岳云雙，周曉璐，馬 晨，胡小松，陳 芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心教育部果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京 100083）

人類腸道微生物主要?jiǎng)澐譃閮深?，即必需或有益的菌群和易?dǎo)致機(jī)體感染的機(jī)會(huì)性菌群[1]。這兩類菌群以一定比例共同棲息在腸道中，維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)兩類菌群間的平衡被打破，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)時(shí)，易引發(fā)胃腸道疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征和克羅恩病等[2]。除有益菌自身通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制致病菌的生長(zhǎng)而維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡外，腸道菌群的代謝產(chǎn)物也可參與調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的生理功能，如短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFA）。SCFAs 通過促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖，增加黏蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)因子的水平，來保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免遭破壞，從而改善腸道的屏障功能。增加腸道中有益菌群的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)腸道SCFAs 的分泌量，對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保障腸道功能具有重要意義。

番茄紅素屬于不含氧元素的一類類胡蘿卜素，其分子式為C40H56，相對(duì)分子質(zhì)量為536.85，純品為針狀深紅色晶體，是存在于植物中的一種天然色素，其主要存在于成熟的紅色植物果實(shí)中，如番茄、番石榴、西瓜等[3]。番茄紅素屬于直鏈型碳?xì)浠衔铮浞肿咏Y(jié)構(gòu)式含有11 個(gè)共軛雙鍵及2 個(gè)非共軛雙鍵，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[4-5]。研究證實(shí)，番茄紅素對(duì)幽門螺桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病性微生物具有明顯的抑制作用[6-8]。在小鼠日糧中添加番茄粉，可顯著增加腸道菌群的豐富度和多樣性，降低梭狀芽孢桿菌和黏孢桿菌的相對(duì)豐度，緩解高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠肝癌[9]。此外，少量研究表明，小鼠或肥胖病人攝入番茄紅素后可顯著降低變形菌門的相對(duì)豐度，增加雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度，緩解小鼠腸炎或肥胖引起的代謝紊亂[10-11]。然而，目前番茄紅素的益生元作用研究不足。本研究采用體外模擬腸道微生態(tài)體系，研究番茄紅素對(duì)腸道菌群中益生菌的數(shù)量及其代謝產(chǎn)物——SCFAs 產(chǎn)量的影響，為闡明番茄紅素的益生元功效提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

番茄紅素（純度>92%），上海源葉生物科技有限公司。雄性健康C57BL/6J 小鼠（8 周齡），北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所需標(biāo)準(zhǔn)品：乙酸（99.8%）、丙酸（99.8%）、丁酸（99.5%）、異丁酸（99%）、戊酸（99.8%）、異戊酸（98.5%）、豬胰腺胰蛋白酶（1 500 U/mg）、豬胰腺胰酶（8 X USP）、豬胃黏膜胃蛋白酶 （250 units/mg）、豬胃黏蛋白（Type II）、L-半胱氨酸（97%）、2 乙基丁酸（純度99%），美國(guó)Sigma 公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈，美國(guó)Honeywell 公司；3 號(hào)膽鹽、蛋白胨及酵母提取物，奧博星生物技術(shù) （北京） 有限責(zé)任公司；NaCl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaHCO3、乙 醇（無水，分析純級(jí)）、葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（滬試）；DNA 提取試劑盒（糞便，DP328），天根生化科技（北京）有限公司；試驗(yàn)所需特異性引物（腸道菌群）由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備與儀器

LAI-3DT 型厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；IS-RSD3 臺(tái)式恒溫振蕩器，美國(guó)精騏有限公司；LightCycler480 II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，德國(guó)Roche 公司；GC-2010 Plus 氣相色譜儀、FID檢測(cè)器、SH-Stabilwax-DA （30 m×0.32 mm×0.50 μm）色譜柱（1575313），日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬胃腸道消化液的配制 體外模擬胃液和腸液的配制參照石夢(mèng)玄等[12]建立的方法。模擬胃液的配制（1 L）：NaCl 3.10 g，KCl 1.10 g，CaCl20.15 g，NaHCO30.6 g，用去離子水溶解并定容至1 L。取100 mL 胃電解液，添加23.6 mg 胃蛋白酶，隨后加入1.0 mL 1.5 mol/L CH3COONa 緩沖液（pH=5.0）。室溫下磁力攪拌器攪拌10 min，同時(shí)用0.5 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 值至2.0。

模擬腸液的配制（1 L）：NaCl 5.40 g，KCl 0.65 g，CaCl20.25 g，用去離子水溶解后定容至1 L。按照體積比為1∶1∶2 的比例吸取小腸電解液∶7%胰酶上清液∶4%膽汁鹽溶液于離心管中，混合均勻后加入13 mg 胰蛋白酶，攪拌使其充分溶解，隨后滴加0.5 mol/L 的NaOH 溶液，調(diào)節(jié)溶液pH 值至7.0。

1.3.2 發(fā)酵液培養(yǎng)基配制 NaCl 0.1 g，K2HPO40.04 g，KH2PO40.04 g，MgSO40.01 g，CaCl20.01 g，NaHCO32.00 g，蛋白胨2.50 g，酵母提取物4.00 g，葡萄糖0.40 g，粘蛋白2.00 g，膽鹽0.50 g，L-半胱氨酸0.46 g，Tween-80 2 mL，隨后采用去離子水溶解并定容至1 L，并滴加0.5 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0，高壓滅菌后待用。

1.3.3 糞便菌群懸液的制備 收集小鼠新鮮糞便，根據(jù)Ding 等[13]的方法制備糞菌懸液。糞便與無菌PBS 緩沖液（pH 7.0）以1∶9（m/V）的比例混合，攪拌使其混合均勻，渦旋10 min 后，離心（1 000 r/min，10 min），取上層菌群懸液。

1.3.4 體外發(fā)酵 取5 mL 模擬胃液于50 mL 離心管中，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的番茄紅素，振蕩渦旋使其充分混勻后，置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱（120 r/min），孵育1.5 h 后，加入等體積的模擬小腸液，振蕩渦旋充分混勻后，再次置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱（120 r/min）繼續(xù)孵育1.5 h，孵育結(jié)束后收集獲得番茄紅素消化液。隨后將番茄紅素消化液、菌懸液和混合培養(yǎng)基按體積比1∶3∶6 的比例混合，并置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱，待培養(yǎng)0，3，6，12，24 h 分別取樣5 mL，12 000 r/min 離心10 min，分別收集上清液及沉淀保存于-80 ℃待用。不含有番茄紅素組為對(duì)照組。

1.3.5 菌群數(shù)量的測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量絕對(duì)定量法測(cè)定樣品中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、普氏菌屬 （Prevotella）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、阿克曼氏菌屬（Akkermansia mucinipila）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等有益菌數(shù)量。采用上述菌種和總菌的相對(duì)應(yīng)特異性擴(kuò)增引物，構(gòu)建各菌種的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為擴(kuò)增模板，利用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光絕對(duì)定量PCR，該反應(yīng)采用德國(guó)Roche 公司LightCycler480 II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行測(cè)定，利用CT 值計(jì)算拷貝數(shù)，結(jié)果用copies/mL 表示，菌種引物序列見表1。

表1 腸道菌群菌屬引物Table 1 Primers used for intestinal microbiota

1.3.6 SCFAs 產(chǎn)量測(cè)定 吸取800 μL 上清液并加入50%硫酸溶液200 μL，立即加入1 mL 乙醚，振蕩渦旋10 s 后，插入冰盒中靜置10 min，隨后4℃離心機(jī)12 000 r/min 離心10 min，離心結(jié)束后輕輕加入CaCl2使其脫水后，吸取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移入進(jìn)樣瓶中，再加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液40 μL （使定位內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL），混勻，過膜（尼龍膜0.22 μm），即可上機(jī)測(cè)定。氣相色譜儀中采用SH-Stabilwax-DA（30 m×0.32 mm×0.50 μm） 色譜柱測(cè)定乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的含量，采用外標(biāo)法計(jì)算上述短鏈脂肪酸的濃度。氣相色譜儀參數(shù)：氫火焰監(jiān)測(cè)器 （Flame ionization detector，F(xiàn)ID），載氣為N2，流速：19.0 mL/min，分流比1∶10，空氣流速：300 mL/min，H2流速：34.8 mL/min；檢測(cè)器進(jìn)樣口溫度：260 ℃，初始溫度：80 ℃（1.5 min），以10 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，溫度達(dá)260 ℃保持20 min。進(jìn)樣量1 μL，重復(fù)進(jìn)樣3 次。

1.3.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)結(jié)果均為3 次重復(fù)試驗(yàn)所得，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，短鏈脂肪酸產(chǎn)量與腸道菌群數(shù)量進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬腸道發(fā)酵體系中番茄紅素對(duì)菌群數(shù)量的影響

由圖可知，對(duì)照組和番茄紅素組經(jīng)體外發(fā)酵后，總菌的數(shù)量都明顯上升（圖1a），表明本研究采用的發(fā)酵體系有利于腸道菌群的生長(zhǎng)。另外，研究結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，番茄紅素作為發(fā)酵底物，不同程度上提高了乳酸桿菌屬（圖1b）、雙歧桿菌屬（圖1c）、擬桿菌屬（圖1d）、普氏菌屬（圖1e）、阿克曼氏菌（圖1f）的數(shù)量；對(duì)羅斯氏菌屬（圖1g）及瘤胃球菌屬（圖1h）的檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，無論對(duì)照組還是番茄紅素組都降低了上述兩種菌屬的數(shù)量，然而番茄紅素作為發(fā)酵底物，減緩了上述兩種菌屬數(shù)量的驟減，穩(wěn)定了這些菌屬的數(shù)量。

圖1 體外發(fā)酵后總菌（a）、乳酸桿菌屬（b）、雙歧桿菌屬（c）、擬桿菌屬（d）、普氏菌屬（e）、阿克曼氏菌擬桿菌屬（f）、羅斯氏菌屬（g）和瘤胃球菌屬（h）數(shù)量變化Fig.1 The number of all bacteria （a），Lactobacillus （b），Bifidobacterium （c），Bacteroides （d），Prevotella （e），Akkermansia mucinipila （f），Roseburia （g），and Ruminococcus （h） after the in vitro fermentation

2.2 體外模擬發(fā)酵體系中番茄紅素對(duì)SCFAs 的影響

番茄紅素對(duì)腸道菌群的代謝產(chǎn)物乙酸的影響如圖2a 所示，發(fā)酵至6 h 時(shí)，乙酸的產(chǎn)量達(dá)到最高，且遠(yuǎn)高于對(duì)照組，隨后逐漸降低，發(fā)酵至12 h時(shí)乙酸的產(chǎn)量略低于對(duì)照組，然而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，番茄紅素再次促進(jìn)乙酸的產(chǎn)生，至24 h 時(shí)，乙酸產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組（圖2a）。番茄紅素顯著促進(jìn)了丙酸的產(chǎn)生，發(fā)酵至12 h 時(shí)達(dá)到最高 （圖2b）；丁酸的產(chǎn)量在番茄紅素組和對(duì)照組中均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且發(fā)酵至12 h 時(shí)達(dá)到最高，而與對(duì)照組相比，番茄紅素在發(fā)酵3 h 時(shí)即促進(jìn)了丁酸的增加，發(fā)酵至24 h 時(shí)依然維持較高的丁酸產(chǎn)量（圖2c）；與對(duì)照組相比，番茄紅素顯著促進(jìn)了異丁酸的產(chǎn)生，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，異丁酸產(chǎn)量逐漸增加（圖2d）；發(fā)酵0～6 h 期間，番茄紅素與對(duì)照組中戊酸的產(chǎn)量均呈逐漸降低的趨勢(shì)，6 h 后，番茄紅素顯著增加了戊酸的產(chǎn)量（圖2e）；與對(duì)照組相比，番茄紅素顯著促進(jìn)了異戊酸的產(chǎn)生，且呈先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵至6 h 時(shí)，異戊酸的產(chǎn)量達(dá)到最高（圖2f）。

圖2 體外發(fā)酵體系中乙酸（a）、丙酸（b）、丁酸（c）、異丁酸（d）、戊酸（e）和異戊酸（f）的產(chǎn)量變化Fig.2 The yield change of SCFAs in the in vitro fermentation system acetic acid （a），propionic acid （b），butyric acid （c），iso-butyric acid （d），valeric acid （e） and iso-valeric acid （f）

2.3 體外發(fā)酵番茄紅素體系中腸道菌群與SCFAs 的相關(guān)性分析

由圖3可知，SCFAs 產(chǎn)量與腸道菌群數(shù)量之間存在相關(guān)性，發(fā)酵3 h 后，總菌、雙歧桿菌、擬桿菌、普氏菌屬和瘤胃球菌屬的數(shù)量與丁酸、異丁酸的產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)（圖3a）；發(fā)酵至6 h 時(shí)，總菌、擬桿菌、普氏菌屬和瘤胃球菌屬的數(shù)量與乙酸、丙酸、異丁酸和異戊酸的產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)（圖3b）；發(fā)酵至12 h 時(shí)，總菌、乳酸菌、雙歧桿菌、擬桿菌、普氏菌屬、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬的數(shù)量與丙酸、異丁酸、戊酸和異戊酸的產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，而上述菌屬的數(shù)量與乙酸的產(chǎn)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（圖3c）；發(fā)酵至24 h 后，總菌、擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌、普氏菌屬、阿克曼氏菌屬、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬數(shù)量與乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān) （圖3d）。

圖3 體外發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)腸道菌群與短鏈脂肪酸的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between short chain fatty acids concentration and microbial flora number at different fermentation time in the in vitro fermentation system

3 結(jié)論與討論

益生元通常是指不可被宿主消化吸收，卻可以被宿主微生物選擇性地利用，同時(shí)賦予宿主健康益處的底物[16]。番茄紅素為部分可消化的植物化學(xué)物質(zhì)[17-18]，它們可以到達(dá)結(jié)腸與腸道中微生物群接觸。Wiese 等首次發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期攝入番茄紅素后，不僅可以緩解肥胖導(dǎo)致的代謝紊亂，而且可以顯著增加雙歧桿菌的相對(duì)豐度[11]。最近也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小鼠灌胃番茄紅素后可顯著降低變形菌門的相對(duì)豐度，增加雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度，從而緩解小鼠腸炎[10]。本研究采用體外發(fā)酵體系評(píng)價(jià)番茄紅素的益生元特性，結(jié)果表明其能顯著提高乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、普氏菌屬和擬桿菌屬的數(shù)量，減緩羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬的減少，顯著增加乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸等短鏈脂肪酸的水平，表明番茄紅素具有潛在的益生元作用。

雙歧桿菌屬和乳酸菌屬是最常見的有益菌，可緩解氧化應(yīng)激，增強(qiáng)腸道屏障功能，維持機(jī)體的免疫平衡[19-21]。一方面它們可抑制有害菌和病原體的數(shù)量，另一方面通過刺激腸道局部和全身免疫反應(yīng)來維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而保障了宿主健康。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病的發(fā)病與腸道雙歧桿菌數(shù)量減少有關(guān)，增加腸道中雙歧桿菌數(shù)量有助于治療輕中度炎癥性腸病[22]。另外，雙歧桿菌還可利用單糖或低聚糖等代謝產(chǎn)生乙酸[23]。乳酸菌可通過其分泌的代謝物，如有機(jī)酸、細(xì)菌素等抑制致病菌的生長(zhǎng)，降低有害菌感染引起的炎癥反應(yīng)。目前，針對(duì)治療胃腸道病原菌的乳酸菌制劑也已經(jīng)投入使用，如防治大腸桿菌、沙門氏菌及李斯特菌等引起的感染。另外，乳酸菌還可通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路，增加緊密連接蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善腸道屏障功能[19-20]。羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬均可利用單糖或多糖產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸[24-25]。并且最新研究證實(shí)，瘤胃球菌在抑制I 型糖尿病中具有重要作用。I 型糖尿病患者腸道中瘤胃球菌數(shù)量減少，且CD8+Treg 細(xì)胞的數(shù)量較健康人群更低，而補(bǔ)充瘤胃球菌后，CD8+Treg 細(xì)胞數(shù)量增加，抑制了鏈脲霉素誘導(dǎo)的I 型糖尿病的發(fā)生[26]。普氏菌屬和擬桿菌屬可分解多種碳水化合物，產(chǎn)生琥珀酸等物質(zhì)，并通過腸道的糖異生作用，改善胰島素抵抗和葡萄糖不耐受等疾病[27]，另外它們還可分解碳水化合物產(chǎn)生乙酸和丙酸[28]，乙酸又可作為底物促進(jìn)合成丁酸[29]。近幾年的研究證實(shí)，阿克曼氏菌屬也是人類腸道菌群中重要的成員之一，占人類腸道菌群的1%～5%。研究者還證實(shí)，在肥胖和糖尿病人糞便中阿克曼氏菌屬的豐度顯著降低，而添加阿克曼氏菌屬活菌可以抑制高脂飲食（HFD）導(dǎo)致的肥胖和腸道屏障功能破壞[30]。此外，阿克曼氏菌還能夠特異性的利用腸道中粘蛋白，而改善腸道屏障功能，被稱為潛在益生菌[31]。

大量研究已確定了SCFAs 的關(guān)鍵作用，其不僅作為腸道的能源物質(zhì)為腸道提供能量，促進(jìn)腸道細(xì)胞的增殖，提高腸道的屏障功能，而且在參與調(diào)節(jié)機(jī)體外周免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)肥胖機(jī)體的炎癥反應(yīng)水平等方面發(fā)揮重要作用[32]。SCFAs 還可介導(dǎo)共生菌群與免疫系統(tǒng)之間的通訊，如調(diào)節(jié)結(jié)腸調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞-Treg 細(xì)胞的數(shù)量及功能，來維持機(jī)體促炎及抗炎機(jī)制的平衡，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免受腸道炎癥的侵害[33]。此外，SCFAs 還可通過改變引起腸道癌癥的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄作用，來抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而抑制腸道癌癥[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，SCFAs的產(chǎn)量與腸道菌群的數(shù)量相關(guān)性呈逐漸增加的趨勢(shì)，至發(fā)酵24 h 時(shí)，SCFAs 的產(chǎn)量與腸道菌群的數(shù)量呈極顯著正相關(guān)，表明番茄紅素或可通過增加益生菌及其代謝產(chǎn)物-SCFAs 的產(chǎn)量，進(jìn)一步在腸道疾病干預(yù)中發(fā)揮作用。

雖然體外發(fā)酵體系結(jié)果還有待于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，但最新研究顯示，肥胖病人或腸炎小鼠食用番茄紅素1 個(gè)月或40 d 后，腸道菌群中的雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬相對(duì)豐度顯著增加[10-11]。這意味著體外發(fā)酵體系的結(jié)果在一定程度上可用于評(píng)價(jià)其在體內(nèi)對(duì)菌群的調(diào)節(jié)作用?？傊鸭t素作為發(fā)酵底物可以通過增加產(chǎn)SCFAs 菌屬的數(shù)量進(jìn)而促進(jìn)SCFAs 的產(chǎn)生，來發(fā)揮其益生元功效，這將為番茄紅素用于改善腸道屏障功能，治療腸道炎癥等疾病提供科學(xué)依據(jù)。