申 悅，崔方超*，李婷婷，王當豐，劉景云，譚茜倩，呂欣然，勵建榮

（1 渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 大連民族大學生命科學學院 遼寧大連 116600）

群體感應(yīng)是細菌間進行信息交流的一種方式，通過分泌信號分子來達到交流的目的，從而調(diào)控相應(yīng)功能基因的表達，使細菌表現(xiàn)出一些表型特征，如毒力因子的分泌、生物被膜的形成、細菌運動性和擴散性的增強等[1]。這些行為一方面能夠增強細菌自身的防御能力，提高生存能力，另一方面會導致一些病原菌毒力因子和致病基因的表達[2]。群體感應(yīng)系統(tǒng)存在于許多水產(chǎn)腐敗菌中，能夠參與并調(diào)控水產(chǎn)品的腐敗進程，如胞外蛋白酶的產(chǎn)生、生物被膜的形成、黏液的分泌等，對水產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生嚴重的影響。溫和氣單胞菌是魚類等水產(chǎn)品低溫貯藏過程中常見的腐敗菌之一，能夠產(chǎn)生AHLs 來調(diào)控其生物被膜的產(chǎn)生，蛋白酶的表達和群集泳動[3]。大量化學保鮮劑的使用使細菌出現(xiàn)耐藥性，增加了水產(chǎn)品食用的危險。尋找安全的群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitors，QSIs）來干擾或破壞其參與調(diào)控的生物學功能，可在非致死條件下阻斷依賴QS 的細菌侵染，并抑制相關(guān)致腐因子的分泌，從而為解決細菌耐藥性，控制水產(chǎn)品品質(zhì)變化，延長水產(chǎn)品的貨架期提供新的途徑[4]。

群體感應(yīng)淬滅（Quorum quenching，QQ）通過抑制信號分子的合成和積累，或?qū)π盘柗肿舆M行降解和修飾，以此破壞細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而阻斷腐敗菌或致病菌帶來的不利影響[5]。群體感應(yīng)淬滅酶（Quorum quenching enzymes）能利用群體感應(yīng)中的信號分子AHLs 作為底物，通過酶促反應(yīng)使AHLs 分解[6]。根據(jù)淬滅酶催化機制的不同，可分為內(nèi)酯酶、?；负脱趸€原酶。內(nèi)酯酶水解AHLs 內(nèi)酯環(huán)的酯鍵，?；杆怩；羌?，氧化還原酶可以催化氧化或還原AHLs。其中AHL 酰化酶能以不可逆的方式破壞高絲氨酸內(nèi)酯部分和?；溨g的酰胺鍵，釋放出游離高絲氨酸內(nèi)酯（HSL）和相應(yīng)的脂肪酸[7]。AHL 酰化酶廣泛存在于各種細菌中，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，如銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）、Anabaena sp.PCC7120和青枯菌（Ralstonia solanacearum），然而其底物特異性因AHL 的不同?；溔〈煌?。據(jù)報道銅綠假單胞菌PAO1中存在2 種?；D(zhuǎn)移酶PvdQ 和QuiP，兩者都可以編碼AHL 酰化酶，并降解3O-oxo-C12-HSL[8]。Rodrigo 等[9]發(fā)現(xiàn)薰衣草鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）產(chǎn)生的AHL ?；窼lPA，對含有較長?；湹腁HLs 催化效率更高。Ivanova 等[10]發(fā)現(xiàn)?；改軌蛳拗沏~綠假單胞菌的生物膜形成。在活體動物模型中對該酶進行評估，結(jié)果該酶可將生物膜的形成延遲7 d。Kusada 等[11]從嗜酸菌MRS7 中分離并鑒定一種新的AHL ?；福∕acQ），該酶具有降解多種AHLs 的能力，包括C6到C14側(cè)鏈，并且內(nèi)酯環(huán)上3 號碳原子的氧取代不影響該酶的降解能力。

熒光假單胞菌 （Pseudomonas fluorescens）是水產(chǎn)品貯藏過程中常見的嗜冷菌，屬于好氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性細菌。由于其適應(yīng)性強，生長周期短，胞外酶活性高，被公認為動物和水產(chǎn)品中的主要腐敗菌[12]。本實驗室從腐敗大菱鲆中分離出一株熒光假單胞菌。在該菌株中發(fā)現(xiàn)pf-1240基因編碼的蛋白序列與QuiP 蛋白的氨基酸序列一致性達65.82%。有文獻報道，QuiP 可降解AHLs，推測熒光假單胞菌PF-1240 蛋白可能也具有降解AHLs 的活性，可抑制細菌間的群體感應(yīng)現(xiàn)象，從而抑制腐敗菌的腐敗特性，達到延緩水產(chǎn)品腐敗的效果。迄今為止，還沒有關(guān)于從熒光假單胞菌中克隆AHL 降解酶的報道。本研究以熒光假單胞菌為研究對象，從其全基因組中克隆pf-1240基因，并分析其生物信息學特征，以期為后續(xù)揭示該酶淬滅AHLs，抑制腐敗菌群體感應(yīng)現(xiàn)象提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試菌：熒光假單胞菌 （Pseudomonas fluorescens）PF08 從腐敗大菱鲆中分離、鑒定，保藏于渤海大學食品科學學院水產(chǎn)品貯藏與加工研究所。

1.2 主要試劑和儀器

LB 肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司；50×TAE 緩沖液、瓊脂糖、DNA 分子量標準Maker（100～5 000 bp）、DiaSpin 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、Gold view 核酸染色劑，上海生工生物工程有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-Gal、氨芐青霉素 （Amp），北京索萊寶科技有限公司；PrimeSTARRMax DNA Polymerase，北京寶生物生物技術(shù)有限公司；Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTARR試劑盒，大連Takara 公司。

DL-CJ-2N 超級潔凈工作臺，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；ABI stepone plus PCR 儀，德國Eppendorf 公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；Quantity One 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；PE Victor X3 酶標儀，美國Perkin Elmer 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA 的提取及目的基因的擴增 將PF08 從-80 ℃超低溫冰箱中取出，按1∶100 的體積比接種于新鮮LB 肉湯液體培養(yǎng)基中，在28℃，160 r/min 條件下，過夜培養(yǎng)12～16 h，繼續(xù)用相同的方法對菌株進行傳代，待菌株生長到OD595nm為0.6 時備用。

采用加熱法快速提取DNA，取1 mL 菌液加入1.5 mL 離心管中8 000×g 室溫離心5 min 后，棄上清，將菌體溶解于100 μL 無菌水中，95 ℃加熱10 min，再次離心，所用的DNA 即溶解于上清中。

根據(jù)NCBI 中報道的該菌株的青霉素?；富蛐蛄校╓P_017137176.1 AYG06728.1）利用生工在線工具（http：//www.sangon.com/newPrimerDesign）進行擴增引物的設(shè)計，并送至上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 熒光假單胞菌pf-1240 基因引物序列Table 1 The primers of pf-1240 gene of Pseudomonas fluorescens

PCR 擴增反應(yīng)體系為：DNA 模板1.0 μL，PrimeSTARRMax DNA Polymerase 25 μL，ddH2O 22.4 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，總體積50 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序：95 ℃，預(yù)變性4 min；98 ℃，變性10 s；65 ℃，退火18 s；72 ℃，延伸2 min；72 ℃，保持5 min；循環(huán)25 次，4 ℃保溫。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠成像系統(tǒng)的擴增效果并照相。

1.3.2 目的基因的純化及TA 克隆測序 利用DiaSpin 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，對擴增的目的基因進行純化，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳。確定純化成功后，進行加“A”反應(yīng)，反應(yīng)液立即與pMD20-T 載體連接，而后轉(zhuǎn)化到E.coli JM109感受態(tài)細胞中，在SOC 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)1 h后，涂布到選擇培養(yǎng)基上，挑選白色菌落進行陽性鑒定，具體步驟參照梅永超[13]的方法，鑒定成功后，送去北京天一輝公司進行測序。

1.4 pf-1240 基因序列生物信息學分析

利用紐普生物在線DNA 序列翻譯成氨基酸序列的網(wǎng)站（https：//www.novopro.cn/tools/translate.html）。將pf-1240 基因序列上傳到網(wǎng)站中，選擇閱讀框1 為翻譯起始位置，序列順序為正向，選用standard（1）模式進行翻譯，翻譯結(jié)果用于下一步分析。將氨基酸序列導入ProtParam 在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam/） 對pf-1240 編碼的蛋白進行理化性質(zhì)預(yù)測和氨基酸組成分析，得出該蛋白的分子質(zhì)量、分子式、等電點、氨基酸組成等理化性質(zhì)。利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析PF-1240 蛋白親/疏水性，打開網(wǎng)址后，將蛋白序列輸入對話框內(nèi)，選擇Hphob./ Kyte &Doolittle 即可分析出蛋白的親/疏水性；利用Net NGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對蛋白的N-糖基化位點進行預(yù)測，用NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對蛋白的磷酸化位點進行預(yù)測；采用TMHMM Server v.2.0 預(yù)測蛋白跨膜區(qū)域；用CDD 工具選擇CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/） 分析蛋白的結(jié)構(gòu)域[14]；采用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html） 和COILS server （https：//embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html） 對蛋白二級結(jié)構(gòu)及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)進行分析[15-16]；利用Protcomp 9.0 軟件對蛋白的亞細胞定位進行分析[17]；利用Discovery Studio（DS）對PF-1240 蛋白進行三級結(jié)構(gòu)建模[18]。利用NCBI 在線軟件比對功能 （BLAST：Basic Local Alignment Search Tool）對PF-1240 蛋白的氨基酸序列進行蛋白質(zhì)同源性分析。之后選擇同源性高的9 個氨基酸序列在MEGAX 軟件運用最小鄰距離法 （Neighbor-Joining，NJ） 并選用自長支持率（Bootstrap）1 000 次重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，對PF-1240 蛋白進行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光假單胞菌PF08 的pf-1240 基因PCR擴增、克隆

以PF08 的全基因組DNA 為模板，PCR 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖1a 所示。其中泳道1為擴增產(chǎn)物，可以看出擴增出的條帶在2 000～3 000 bp 之間，與目的基因的大小相符，初步確定擴增出了與預(yù)期大小一致的片段。將上述PCR 產(chǎn)物進行純化，純化結(jié)果見圖1a 中泳道2，能夠看出與純化前的條帶大小一致，可以用于下一步試驗。

將轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化子涂布于選擇性培養(yǎng)平板上，長出的菌落如圖1b 所示，可觀察到其分為藍色和白色，其中藍色菌落應(yīng)為空載體轉(zhuǎn)化子，而白色菌落應(yīng)為重組載體轉(zhuǎn)化子即陽性克隆子。隨機挑選10 個陽性克隆子，進行PCR 擴增驗證，結(jié)果如圖1c 顯示。10 個擴增條帶大小符合預(yù)期且清晰無雜帶，說明挑取的陽性克隆子全部成功導入了目的基因，下一步即可將陽性克隆子送去測序。

圖1 目的基因的克隆Fig.1 Cloning of target gene

2.2 測序結(jié)果及序列比對

通過TA 克隆測序，得到了2 389 bp 的pf-1240 基因（WP_120731947.1）全長。與NCBI 數(shù)據(jù)庫中熒光假單胞菌青霉素?；讣易寤颍℅ene ID：61637474）的相似性為83.90%。

2.3 pf-1240 基因的序列分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)。經(jīng)ExPaSy PortParam 在線軟件預(yù)測顯示熒光假單胞菌pf-1240 基因共編碼795 個氨基酸，推測對應(yīng)的蛋白分子式為C3867H6010N1084O1160S19，相對分子質(zhì)量為86 855.96，理論等電點（pI）為7.81，不穩(wěn)定系數(shù)為35.29，說明該蛋白質(zhì)是一個穩(wěn)定的蛋白（＞40為不穩(wěn)定蛋白），脂肪指數(shù)為79.65，總平均親水性為-0.344，蛋白總平均親水系數(shù)為負值，屬于親水蛋白。氨基酸疏水性是氨基酸的一種基本性質(zhì)，疏水性氨基酸位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，由于其疏水性的相互作用，故在保持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)上起作用。圖3中的橫坐標表示氨基酸位置，縱坐標表示得分，Score 值小于0 表示親水，大于0 表示疏水。其氨基酸最大疏水性位置為163 位亮氨酸，最大值為2.400，第153 位脯氨酸出現(xiàn)最小值為-2.633。氨基酸組成如表2所示，其中含量最高的是丙氨酸（Ala），占11.84%。

表2 熒光假單胞菌PF-1240 蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of Pseudomonas fluorescens PF-1240 protein

圖2 pf-1240 基因測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of pf-1240 gene

圖3 氨基酸親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic-hydrophobic property analysis of amino acid

2.4 PF-1240 蛋白信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過SignalP-5.0 Server 分析PF-1240 氨基酸序列預(yù)測信號肽。如圖4所示，其中SP 表示由Sec 易位子轉(zhuǎn)運并被信號肽酶I（Lep）切割的“標準”分泌信號肽；TAT 表示由雙精氨酸轉(zhuǎn)Tat 易位子轉(zhuǎn)運并被信號肽酶I（Lep）切割的Tat 信號肽；LIPO 表示由Sec 易位子轉(zhuǎn)運并被信號肽酶II（Lsp） 切割的脂蛋白信號肽。預(yù)測結(jié)果顯示PF-1240 蛋白可能存在脂蛋白信號肽，存在的概率為0.4521，裂解位點在第9 和第10 個氨基酸之間，這與已有的研究有所不同。已有的研究中表明青霉素?；福≒enicillin G acylase，PGA）翻譯后利用雙精氨酸易位（Tat）機械將前體易位至周質(zhì)膜，然后進行自催化分子內(nèi)肽鍵裂解[19]?？缒そY(jié)構(gòu)域是指蛋白質(zhì)序列中跨越細胞膜的區(qū)域，通常為螺旋結(jié)構(gòu)，含20～25 個氨基酸殘基，構(gòu)成其蛋白質(zhì)的氨基酸大多數(shù)為疏水性氨基酸，運用TMHMM Server.v.2.0 對熒光假單胞菌PF-1240 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖5所示，整條多肽鏈均處于細胞膜外，說明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。這與目前已有研究的魚腥藻AiiC ?；赶嗨?，該酶是由2 544 bp 基因編碼847 個氨基酸的蛋白質(zhì)，N 末端區(qū)域存在1 個信號肽和1 個假定的跨膜結(jié)構(gòu)域，表明AiiC 定位在周質(zhì)中，其?；傅幕钚灾饕诰w裂解后的細胞碎片中發(fā)揮作用[20]。

圖4 PF-1240 蛋白信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction of signal peptide of PF-1240 protein

圖5 PF-1240 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測Fig.5 Prediction of protein transmembrane regions of PF-1240 protein

2.5 PF-1240 蛋白翻譯后修飾

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾 （Post-translational modification，PTM）是指對翻譯后的蛋白質(zhì)進行共價加工的過程，通過在1 個或多個氨基酸殘基加上修飾基團，可以改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，進而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和活性狀態(tài)、亞細胞定位、折疊及其穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的重要方式[21]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾使得蛋白具有特定功能，常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括泛素化、磷酸化、糖基化、甲基化、乙?；Ⅴセ?。糖基化（Glycosylation）是指蛋白質(zhì)或脂質(zhì)在酶的作用下被連接上糖鏈的過程。作為生物體內(nèi)最為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式之一，糖基化調(diào)控了蛋白質(zhì)在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性[22]。在此，運用NetNGlyc 1.0 對PF-1240 蛋白糖基化位點進行分析，結(jié)果見圖6。PF-1240 蛋白N-糖基化位點有5 個，分別位于第34，111，166，346，623 位氨基酸。

圖6 PF-1240 蛋白糖基化位點分析Fig.6 Protein glycosylation site analysis of PF-1240 protein

運用NetPhos 3.1 Server 在線軟件預(yù)測蛋白磷酸化位點，結(jié)果如圖7所示。該蛋白序列中有79 個潛在磷酸化位點，其中50 個絲氨酸磷酸化位點，19 個蘇氨酸磷酸化位點，10 個酪氨酸磷酸化位點。磷酸化是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾之一，對蛋白質(zhì)發(fā)揮信號傳導作用，具有重要意義[23]。

圖7 PF-1240 蛋白磷酸化的分析Fig.7 Protein phosphorylation site analysis of PF-1240 protein

2.6 PF-1240 蛋白亞細胞定位

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的具體存在部位。例如：在核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或者細胞膜上存在。亞細胞定位對于蛋白質(zhì)功能非常重要，蛋白質(zhì)必須處于合適的亞細胞定位才能行使其功能[24]。通過在線軟件PSORTb v.3.0 分析預(yù)測PF-1240 蛋白的亞細胞定位結(jié)果如表3，該蛋白主要分布在細胞周質(zhì)。因此，該蛋白主要在細胞周質(zhì)發(fā)揮作用。與其它?；割愃疲ㄟ^翻譯表達到胞外，與周圍環(huán)境中的AHLs 發(fā)生作用。

表3 蛋白亞細胞定位預(yù)測Table 3 Predicted of subcellular location of protein

2.7 PF-1240 蛋白開放閱讀框及保守結(jié)構(gòu)域分析

通過https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/在線軟件，預(yù)測了PF-1240 蛋白的開放閱讀框，如圖8 所示。該開放閱讀框由791 個氨基酸組成，與熒光假單胞PF01 的QuiP 序列（Genebank ID：Q3KH00.1）的一致性為100%，證明該蛋白屬于群體感應(yīng)信號分子淬滅酶的一種，與QuiP 具有類似的功能。

圖8 PF-1240 蛋白開放閱讀框預(yù)測Fig.8 Prediction of PF-1240 protein open reading frame

AHL ?；甘且环NAHL 降解酶，通過水解?；鶄?cè)鏈和HSL 部分之間的酰胺鍵來切割A(yù)HL 分子，其方式與青霉素?；傅淖饔梅绞椒浅Ｏ嗨啤１Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域在基因功能中發(fā)揮重要作用。NCBI 的結(jié)構(gòu)域預(yù)測（圖9）顯示該肽鏈中含有1 個保守結(jié)構(gòu)域，氨基酸第35～779 位為Penicil_amidase 結(jié)構(gòu)域，E-value 為0，證明其結(jié)構(gòu)預(yù)測可靠，說明在這段序列中有一個完整的青霉素酰胺酶結(jié)構(gòu)域，在這個結(jié)構(gòu)域中只有1 個絲氨酸催化中心。通過在線程序InterPro 對蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析，有6個蛋白條目與目的蛋白匹配成功（圖10）。其中匹配最成功的條目是IPR002692：Penicillin/GL-7-ACA/AHL/aculeacin-A acylase。數(shù)據(jù)庫定義這些家族中的蛋白代表了一些?；福鼈兌紝儆贛EROPS 肽酶家族S45，是PGA 前體和頭孢菌素?；盖绑w，也是一類自發(fā)形成成熟?；府惗垠w的自裂解蛋白質(zhì)。該家族包括AHL ?；窹vdQ 和QuiP，以及已證明具有青霉素?；富钚缘腁CULACIN-A ?；竅25]。目的蛋白從第5 個到792 個氨基酸與IPR002692 蛋白相一致，第31 個到788 個氨基酸與IPR029055 （N 端親核氨基水解酶）同源超家族蛋白序列相匹配，該家族中的蛋白利用氨基末端殘基的側(cè)鏈，結(jié)合在β 折疊上，作為親核分子在羰基碳上的催化攻擊。這一家族的一個重要成員嗜黃菌的PGA 被證明能夠降解鏈長為6～8 個碳的AHLs[26]。通過詳細的結(jié)構(gòu)研究，已經(jīng)證實AHL ?；概c所有其它青霉素酰化酶屬于同一個Ntn 水解酶超家族[27]，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果，可以推測出PF-1240 蛋白屬于PGA，具有?；傅墓δ?。

圖9 PF-1240 蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.9 Structural domain prediction of PF-1240 protein

圖10 PF-1240 蛋白保守結(jié)構(gòu)域匹配序列Fig.10 PF-1240 Protein conserved domain matching sequence

2.8 PF-1240 蛋白二級結(jié)構(gòu)特征

通過SOPM 程序預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，如圖11所示。其中α-螺旋區(qū)域有344 個氨基酸，占42.01%，β 折疊有70 個氨基酸，占8.81%，無規(guī)則卷曲有290 個氨基酸，占36.48%，延伸鏈區(qū)有101個氨基酸，占12.7%。從蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)來看，無規(guī)則卷曲和α-螺旋是PF-1240 蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件，分散于整條多肽鏈；而延伸鏈和β-折疊相對較少，其中2 個明顯的α-螺旋分別位于兩端。使用COILS server 預(yù)測了蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖12，顯示了在 3 種窗口寬度下的檢測值均較低，表明蛋白中可能不存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

圖11 PF-1240 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.11 Prediction of PF-1240 protein secondary structure

圖12 PF-1240 蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.12 Prediction of PF-1240 protein coil structure

2.9 PF-1240 蛋白的生物進化分析

依據(jù)PF08 的pf-1240 基因編碼的蛋白序列以及對其潛在功能的預(yù)測，在NCBI 中進行Blast同源性檢索，獲取多個菌株的PF-1240 同源蛋白序列進行多序列比對，包括鏈霉菌（Strepyomyces sp.）的 AhlM、銅綠假單胞菌的PvdQ、PA0305 和QuiP、丁香假單胞菌 （Pseudomonas syringae）的Psyr_1971 和Psyr_4858、希瓦氏菌（Shewanella sp.）的Aac，蒼白桿菌（Bacillus pallidus）A44 編碼aiiO 的AHL 酰化酶，R.alstonia sp.XJ12B 的aiiD，并用MEGA-X 軟件鄰位相連法 （Neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果證明熒光假單胞菌PF-1240 蛋白與銅綠假單胞菌的QuiP 氨基酸序列同源性較高，為65.82%，進化關(guān)系最為接近，且在其它物種中也具有很高的保守性。

2.10 PF-1240 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測建模

通過 Discovery Studio （DS） 的 Homology Modeling 方法自動預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，選用4e56（間隔區(qū)縮短型頭孢菌素酰化酶突變體）為模板，通過DS 序列的比對，對序列進行適當修改，構(gòu)建出PF-1240 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，如圖14所示。青霉素?；讣易宓鞍椎那绑w包含了信號肽、中間肽、α 亞基和β 亞基。成熟的蛋白是由α 亞基和β亞基組成的二聚體，β 亞基的第1 個氨基酸絲氨酸是1 個保守的活性位點。從圖中可看出PF-1240 是由2 個不同大小的亞基組成，黃色部分為保守的絲氨酸活性位點。

圖13 PF-1240 蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.13 Phylogenetic tree of PF-1240 protein

圖14 PF-1240 蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.14 The tertiary structure of PF-1240 protein

3 結(jié)論

本研究從1 株大菱鲆源熒光假單胞菌中成功克隆得到全長2 235 bp 的pf-1240 基因，又通過生物信息學分析進一步確定了該蛋白的理化性質(zhì)。PF-1240 蛋白序列包含795 個氨基酸，預(yù)測氨基酸相對分子質(zhì)量為86 855.96，理論等電點pI 為7.81，α-螺旋占42.01%，β-折疊占8.81%。第35 個氨基酸到779 個為Penicil_amidase 結(jié)構(gòu)域，說明該蛋白屬于青霉素?；讣易宓鞍?，具有水解酰胺鍵的活性，能夠催化N-?；呓z氨酸內(nèi)酯和?；溨g的酰胺鍵斷裂。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的QuiP 是銅綠假單胞菌基因PA1032 的產(chǎn)物，作為第2 個AHL ?；福軌驕缁钽~綠假單胞菌的群體信號分子[28]，與PF-1240 蛋白的相似性為65.82%。Huang 等[29]發(fā)現(xiàn)QuiP 在銅綠假單胞菌PAO1 中的表達后，導致菌株P(guān)AO1 中3-O-C12-HSL 信號分子的積累減少，表明該酶對長鏈AHL具有活性。

由于群體感應(yīng)是存在于微生物中獨特的調(diào)控機制，從而使其成為人為調(diào)控微生物行為的潛在靶點，能夠在食品保鮮、生物發(fā)酵等領(lǐng)域顯現(xiàn)出應(yīng)用潛力。隨著細菌群體感應(yīng)現(xiàn)象研究的不斷深入，大量的群體感應(yīng)淬滅酶被發(fā)現(xiàn)，越來越多的淬滅酶結(jié)構(gòu)和功能被解析出來。通過DS 同源建模，能夠?qū)Φ鞍兹S空間有初步了解，為后續(xù)的試驗研究提供指導性意見。AHL ?；竿ㄟ^降解革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)AHL，從而調(diào)控毒力因子的形成。通過不斷的對其進行深入研究和分析，對人為控制細菌群體感應(yīng)造成的水產(chǎn)品腐敗具有非常誘人的應(yīng)用前景。