材料表面的BRDF在鏡反射方向出現(xiàn)峰值，且隨著表面粗糙度增大，鏡反射方向附近BRDF峰形由陡峭逐漸趨于平緩。說明隨著粗糙度的增大，漫反射占反射能量的比重增加，鏡反射特性減弱，這是由于當表面粗糙度較小時，多數(shù)光子被直接反射到鏡反射方向及其附近區(qū)域，表現(xiàn)出較強的鏡反射；當表面粗糙度較大時，光子在粗糙表面會經(jīng)歷多次散射，導致鏡反射特征減弱，漫反射特性增強。

circRNA可參與結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程,可作為結直腸癌診斷、治療靶點,并調(diào)控miRNA表達進而調(diào)節(jié)結直腸癌細胞生物學行為,目前circ_0000527對結直腸癌細胞生物學行為的影響尚未可知.

干擾同阻滯一樣，可發(fā)生在心臟傳導系統(tǒng)的不同層面——可發(fā)生在一個層面，也可同時發(fā)生于數(shù)個層面;根據(jù)程度也可分為一度、二度、高度和三度。如果干擾僅發(fā)生于一個心搏，則稱為干擾現(xiàn)象；如連續(xù)發(fā)生于3個心搏以上，則稱為干擾性脫節(jié)(圖6)。干擾的心電圖表現(xiàn)有時可見;有時也呈隱匿性，此時稱為隱匿性傳導;有時干擾還可引起一次新的干擾，從而使心電圖表現(xiàn)復雜化。

本研究證實circ_0000527與miR-1253存在靶向調(diào)控作用,circ_0000527可通過吸附miR-1253而發(fā)揮作用.研究表明

,miR-1253在非小細胞肺癌組織中下調(diào)表達,上調(diào)其表達可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲.miR-1253在非小細胞肺癌中表達水平降低,上調(diào)其表達可抑制非小細胞肺癌細胞增殖及轉移

.miR-1253過表達可抑制乳腺癌細胞生長

.本研究結果顯示,結直腸癌組織中miR-1253的表達量低于癌旁組織,下調(diào)miR-1253表達可降低干擾circ_0000527表達對結直腸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用.提示circ_0000527可通過負向調(diào)控miR-1253表達影響結直腸癌細胞結直腸癌的發(fā)展進程.

2.6 下調(diào)miR-1253表達逆轉了干擾circ_0000527表達對結直腸癌SW620細胞增殖、遷移、侵襲的作用 共轉染si-circ_0000527、anti-miR-1253可逆轉si-circ_0000527對SW620細胞生物學行為的作用(

＜0.05),見圖5、表7.

circ_0000527通過靶向調(diào)控miR-1253表達影響結直腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲.

綜上所述，隨著媒介融合時代的到來，新聞受眾和新聞生產(chǎn)者之間的界限變得越來越模糊，這一現(xiàn)象的存在不僅僅給新聞編輯帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)，同時也是一種機遇。要想更好地抓住這次機遇和應對這些挑戰(zhàn)，要求新聞編輯準確地做好自我定位，不斷提升自身素養(yǎng)，努力成為媒體融合時代中合格且優(yōu)秀的傳媒人才。

即把不在園林空間中的元素包含到園林空間中來，使得園林意境更添一份深意。由于園林建造在城市中，園林的場地是很有局限性的，要通過滲透和延伸園林空間來豐富園林空間和意境。借景的方法主要有近借、遠借、互借等［2］。

qRT-PCR法檢測結直腸癌患者的癌組織及其癌旁組織標本中circ_0000527、miR-1253的表達量;將人結直腸癌細胞SW620分為si-NC組、si-circ_0000527組、miR-NC組、miR-1253組、si-circ_0000527+anti-miR-NC組、sicirc_0000527+anti-miR-1253組;CCK-8、平板克隆形成、劃痕實驗、Transwell實驗檢測增殖、克隆形成、遷移和侵襲;雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0000527與miR-1253靶向.

結直腸癌組織中circ_0000527上調(diào)表達,miR-1253下調(diào)表達,抑制circ_0000527或miR-1253過表達可減弱細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力,證實circ_0000527可靶向調(diào)控miR-1253表達,下調(diào)miR-1253表達可減弱抑制circ_0000527表達對細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力的抑制作用.

circ_0000527表達可通過抑制miR-1253表達而促進結直腸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲.

circ_0000527/miR-1253可能作為結直腸癌分子靶向治療的潛在靶點.

1 Xu H,Liu Y,Cheng P,Wang C,Liu Y,Zhou W,Xu Y,Ji G.CircRNA_0000392 promotes colorectal cancer progression through the miR-193a-5p/PIK3R3/AKT axis.

2020;39:283 [PMID:33317596 DOI:10.1186/s13046-020-01799-1]

2 Chen LY,Wang L,Ren YX,Pang Z,Liu Y,Sun XD,Tu J,Zhi Z,Qin Y,Sun LN,Li JM.The circular RNA circ-ERBIN promotes growth and metastasis of colorectal cancer by miR-125a-5p and miR-138-5p/4EBP-1 mediated cap-independent HIF-1α translation.

2020;19:164 [PMID:33225938 DOI:10.1186/s12943-020-01272-9]

3 Li C,Zhou H.Circular RNA hsa_circRNA_102209 promotes the growth and metastasis of colorectal cancer through miR-761-mediated Ras and Rab interactor 1 signaling.

2020;9:6710-6725 [PMID:32706154 DOI:10.1002/cam4.3332]

4 Wu M,Kong C,Cai M,Huang W,Chen Y,Wang B,Liu X.Hsa_circRNA_002144 promotes growth and metastasis of colorectal cancer through regulating miR-615-5p/LARP1/mTOR pathway.

2021;42:601-610 [PMID:33347535 DOI:10.1093/carcin/bgaa140]

5 Wu X,Yan L,Liu Y,Shang L.Circ_0000527 promotes osteosarcoma cell progression through modulating miR-646/ARL2 axis.

2021;13:6091-6102 [PMID:33617480 DOI:10.18632/aging.202602]

6 Yang D,Zhang D.miR-1253,a novel tumor suppressor gene in colon cancer,is associated with poor patients prognosis.

2021;21:563-571 [PMID:33837882 DOI:10.1007/s10238-021-00706-y]

7 Deng Q,Wang CJ,Hao R,Yang QY.Circ_0001982 accelerates the progression of colorectal cancer via sponging microRNA-144.

2021;25:2458 [PMID:33829421 DOI:10.26355/eurrev_202103_25394]

8 Li H,Jin X,Liu B,Zhang P,Chen W,Li Q.CircRNA CBL.11 suppresses cell proliferation by sponging miR-6778-5p in colorectal cancer.

2019;19:826 [PMID:31438886 DOI:10.1186/s12885-019-6017-2]

9 Li Z,Yao H,Wang S,Li G,Gu X.CircTADA2A suppresses the progression of colorectal cancer via miR-374a-3p/KLF14 axis.

2020;39:160 [PMID:32799891 DOI:10.1186/s13046-020-01642-7]

10 Yu B,Zhao J,Dong Y.Circ_0000527 Promotes Retinoblastoma Progression through Modulating miR-98-5p/XIAP Pathway.

2021;46:1414-1423 [PMID:33629639 DOI:10.1080/02713683.2021.1891255]

11 Zhang L,Wu J,Li Y,Jiang Y,Wang L,Chen Y,Lv Y,Zou Y,Ding X.Circ_0000527 promotes the progression of retinoblastoma by regulating miR-646/LRP6 axis.

2020;20:301 [PMID:32669977 DOI:10.1186/s12935-020-01396-4]

12 Chen NN,Chao DL,Li XG.Circular RNA has_circ_0000527 participates in proliferation,invasion and migration of retinoblastoma cells via miR-646/BCL-2 axis.

2020;38:1036-1046 [PMID:32266733 DOI:10.1002/cbf.3535]

13 Xing Y,Jing H,Zhang Y,Suo J,Qian M.MicroRNA-141-3p affected proliferation,chemosensitivity,migration and invasion of colorectal cancer cells by targeting EGFR.

2020;118:105643 [PMID:31704502 DOI:10.1016/j.biocel.2019.105643]

14 Liu M,Zhang Y,Zhang J,Cai H,Zhang C,Yang Z,Niu Y,Wang H,Wei X,Wang W,Gao P,Li H,Zhang J,Sun G.MicroRNA-1253 suppresses cell proliferation and invasion of non-small-cell lung carcinoma by targeting WNT5A.

2018;9:189 [PMID:29415994 DOI:10.1038/s41419-017-0218-x]

15 Li L,Wan K,Xiong L,Liang S,Tou F,Guo S.CircRNA hsa_circ_0087862 Acts as an Oncogene in Non-Small Cell Lung Cancer by Targeting miR-1253/RAB3D Axis.

2020;13:2873-2886 [PMID:32308420 DOI:10.2147/OTT.S243533]

16 Ding X,Zheng J,Cao M.Circ_0004771 Accelerates Cell Carcinogenic Phenotypes via Suppressing miR-1253-Mediated DDAH1 Inhibition in Breast Cancer.

2021;13:1-11 [PMID:33442289 DOI:10.2147/CMAR.S273783]