寧易平,牟 莉,李 柯

寧易平,李柯,麗水市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 浙江省麗水市 323000

牟莉,麗水市人民醫(yī)院急診外科 浙江省麗水市 323000

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種常見的急腹癥,分為輕癥AP(約占80%以上)和重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)(約占20%).其中,SAP發(fā)作時引起的炎性風(fēng)暴可造成胰腺壞死和多器官衰竭.目前,盡管對SAP的治療取得了很大改善,但據(jù)報道與此疾病相關(guān)的死亡率仍高達20%.SAP的發(fā)病機制一直是許多研究的重點.目前,氧化應(yīng)激、促炎細胞因子的過度釋放、鈣過載和自噬失調(diào)被認為是導(dǎo)致SAP病理的主要機制.特別是,炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激在SAP的進展中起著關(guān)鍵作用,因此,用抗炎和抗氧化劑治療可能提供一種很好的替代療法.

松果菊苷(echinacoside,ECH)是一種從傳統(tǒng)中草藥肉蓯蓉中分離出的苯乙醇苷類化合物.最近的研究表明,ECH具有很強的抗炎和抗氧化活性,其在動物模型中能改善如腸、肝和腎等多種器官損傷.而ECH對SAP的作用及潛在機制尚不清晰.因此,本研究通過膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液構(gòu)建大鼠SAP模型,采用生化、病理和Western blot分析法探究ECH對SAP大鼠模型所致的胰腺損傷的作用及潛在機制.

1 材料和方法

1.1 材料 ECH(純度98%)和牛磺膽酸鈉(純度98%)試劑購自上海源葉生物科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、脂肪酶和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)大鼠ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、淀粉酶大鼠ELISA試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司;丙二醛試劑盒(malondialdehyde,MDA)、β-actin抗體、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶蛋白酶-3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)抗體和原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPbiotin nick end labeling assay,TUNEL)染色試劑盒(FITC標記)均購自上海碧云天生物科技有限公司;B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl2-associated X protein,Bax)抗體、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf-2)抗體、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR-4)抗體、核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)p65抗體和羊抗兔IgG-HRP二抗均購自南京巴傲得生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 SAP模型建立和實驗方案:成年雄性Sprague-Dawley大鼠(清潔級,230 -250) g購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號:SCXK(浙)2019-0001),飼養(yǎng)在12 h光照-黑暗周期循環(huán)、穩(wěn)定濕度(50%-65%)和恒溫(23±2) ℃的屏障環(huán)境中,大鼠可自由進食和飲水.實驗前,讓大鼠適應(yīng)環(huán)境一周.大鼠在造模前12 h禁食不禁水,按照文獻方法誘導(dǎo)SAP大鼠模型:用3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,開腹,將5%?；悄懰徕c溶液(1 mL/kg)以3 mL/h的恒定速率逆行輸注到膽胰管中,輸注完成后,將進入十二指腸的部分導(dǎo)管夾閉5 min以保證牛磺膽酸鈉進入胰腺小葉,接著取下血管夾并縫合傷口;手術(shù)過程在2%異氟醚維持麻醉下進行.

將大鼠隨機分為四組(每組=10):A組:假手術(shù)組(Sham);B組:ECH對照組(Sham+ECH);C組:SAP模型組(SAP);D組:ECH治療組(SAP+ECH).Sham組除不進行輸注?；悄懰徕c外,進行了同模型組所有的手術(shù)程序.Sham+ECH和SAP+ECH組大鼠在術(shù)后0.5 h用ECH(20 mg/kg)灌胃,間隔12 h灌胃一次;ECH的劑量和給藥方案是根據(jù)文獻11,12及本實驗室預(yù)實驗決定.Sham和SAP組大鼠給予灌胃等體積生理鹽水.

1.2.2 標本準備:治療后24 h后,大鼠給予過量戊巴比妥鈉麻醉處死,開腹,收集腹水并用量筒測體積,右心室取血,并用左心室注射生理鹽水將血液排空,收集胰腺.取部分胰腺組織在4%多聚甲醛中固定24 h,在含有30%蔗糖的PBS中于4 ℃脫水24 h,然后石蠟包埋,切5 μm厚組織附于載玻片上,用于組織學(xué)分析.同部位胰腺組織迅速放入液氮中,然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱,用于后續(xù)生化和Western blot實驗.

1.2.3 胰腺組織學(xué)分析:取石蠟包埋的胰腺組織,切成5 μm厚組織附于載玻片上,脫蠟至水化后進行蘇木精和曙紅(hematoxylin-eosin,HE)染色.在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色情況,在400×視野下對每個切片的6個視野下根據(jù)Van Laethem等方法進行胰腺組織病理學(xué)評分.評分包括:水腫:從0到3級(0:不存在;1:小葉之間局灶性增加;2:小葉之間彌漫性增加;3:腺泡破裂和分開);炎性細胞浸潤:從0到3分級[0:不存在;1:在導(dǎo)管中(導(dǎo)管邊緣周圍);2:在實質(zhì),＜50%的小葉;3:在實質(zhì)中,＞50%的小葉];腺泡壞死:從0到3分級(0:不存在;1:導(dǎo)管周圍壞死,＜5%;2:局灶性壞死,5%-20%;3:彌漫性實質(zhì)壞死,20-50%).

1.2.4 TUNEL法:取石蠟包埋的胰腺組織,切成5 μm厚組織附于載玻片上,脫蠟至水化后,按照試劑盒說明步驟進行,室溫孵育20 μg/mL蛋白酶K溶液10 min,洗滌后,室溫孵育FITC標記的TUNEL檢測液45 min,含DAPI封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞情況.

1.2.5 血生化檢測:按試劑盒說明,分離各組大鼠血清,并用ELISA法檢查血清淀粉酶和脂肪酶活性.

1.2.6 組織生化檢測:大鼠胰腺組織用生理鹽水按1:9比例勻漿后,3000×g離心10 min收集上清勻漿液.BCA法測定胰腺組織的勻漿液中蛋白濃度.分別根據(jù)相應(yīng)的試劑盒,用ELISA法測定TNF-α和IL-6含量以及MPO、GSH-Px和SOD活性,用TBA法測定MDA含量.然后根據(jù)勻漿液中蛋白濃度,對上述指標進行標準量化.

1.2.7 Western blot分析:用RIPA裂解緩沖液提取胰腺組織中蛋白質(zhì),并用BCA法測定量蛋白濃度.按常規(guī)Western blot轉(zhuǎn)印方法,通過10%SDS-PAGE凝膠分離等量(20 μg/樣本)蛋白,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上.封閉后,將膜分別與一抗(Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf-2、TLR-4、NF-κB p65,均1:1000;β-actin,1:5000)在4 ℃過夜:洗滌后,加入羊抗兔IgG第二抗體孵育1 h后,通過電化學(xué)發(fā)光檢測試劑使用ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)掃描和分析條帶.β-actin用作內(nèi)部對照.

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 19.0軟件進行.定量數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(mean±SD).多組之間使用單因素方差分析,均數(shù)兩兩比較用SNK-事后檢驗.對于所有統(tǒng)計分析,以＜0.05為界限判斷有無統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 ECH減輕SAP 如圖1A-C所示,相對于Sham組,Sham+ECH組血清淀粉酶和脂肪酶活性以及腹水量均無明顯變化,而SAP組血清淀粉酶和脂肪酶活性以及腹水量均明顯升高(均＜0.05);相對于SAP組,SAP+ECH組血清淀粉酶和脂肪酶活性以及腹水量均明顯降低(均＜0.05).HE染色組織學(xué)(圖1D)顯示,Sham組和Sham+ECH組胰腺組織正常,SAP組胰腺組織水腫、有炎性細胞浸潤和部分胰腺壞死情況,SAP+ECH組相對于SAP組的胰腺病理學(xué)有明顯改善;與之一致,評分結(jié)果(圖1E-H)顯示,相對于Sham組,Sham+ECH組胰腺的水腫、炎癥、壞死以及總組織學(xué)評分均無明顯變化,而SAP組胰腺的水腫、炎癥、壞死以及總組織學(xué)評分均明顯升高(均＜0.05);相對于SAP組,SAP+ECH組大鼠上述指標評分均明顯降低(均＜0.05).

圖1 松果菊苷減輕大鼠重癥急性胰腺炎. A:各組大鼠血清淀粉酶活性;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;B:各組大鼠血清脂肪酶活性;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;C:各組大鼠腹水量;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;D:各組大鼠胰腺組織的HE染色代表圖像;E:胰腺組織的水腫評分;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;F:胰腺組織的炎癥評分;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;G:胰腺組織的壞死評分;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;H:胰腺組織的總組織學(xué)評分;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比.Sham:假手術(shù)組;ECH:松果菊苷;SAP:重癥急性胰腺炎.

2.2 ECH降低SAP模型大鼠的胰腺組織腺泡細胞死亡TUNEL染色(圖2A)顯示,Sham組和Sham+ECH組胰腺組織幾乎未見TUNEL陽性細胞;SAP組胰腺組織可見大面積TUNEL陽性細胞;SAP+ECH組相對于SAP組的胰腺組織中TUNEL陽性細胞范圍和數(shù)量均減少.Western blot結(jié)果(圖2B-E)顯示,相對于Sham組,Sham+ECH組胰腺組織中Bcl-2、Bax和裂解的caspase-3(Cleaved caspase-3)的表達水平均無明顯變化,而SAP組胰腺組織中Bax和Cleaved caspase-3的表達水平均明顯升高(均＜0.05)和Bcl-2表達水平明顯降低(＜0.05);相對于SAP組,SAP+ECH組胰腺組織中Bax和Cleaved caspase-3的表達水平均降低(均＜0.05)和Bcl-2表達水平明顯升高.

圖2 松果菊苷減輕重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織腺泡細胞死亡. A:各組大鼠胰腺組織的TUNEL染色代表性圖像;B:各組大鼠胰腺組織中代表性Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3表達的Western blot條帶;C:Bcl-2蛋白表達水平的統(tǒng)計結(jié)果;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;D:Bax蛋白表達水平的統(tǒng)計結(jié)果;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;E:Cleaved caspase-3蛋白表達水平的統(tǒng)計結(jié)果;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比.Sham:假手術(shù)組;ECH:松果菊苷;SAP:重癥急性胰腺炎;Bcl-2:B細胞淋巴瘤-2;Bax:Bcl-2相關(guān)X蛋白;Cleaved caspase-3:裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶蛋白酶-3.

2.3 ECH降低SAP模型大鼠的胰腺組織中炎癥和氧化應(yīng)激 炎癥指標生化檢測結(jié)果顯示,相對于Sham組,Sham+ECH組胰腺組織的炎癥指標(促炎性因子TNF-α和IL-6水平、MPO活性)均無明顯變化,而SAP組上述炎癥指標均明顯升高(均＜0.05);相對于SAP組,SAP+ECH組炎癥指標均明顯降低(均＜0.05).氧化應(yīng)激指標生化檢測結(jié)果顯示,相對于Sham組,Sham+ECH組胰腺組織中MDA水平和抗氧化酶SOD和GSH-Px活性均無明顯變化(均＞0.05),而SAP組胰腺組織中MDA水平明顯升高(＜0.05)和SOD和GSH-Px活性明顯降低(＜0.05);相對于SAP組,SAP+ECH組MDA水平明顯降低和SOD和GSHPx活性明顯升高(＜0.05)(表 1).

表1 各組大鼠胰腺組織中TNF-α水平、IL-6水平、MPO活性、MDA水平、SOD活性和GSH-Px活性(mean±SD,n=10)

2.4 ECH對SAP模型大鼠胰腺組織中Nrf-2以及TLR-4/NF-κB信號的影響 Western blot結(jié)果(圖3)顯示,相對于Sham組,Sham+ECH組胰腺組織中Nrf-2、TLR-4和NFκB p65蛋白表達水平無明顯變化,而SAP組Nrf-2表達水平明顯降低(＜0.05)和TLR-4和NF-κB p65表達水平明顯升高(均＜0.05);相對于SAP組,SAP+ECH組Nrf-2表達水平明顯升高(＜0.05)和TLR-4和NF-κB p65表達水平明顯降低(＜0.05).

圖3 松果菊苷對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織中Nrf-2、TLR-4和NF-κB p65蛋白表達的影響.A:各組大鼠胰腺組織中Nrf-2蛋白表達水平;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;B:各組大鼠胰腺組織中TLR-4蛋白表達水平;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比;C:各組大鼠胰腺組織中NF-κB p65蛋白表達水平;mean±SD,n=10;aP＜0.05,與Sham組相比;bP＜0.05,與SAP組相比.Sham:假手術(shù)組;ECH:松果菊苷;SAP:重癥急性胰腺炎;Nrf-2:核因子E2相關(guān)因子2;TLR-4:Toll樣受體4;NF-κB p65:核因子κB p65.

3 討論

目前,SAP的總體治療效果差強人意,因此研究潛在的SAP的治療措施具有現(xiàn)實意義.本研究在SAP模型大鼠中發(fā)現(xiàn)ECH能降低AP標記物胰蛋白酶和脂肪酶活性,減輕胰腺組織水腫、炎性細胞浸潤和壞死病理改變,說明ECH可能是SAP的潛在治療劑.

SAP的病理機制復(fù)雜,但其病理特征主要為胰腺腺泡細胞死亡以及局灶或全身炎癥反應(yīng).已有研究證實,胰腺腺泡細胞死亡能增加胰酶活化進而加重胰腺損傷,減少胰腺腺泡細胞死亡能減輕AP的嚴重程度.而胰腺腺泡細胞死亡程序可受到Bcl-2、Bax以及Cleaved caspase-3表達控制.Bcl-2水平升高和Bax水平降低說明細胞對死亡的抵抗性增強,反之則相反.Cleaved caspase-3是細胞死亡的執(zhí)行蛋白,Cleaved caspase-3表達增加說明能增加細胞死亡.本研究證實了,ECH能減少SAP模型大鼠胰腺腺泡細胞的TUNEL陽性細胞數(shù)、增加Bcl-2表達并降低Bax和Cleaved caspase-3表達,說明ECH能降低SAP模型大鼠胰腺腺泡細胞的死亡.另外,胰腺腺泡細胞壞死還能引起炎癥,而如TNF-α和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等促炎因子也可通過細胞凋亡或壞死發(fā)生可導(dǎo)致腺泡細胞死亡,并且級聯(lián)式放大促炎介質(zhì)也加重胰腺組織損傷并可觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征.氧化應(yīng)激在AP中發(fā)揮關(guān)鍵作用.在AP進展中,氧自由基的產(chǎn)生和積累以及抗氧化防御系統(tǒng)的下降,引起不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化,加重胰腺損傷.Li等研究表明ECH在缺血再灌注大鼠視網(wǎng)膜中可阻止脂質(zhì)過氧化(降低MDA水平)并誘導(dǎo)抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)的活化,同時抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6產(chǎn)生.同時,ECH已被證明在實驗性結(jié)腸炎、肝缺血再灌注以及膿毒癥等模型大鼠中可發(fā)揮抗炎和抗氧化作用.本研究檢測了胰腺組織勻漿中炎癥相關(guān)指標TNF-α、IL-6和MPO(反映白細胞浸潤的炎癥生物標志物)以及氧化應(yīng)激相關(guān)指標MDA、GSH-Px和SOD,結(jié)果顯示,ECH能降低SAP模型大鼠胰腺組織中促炎介質(zhì)TNF-α和IL-6水平以及MPO活性,降低脂質(zhì)過氧化損傷(抑制MDA水平)并提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性,說明ECH在SAP中也發(fā)揮抗炎和抗氧化作用.

本研究進一步對ECH在SAP模型大鼠中的抗炎和抗氧化作用的機制進行了探索.TLR-4/NF-κB通路是機體參與免疫和炎癥調(diào)節(jié)的主要通路.有研究顯示,SAP模型胰腺組織中TLR-4和NF-κB p65表達增加,反之抑制TLR-4/NF-κB活性可減輕SAP模型的胰腺損傷和胰腺炎.在動物和細胞模型中研究顯示,ECH可能通過抑制TLR-4/NF-κB活性來減輕急性結(jié)腸炎和肺泡炎.本研究結(jié)果同樣顯示,ECH在SAP模型的胰腺組織中可抑制TLR-4/NF-κB信號關(guān)鍵蛋白TLR-4和NF-κB p65表達,提示ECH至少能通過減弱TLR-4/NF-κB活性降低SAP大鼠胰腺組織中炎性反應(yīng).Nrf-2信號是機體參與抗氧化的主要信號通路.當SAP發(fā)生后,通過藥物干預(yù)增強Nrf-2信號活性能進而增加抗氧化酶SOD和GSH-Px合成,并可抑制氧化酶合成,加快自由基清除,從而恢復(fù)氧化/抗氧化平衡,降低胰腺氧化損傷.本研究結(jié)果顯示,ECH能上調(diào)SAP大鼠胰腺組織中Nrf-2表達,體現(xiàn)ECH可能激活Nrf-2活性進而激活下游抗氧化酶GSH-Px和SOD生成,發(fā)揮抗氧化作用.

4 結(jié)論

總之,本研究提示ECH能通過抗氧化、抗炎以及抑制腺泡細胞死亡來改善SAP導(dǎo)致的胰腺損傷.另外,ECH可能是潛在的抗AP藥物.

從抗炎和抗氧化活性的化合物中可能篩選到具有治療重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的潛在藥劑.

松果菊苷(echinacoside,ECH)具有較強的抗炎和抗氧化的活性,且已在動物模型中被發(fā)現(xiàn)具有改善多種器官損傷的作用,提示其可能在SAP中也能發(fā)揮有益作用.

檢測ECH在SAP中的作用并進一步分析其機制.

構(gòu)建SAP模型大鼠,并給予ECH治療.收集血清和胰腺組織,通過生化、組織學(xué)以及Western blot檢測評估ECH是否在SAP中能發(fā)揮有益作用.

ECH治療能減輕SAP大鼠胰腺炎的嚴重程度,改善胰腺組織形態(tài)表現(xiàn),抑制炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激并減少腺泡細胞死亡;此外,ECH能減弱SAP大鼠胰腺組織中TLR-4/NF-κB活性和增強Nrf-2信號活性.

ECH在SAP中具有有益作用,且此作用可能與其抗炎、抗氧化以及抑制腺泡細胞死亡有關(guān).

ECH可能是潛在的抗SAP的藥物.