黃 蓉，呂林燦，李 瑩，張 陽(yáng)，劉延琳，宋育陽(yáng)*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 茅臺(tái)學(xué)院 貴州仁懷 564500）

銅是葡萄酒產(chǎn)業(yè)中最受關(guān)注的一類重金屬，對(duì)葡萄酒的品質(zhì)影響很大。歐盟和南非規(guī)定葡萄中的銅含量不得超過(guò)20 mg/L，葡萄酒中不得超過(guò)1 mg/L[1-2]。然而，13%的葡萄和18%的葡萄酒都存在銅殘留量超標(biāo)的現(xiàn)象。銅元素在低濃度范圍，對(duì)葡萄酒發(fā)酵有積極的影響[3]，而過(guò)量的銅會(huì)抑制細(xì)胞的代謝活動(dòng)，甚至可能產(chǎn)生毒性[4]。研究發(fā)現(xiàn)高濃度銅會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵延遲，并降低酒精產(chǎn)量[5-6]。除此之外，銅還影響酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物。適量的銅離子使葡萄酒中的硫化氫生成量減少，過(guò)量則會(huì)促進(jìn)硫化氫的生成[7]，增加發(fā)酵中糖和揮發(fā)酸的殘留量[6]，并加速葡萄酒中多酚類物質(zhì)的氧化速率，最終導(dǎo)致葡萄酒質(zhì)量下降[8]?？傊?，銅影響釀酒酵母的活性，繼而影響葡萄酒的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程。在人體內(nèi)，銅主要由胃腸道吸收，并隨部分糞便排出體外，其余的被轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟中[9]。若銅攝入過(guò)多，就會(huì)影響動(dòng)物肝臟、腎臟的正常形態(tài)與功能，擾亂其氧化-還原平衡，還會(huì)導(dǎo)致人體腦組織抗氧化功能受損[10]。

隨著葡萄酒工藝的改良，現(xiàn)階段針對(duì)葡萄酒銅破敗的主要解決辦法是通過(guò)添加 “下膠劑”下膠、過(guò)濾去除。而下膠過(guò)程比較復(fù)雜，下膠劑的用量不易精準(zhǔn)判斷，存在“下膠不完全”或“下膠過(guò)量”的現(xiàn)象，其殘留物也會(huì)危害到人體健康，污染環(huán)境，影響葡萄酒的感官品質(zhì)和香氣質(zhì)量[11-12]。近幾年，研究人員發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對(duì)重金屬有很好的吸附作用。采用釀酒酵母吸附重金屬，具有廉價(jià)、安全、高效、來(lái)源穩(wěn)定等特點(diǎn)，在重金屬生物吸附方面，具有較大潛力。葡萄酒釀制過(guò)程中，釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵的同時(shí)，去除多余的銅離子，不僅能確保葡萄酒的安全性和質(zhì)量，也有助于保留葡萄酒原本的顏色和風(fēng)味[12]，并對(duì)環(huán)境沒(méi)有惡劣影響。

金屬硫蛋白（通常簡(jiǎn)稱MT）是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要的生命物質(zhì)，其定義為一類低分子質(zhì)量，高巰基，能結(jié)合金屬離子，性能獨(dú)特的蛋白質(zhì)[13]。到目前為止，人們已從哺乳動(dòng)物、植物和微生物等多種生物體內(nèi)分離、提純得到金屬硫蛋白[14-15]，并發(fā)現(xiàn)它能吸附鎘，還有鋅、銅、汞等離子。金屬硫蛋白的生物學(xué)意義涉及生物機(jī)體微量元素貯存、運(yùn)輸和代謝、重金屬解毒、自由基清除以及機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、生殖衰老、免疫抵抗等各個(gè)方面，關(guān)于它的研究也涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健、生物工程、環(huán)境保護(hù)、化妝品研發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域[16]。

本研究以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）288c 為金屬硫蛋白CUP1 的供體，利用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)表達(dá)并附著在釀酒酵母二倍體82-9-35 的細(xì)胞表面，以期在釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中，吸附葡萄酒中的銅離子，并最終隨酵母菌體一起被過(guò)濾掉，從而達(dá)到去除葡萄酒中銅離子的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物 以釀酒酵母（S.cerevisiae）288C（MATα；SUC2；gal2；mal；mel；Flo1；flo8-1；hap1；ho；bio1；bio6）基因組為模板，宿主菌株為釀酒酵母二倍體 （S.cerevisiae 82-9-35）菌株（實(shí)驗(yàn)室前期分離得到，his3Δ1，為SD-Ura 缺陷性酵母），這2 株菌均為實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)中對(duì)釀酒酵母S.cerevisiae 82-9-35 進(jìn)行改造，獲得重組菌株菌二倍體釀酒酵母（S.cerevisiae 82-9-35-CUP1）。大腸桿菌（E.coli）DH5α，南京諾唯贊生物科技有限公司。出發(fā)質(zhì)粒GAP-α-factor-EGII-Sed1 為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒，包含啟動(dòng)子GAP，信號(hào)肽α-factor，錨定蛋白Sed1 和目的蛋白EGII；因?yàn)榻饘倭虻鞍證UP1 的催化活性位點(diǎn)在C末端，所以需將原質(zhì)粒的錨定蛋白替換為C 末端結(jié)合的錨定蛋白Flo1p，目標(biāo)蛋白替換為CUP1，即構(gòu)建出酵母表面展示金屬硫蛋白的重組質(zhì)粒GAP-α-factor-Flo1p-CUP1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.1.2 工具酶與主要試劑 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液、乳酸緩沖液 （pH 3.0）、0.4 mol/L 的三氯乙酸、0.5 mol/L 的氫氧化鈉、10.00 mg/mL 酪素溶液、100 μg/mL 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol/L 乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，pH 8.0）、TE 緩沖液 （Tris-EDTA buffer solution）、氨卡青霉素（Amp）、1 mol/L 山梨醇、酵母感受態(tài)制備處理液、酵母全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（YPD）、尿嘧啶缺陷型合成葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（SD-URA）、Luria-Bertain（LB）培養(yǎng)基和LB-Amp 培養(yǎng)基的配制方法參照Z(yǔ)hang 等[17]的方法。In-Fusion HD Cloning kits、DNA 凝膠純化試劑盒、SD-Ura DO Supplement、Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye）、DNA Markers 和DNA 限制性內(nèi)切酶（Cla I、Xba1、Sma I），寶生物（大連） 有限公司；PhantaRSuper-Fidelity DNA Polymerase，南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 提取液 （酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1）、1 mol/L 二硫蘇糖醇 （DL-dithiothreitol，DTT）、DNA 純化試劑盒和酵母基礎(chǔ)氮源（YNB），北京索萊寶科技有限公司；引物的合成和DNA 測(cè)序交由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 CUP1 目的蛋白和錨定蛋白基因的克隆 目標(biāo)基因CUP1 和Flo1 均以釀酒酵母288C 的基因組為模板，高保真酶PCR 體系參照PhantaRMax Super-Fidelity DNA Polymerase 說(shuō)明書(shū)。對(duì)擴(kuò)增后的PCR 片段進(jìn)行試劑盒純化回收，得到目的蛋白基因CUP1 片段和錨定蛋白基因Flo1 片段，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 釀酒酵母表面展示金屬硫蛋白載體的構(gòu)建 通過(guò)雙酶切和In-fusion 技術(shù)將錨定蛋白Flo1p和金屬硫蛋白CUP1 先后替換掉實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的質(zhì)粒GAP-α-factor-EGII-Sed1 中的EGII 和Sed1 蛋白，構(gòu)建出金屬硫蛋白的表面展示載體GAP-α-factor-Flo1p-CUP1，展示系統(tǒng)構(gòu)建流程如圖1所示。

圖1 酵母表面展示系統(tǒng)構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart of construction of yeast surface display system

1.2.3 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 一步克隆連接的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，涂布在LB-Amp 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)12～14 h，挑取單菌落用Taq 酶體系（參考寶生物（大連）有限公司）進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，引物為CUP1-f 和CUP1-r。將驗(yàn)證成功的大腸桿菌單菌落接種在LB-Amp 液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.4 目標(biāo)酶基因插入酵母基因組 用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取大腸桿菌中含有CUP1 的重組質(zhì)粒，用DNA 限制性快切酶Sma Ⅰ單酶切后，進(jìn)行試劑盒純化回收。將回收后的DNA 片段，轉(zhuǎn)化至SD-Ura 缺陷性釀酒酵母二倍體82-9-35（目標(biāo)片段依靠His3 組氨酸同源臂與酵母基因組發(fā)生同源重組），后涂布在SD-Ura 平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取酵母單菌落進(jìn)行酵母菌落PCR驗(yàn)證重組酵母。Taq 酶體系PCR 驗(yàn)證引物為CUP1-f 和CUP1-r。

1.2.5 銅離子測(cè)定方法 采用分光光度法測(cè)定溶液中的銅離子濃度。在紫外分光光度計(jì)上設(shè)定波長(zhǎng)734.0 nm[18]。（1）用空白溶液，即10 mmol/L EDTA 稀釋銅離子溶液，制備濃度梯度為0，2，4，6，8，10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣標(biāo)定。（2）取菌液以8 000 r/min 離心3 min，收集上清液作為樣品，測(cè)量吸光度，每次測(cè)量做3 次平行，最終結(jié)果取其平均值。數(shù)據(jù)處理和圖片繪制由office Excel 2016和Rstudio（64 位）完成。

1.2.6 銅離子耐受性研究 分別將重組菌（S.cerevisiae 82-9-35-CUP1）和原菌株（S.cerevisiae 82-9-35）接種在YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)16～18 h。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×106CFU/mL 的接種量再分別接種在含銅離子的YPD 液體培養(yǎng)基（銅離子質(zhì)量濃度分別為10，15，20，25，30 mg/L） 中，30 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)基狀況，待低質(zhì)量濃度銅離子的培養(yǎng)基混濁后，再通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。對(duì)比不同質(zhì)量濃度的銅離子，重組酵母在培養(yǎng)前、后的菌株數(shù)量變化，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 細(xì)胞表面金屬離子解析 金屬硫蛋白的重金屬吸附平衡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，它的吸附過(guò)程包括胞內(nèi)吸附和胞外吸附2 個(gè)過(guò)程。為研究金屬硫蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)后對(duì)酵母解析重金屬能力的影響，將吸附平衡后的酵母菌用解析液，如EDTA或H2SO4解析處理[19]。Cu2+吸附平衡后，收集菌體，ddH2O 洗3 次；10 mmol/L EDTA 在30 ℃，150 r/min 條件下解析1 h；8 000 r/min 離心3 min，取上清液。測(cè)量上清液中Cu2+濃度，計(jì)算好上述試驗(yàn)中的稀釋倍數(shù)，計(jì)算即得酵母表面金屬離子解析濃度。結(jié)合1.2.6 節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出單位菌體表面吸附銅離子的量，做解析后銅離子濃度的對(duì)比圖和單位菌體表面吸附銅離子濃度對(duì)比圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以釀酒酵母288C 基因組為模板，PCR 擴(kuò)增錨定蛋白基因Flo1、金屬硫蛋白基因CUP1 經(jīng)試劑盒純化回收后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，F(xiàn)lo1 基因片段長(zhǎng)度為3 264 bp，CUP1 基因片段長(zhǎng)度為291 bp，如圖2和圖3所示，所有片段長(zhǎng)度均符合預(yù)期。在實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建好的載體GAP-α-EGII-Sed1 中，先、后插入錨定蛋白基因Flo1、金屬硫蛋白基因CUP1 的金屬硫蛋白表面展示載體。XbaⅠ、ClaⅠ雙酶切電泳結(jié)果如圖4所示，有2 個(gè)條帶說(shuō)明原質(zhì)粒GAP-α-factor-EGII-Sed1 線性化成功。重組質(zhì)粒載體上有EcoRⅠ位點(diǎn)，SphⅠ位點(diǎn)和XbaⅠ位

圖2 CUP1 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證Fig.2 CUP1 agarose gel electrophoresis verification

圖3 Flo1 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證Fig.3 Flo1 agarose gel electrophoresis verification

圖4 XbaⅠ、ClaⅠ雙酶切驗(yàn)證Fig.4 XbaⅠand ClaⅠdouble enzymedigestion verification

點(diǎn)存在于目的基因和錨定蛋白基因上，凝膠電泳結(jié)果圖5顯示3 個(gè)酶切位點(diǎn)均已切開(kāi)，說(shuō)明目的基因、錨定蛋白基因與原質(zhì)粒載體三者成功相連，重組質(zhì)粒GAP-α-factor-Flo1p-CUP1 構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證Fig.5 Recombinant plasmid double restrictiondigestion verification

2.2 電激轉(zhuǎn)化釀酒酵母

圖6凝膠中7 000 bp 和4 000 bp 處有2 條條帶，與重組質(zhì)粒含有2 個(gè)SmaⅠ位點(diǎn)的預(yù)期相同，重組質(zhì)粒已被線性化。參考文獻(xiàn)[20]的方法制備酵母感受態(tài)并進(jìn)行酵母電轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化子劃線在YPD 和SD-Ura 平板上，恒溫30 ℃，培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證引物為CUP1-f 和CUP1-r。

圖6 SmaⅠ單酶切驗(yàn)證Fig.6 SmaⅠsingle restriction digestion verification

2.3 銅離子吸附驗(yàn)證

設(shè)置紫外分光光度計(jì)在734.0 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)定，處理結(jié)果得出一元線性回歸公式為：y=0.0025x+0.0635，R2=0.9809，并繪制一元線性回歸曲線。

表2 銅離子標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Copper ion standard curve

2.3.1 銅離子耐受性研究 最后一次接種后，試驗(yàn)組和對(duì)照組酵母培養(yǎng)約36 h，從圖中可明顯看出，整體上釀酒酵母的生長(zhǎng)隨濃度呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明一定濃度下的銅離子對(duì)酵母生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。且重組菌（S.cerevisiae 82-9-35-CUP1）的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于原菌株（S.cerevisiae 82-9-35），與試驗(yàn)前預(yù)測(cè)：金屬硫蛋白的表面展示可提高酵母菌的重金屬耐受性相符合。

2.3.2 細(xì)胞表面金屬離子解析 根據(jù)圖7的回歸曲線和稀釋倍數(shù)（2 倍），由吸光度A 計(jì)算解析后的銅離子濃度，結(jié)果與圖8中試驗(yàn)結(jié)果相除得到單位菌體表面吸附的銅離子量。從圖9、圖10和表3可知，重組菌株表面的解析濃度要明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明金屬硫蛋白的表面展示顯著提高了酵母的胞外吸附能力，且單位菌體的吸附量也隨銅離子濃度的增加而增加，可能由于酵母菌細(xì)胞內(nèi)吸附銅離子速度遠(yuǎn)慢于細(xì)胞外吸附，而導(dǎo)致更高濃度的銅離子環(huán)境下酵母表面更容易堆積銅離子所致。

圖7 銅離子標(biāo)定回歸曲線Fig.7 Regression curve of copper ion calibration

圖8 銅離子耐受性曲線Fig.8 Copper ion tolerance curve

表3 酵母表面銅離子解析試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Analysis results of copper ions on the surface of yeast

圖9 解析后銅離子濃度的統(tǒng)計(jì)圖Fig.9 Statistical graph of copper ion concentration after analysis

圖10 單位菌體表面吸附銅離子統(tǒng)計(jì)圖Fig.10 Statistical graph of adsorption of copper ions on the surface of a unit cell

3 討論

酵母表面展示技術(shù) （Yeast surface display，YSD） 是一種將蛋白質(zhì)自動(dòng)固定在酵母細(xì)胞表面的技術(shù)，研究已成功地將不同的酶，如纖維素酶、脂肪酶和金屬結(jié)合肽蛋白等固定在細(xì)胞表面，通過(guò)生物自身的代謝，最大限度地提高各種蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和活性[21-23]。酵母菌株全細(xì)胞在生物催化過(guò)程中具有多種優(yōu)勢(shì)：所需的反應(yīng)條件溫和，具有立體選擇轉(zhuǎn)化的能力，而無(wú)需添加昂貴的外部輔因子，生物催化劑易于回收，產(chǎn)生的廢棄污染物少，而且具有在難以穿透細(xì)胞或蛋白質(zhì)固定化的底物上催化反應(yīng)的可能性[22，24-25]。因此，它提供了在不利的介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)的機(jī)會(huì)，并增加了異源蛋白對(duì)pH 值、溫度、有機(jī)溶劑或蛋白酶的穩(wěn)定性，可以最大程度地減少或完全避免酶對(duì)產(chǎn)品的污染，甚至可以改善其動(dòng)力學(xué)性能[26]。除此之外，pH 值對(duì)金屬硫蛋白的金屬吸附也有很大的影響[27]。金屬硫蛋白在低pH 值條件下很穩(wěn)定，然而當(dāng)pH 值調(diào)至中性時(shí)，金屬硫蛋白分子間發(fā)生二硫交聯(lián)，形成大分子聚合物，對(duì)金屬吸附能力產(chǎn)生影響[28]，溫度等則會(huì)對(duì)其吸附金屬時(shí)的化學(xué)反應(yīng)效率產(chǎn)生影響[29]。Kao 等[30]通過(guò)將金屬硫蛋白分別表達(dá)在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞周質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)位置對(duì)細(xì)胞金屬吸附能力的提高有一定影響，細(xì)胞周質(zhì)提高細(xì)胞吸附性的幅度更大。酵母細(xì)胞表面展示金屬硫蛋白可以提高酵母的重金屬吸附能力，金屬硫蛋白在表面快速的吸附重金屬離子后，便依賴于宿主細(xì)胞的代謝，進(jìn)行緩慢的胞內(nèi)累積過(guò)程[31]，故而相較于在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)金屬硫蛋白，以提高細(xì)胞對(duì)金屬離子的吸附能力，細(xì)胞表面展示具有更大的優(yōu)勢(shì)，不僅它本身可以吸附金屬，還能提高重組菌吸附金屬的能力和金屬耐受性。

在酵母表面展示蛋白質(zhì)，展示效率可能在很大程度上取決于目標(biāo)肽/蛋白質(zhì)的大小和性質(zhì)[32]、錨長(zhǎng)度和間隔、連接區(qū)的位置[33]、錨定蛋白本身的性質(zhì)和啟動(dòng)子的影響[34]。啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要元件，可顯著影響目標(biāo)基因所轉(zhuǎn)錄的mRNA的豐度以及mRNA 的降解速率等，進(jìn)而影響目標(biāo)蛋白在宿主中的表達(dá)[35]。為了提高細(xì)胞表面展示效率，不僅需要根據(jù)目標(biāo)蛋白選擇合適的錨固系統(tǒng)，還需要增加表面展示基因表達(dá)盒的拷貝數(shù)，并且實(shí)現(xiàn)宿主二倍體化[36]。如Yamada 等[37]報(bào)道，當(dāng)表面展示纖維素酶的工程酵母菌株通過(guò)交配進(jìn)行二倍化并評(píng)估其乙醇發(fā)酵性能時(shí)，觀察到乙醇產(chǎn)率增加約2.5 倍。在本試驗(yàn)中為了提高展示效率，構(gòu)建了高拷貝質(zhì)粒GAP-α-factor-Flo1p-CUP1，選擇了強(qiáng)啟動(dòng)子GAP 和二倍體釀酒酵母宿主，這是由于與單倍體菌株相比，二倍體菌株具有更高的細(xì)胞生長(zhǎng)速率，細(xì)胞產(chǎn)量和對(duì)各種脅迫的耐受性。同時(shí)為了簡(jiǎn)化工藝，降低成本，試驗(yàn)選擇具有絮凝功能的Flo1p 蛋白作為錨定蛋白，在發(fā)酵結(jié)束后，酵母細(xì)胞間相互黏連形成絮凝顆粒沉積到罐底，有利于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液和沉積物的分離。

截至目前，釀酒酵母表達(dá)異源蛋白使用最多的信號(hào)肽是依然是α-factor 信號(hào)肽[38]。α-factor 信號(hào)肽不僅含有1 個(gè)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽（19 aa），還包含有1 個(gè)前導(dǎo)區(qū)（66 aa）。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽被切除，形成囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，在高爾基體中，再由Kex2 內(nèi)肽酶剪切羧基端肽鍵釋放前導(dǎo)區(qū)，形成具有功能的蛋白質(zhì)，最終在囊泡包裹下抵達(dá)細(xì)胞外并發(fā)揮蛋白功能[39]。α-factor 信號(hào)肽幫助蛋白質(zhì)穿膜引導(dǎo)外源蛋白在酵母中的分泌表達(dá)，其有利于重組菌的篩選和表達(dá)[34]?；谝陨弦蛩?，為了確保從表達(dá)盒產(chǎn)生的包含金屬硫蛋白的融合蛋白能夠通過(guò)細(xì)胞機(jī)制正確地定向到細(xì)胞表面，本研究引入了α-factor 信號(hào)肽。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以金屬硫蛋白基因CUP1 為目的基因，F(xiàn)lo1 為錨定蛋白基因，通過(guò)酵母表面展示技術(shù)搭建了釀酒酵母表面展示系統(tǒng)，并成功在細(xì)胞表面表達(dá)。使酵母菌作為銅離子吸附劑的效率更高，同時(shí)監(jiān)測(cè)重組酵母的生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，表面展示CUP1并沒(méi)有對(duì)宿主菌株造成代謝壓力而對(duì)其生長(zhǎng)造成不利影響。探索了重組酵母關(guān)于銅離子的耐受性以及對(duì)銅離子的吸附力，最終結(jié)果表明，金屬硫蛋白的表面展示對(duì)提高酵母菌銅離子耐受性和胞外銅離子吸附能力有顯著效果。