聶微，劉澤瑩，嚴(yán)芝強，成興真，劉麗榮，楊芳*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院 臨床檢驗基礎(chǔ)與血液學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 檢驗科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 胃腸外科，貴州 貴陽 550004)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，2020年全球胃癌發(fā)病率在全球癌癥排名第5，死亡率排名第4，中國胃癌新增病例占全球胃癌新增病例的44%[1]。由于胃癌早期癥狀無特異性，診斷十分困難，在大多數(shù)國家，5年存活率介于20%～40%[2]。因此尋找特異性高的診斷指標(biāo)，用于提高胃癌的早期診斷率迫在眉睫。可變剪接(alternative splicing,AS)是一種重要的基因轉(zhuǎn)錄后修飾方式，是指基因的mRNA前體經(jīng)過不同的剪接方式產(chǎn)生多個不同的成熟mRNA剪接異構(gòu)體的過程，最終產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)亞型[3-5]。研究表明，AS產(chǎn)生的多個轉(zhuǎn)錄本在腫瘤生物學(xué)特征，如增殖、凋亡、血管發(fā)生、藥物抵抗、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有不同的作用，甚至有的功能截然相反[6-13]，其產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)亞型在癌癥的許多病理生理過程中也表現(xiàn)出了不同的作用[14]。通過美國國家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)查詢可知β-內(nèi)酰胺酶基因(lactamase β,LACTB)位于15號染色體長臂(15q22.2)，共有7個外顯子，通過AS可形成3個編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本(NM_032857.5、NM_171846.4及NM_001288585.2)。已有研究表明，LACTB在肝細胞癌[15]、乳腺癌[16]、結(jié)直腸癌[17-19]、膠質(zhì)瘤[20]等腫瘤中表達下調(diào)，提示高表達LACTB可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲；在鼻咽癌中，LACTB表達升高卻是促進癌細胞惡性行為的原因之一[21]，這與LACTB在其他實體腫瘤中的研究完全不相符，其原因尚不能確定。LACTB在胃癌中的研究較少，涉及LACTB轉(zhuǎn)錄本在胃癌中的表達特點未見報道，因此，本研究主要探討LACTB轉(zhuǎn)錄本在胃癌細胞中的表達特點，檢測胃癌細胞中主要表達的轉(zhuǎn)錄本類型，初步分析LACTB轉(zhuǎn)錄本與胃癌的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 人正常胃黏膜細胞株GES-1，不同分化程度胃癌細胞株AGS(高分化)、MKN-28(中分化)、MKN-45(低分化)，未分化胃癌細胞株HGC-27均購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清(美國 Gbico)，UNlQ-10 柱式 Trizol總RNA抽提試劑盒和柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒(日本Takara)；ND ONE微量分光光度計(美國Thermo Scientific)，凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD)，熒光定量PCR儀LightCycler 480 System(美國Roche Diagnostics)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 所有細胞均使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；北美BI)的完全培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)；倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，每2～3 d傳代1次，收取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)研究。

1.2.2LACTB的特異性引物設(shè)計 通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查詢LACTB(GeneID：114294)相關(guān)的信息，可知LACTB共有7個外顯子，有3個注釋為NM序列的標(biāo)準(zhǔn)mRNA：轉(zhuǎn)錄本1(V1，NM_032857.5)、轉(zhuǎn)錄本2(V2，NM_171846.4)和轉(zhuǎn)錄本3(V3，NM_001288585.2)，2個注釋為XR序列的非編碼mRNA：XR1(XR_931745.2)和XR2(XR_429442.2)。轉(zhuǎn)錄本1、2、3前4個外顯子完全一樣，可設(shè)計相同的前向引物(F445)，而其3′末端不同，所以在其3′端不同序列部分設(shè)計不同的反向引物。轉(zhuǎn)錄本1包含1個特有的外顯子6，可在此設(shè)計反向引物；轉(zhuǎn)錄本2和轉(zhuǎn)錄本3的DNA序列區(qū)別僅在于轉(zhuǎn)錄本2比轉(zhuǎn)錄本3在第5個外顯子5′端多4個堿基，區(qū)別兩個轉(zhuǎn)錄本的反向引物主要在此設(shè)計。PCR實驗所用引物如圖1、表1所示，F(xiàn)445、R1174、R1158用于反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)，F(xiàn)445、R842、R981、R982用于巢式PCR，F(xiàn)148、F945-2、F945-3、F1092、R266、R1158、R1230用于反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)。

圖1 LACTB不同轉(zhuǎn)錄本引物設(shè)計

表1 引物序列

1.2.3總RNA提取 胃癌細胞株用6孔板培養(yǎng)至對數(shù)生長期，貼壁細胞取1孔用緩沖液清洗2次，加Trizol 1 mL吹打混勻，半懸浮細胞收集細胞沉淀加Trizol 1 mL吹打混勻，氯仿、無水乙醇、UNlQ-10柱式 Trizol總RNA抽提試劑盒按照試劑說明書提取并純化總RNA；提取的總RNA通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，采用微量分光光度計測量RNA濃度及A260∶A280的比值，A260∶A280為2.0提示RNA純度較好，比值過高則提示RNA有降解，比值較低則提示有殘余的蛋白質(zhì)存在[22]。驗證合格的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機六聚體引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4RT-PCR檢測胃癌細胞中LACTB3個轉(zhuǎn)錄本的表達 cDNA用引物對F445/R1174，F(xiàn)445/R1158進行RT-PCR，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，目的條帶切膠后用柱式 DNA 膠回收試劑盒純化DNA，純化的DNA用于巢式PCR、DNA測序、T-A克隆。RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，72 ℃完全延伸7 min，共40個循環(huán)。

1.2.5巢式PCR驗證RT-PCR產(chǎn)物特異性 F445/R1174擴增的產(chǎn)物回收純化后用引物F445/R824進行巢式PCR，進一步驗證目的條帶；F445/R1158擴增的產(chǎn)物回收純化后分別用引物F445/R982(針對轉(zhuǎn)錄本3)，F(xiàn)445/R981(針對轉(zhuǎn)錄本2)進行巢式PCR，以此鑒別標(biāo)本中表達的是轉(zhuǎn)錄本2還是轉(zhuǎn)錄本3。

1.2.6DNA測序驗證RT-PCR產(chǎn)物特異性 F445/R1174擴增的產(chǎn)物回收純化后直接使用DNA測序儀進行測序；F445/R1158擴增的產(chǎn)物通常包含2個目的條帶，因此先將回收純化的產(chǎn)物通過original TA cloning kit(T-A)方法克隆后挑選陽性菌落再進行DNA測序，測序結(jié)果通過NCBI BLAST功能進行比對，確定是否是目的基因LACTB相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本。

1.2.7T-A克隆驗證LACTB轉(zhuǎn)錄本2和3的序列情況 由于Taq DNA 聚合酶等擴增的PCR產(chǎn)物帶A尾，將F445/R1158進行RT-PCR的擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳將目的條帶純化回收后，與pUCI-T Zero Cloning Vector連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，取菌液200 μL涂板含氨芐抗性的luria-bertani(LB)培養(yǎng)基 或super optimal broth with catabolite repression(SOC)培養(yǎng)基固體培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜用牙簽挑取白色菌落，以通用引物 M13F/R(M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC)進行測序從而獲得目的條帶DNA序列，結(jié)果通過NCBI BLAST功能進行比對確定該條帶是否是LACTB的轉(zhuǎn)錄本2或3。

1.2.8RT-qPCR檢測胃癌細胞中LACTB3個轉(zhuǎn)錄本mRNA表達水平 從胃癌細胞株中提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA采用 TB Green Premix Ex TaqⅡ進行RT-qPCR分析。引物對F1092/R1230用于分析轉(zhuǎn)錄本1，F(xiàn)945-2/R1158用于分析轉(zhuǎn)錄本2，F(xiàn)945-3/R1158用于分析轉(zhuǎn)錄本3，計算LACTB轉(zhuǎn)錄本相對表達量時使用HPRT作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20 μL，擴增條件為：95℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析各個轉(zhuǎn)錄本的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LACTB 3個轉(zhuǎn)錄本的表達

從對數(shù)生長期的胃癌細胞中提取合格的RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行RT-PCR。使用針對LACTB轉(zhuǎn)錄本1的引物F445/R1174進行RT-PCR，擴增產(chǎn)物回收DNA并進行巢式PCR和DNA測序后發(fā)現(xiàn)在胃黏膜細胞株(GES-1)和4株胃癌細胞(AGS、MKN-28、MKN-45、HGC-27)中只檢測到LACTB的轉(zhuǎn)錄本1，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本XR1、XR2(圖2A～B)。再使用能夠同時擴增出轉(zhuǎn)錄本2和3的引物F445/R1158進行RT-PCR，并將目的條帶回收進行巢式PCR和T-A克隆以進一步驗證產(chǎn)物。巢式PCR可擴增出特異性產(chǎn)物；T-A克隆結(jié)果共有9個陽性克隆子，通過測序確定其中6個為轉(zhuǎn)錄本2，3個為轉(zhuǎn)錄本3(圖2C～E)。

注：A為 LACTB 轉(zhuǎn)錄本1在胃癌細胞株中的表達情況，B為轉(zhuǎn)錄本1測序結(jié)果，C為LACTB轉(zhuǎn)錄本2和3在胃癌細胞株中的表達情況，D、E分別為LACTB 轉(zhuǎn)錄本2、3的測序結(jié)果；綠色峰代表堿基A，紅色峰代表堿基T，黑色峰代表堿基G，藍色峰代表堿基C。

2.2 LACTB 3個轉(zhuǎn)錄本在胃癌細胞中的定量

結(jié)果顯示(圖3)，以胃黏膜細胞株GES-1為對照，轉(zhuǎn)錄本1在胃癌細胞株AGS、MKN-28及MKN-45中高表達(P<0.05)，在HGC-27中低表達(P<0.05)；以胃黏膜細胞株GES-1為對照，轉(zhuǎn)錄本2在胃癌細胞株AGS、MKN-28、MKN-45、HGC-27中低表達(P<0.05)；以胃黏膜細胞株GES-1為對照，轉(zhuǎn)錄本3在胃癌細胞株MKN-28、MKN-45、HGC-27中低表達(P<0.05)，在AGS(0.75±0.21)中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；提示LACTB轉(zhuǎn)錄本1在胃癌細胞中高表達，轉(zhuǎn)錄本2和3在胃癌中則為低表達。

注：與GES-1細胞同轉(zhuǎn)錄本比較，(1)P<0.01,(2)P<0.05,(3)P<0.001。

3 討論

AS在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在細胞生物學(xué)的各個方面都有直接的影響[23-24]。Sneath等[25]研究顯示，CD44的AS產(chǎn)生的某些特定的CD44變異體與許多人類惡性腫瘤有關(guān)。例如，通過hnRNPK調(diào)節(jié)CD44E選擇性剪接可促進胃癌發(fā)生[26]。因此不同AS形成的轉(zhuǎn)錄本可能發(fā)揮正常生理功能，也可能產(chǎn)生病理作用甚至導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。LACTB與腫瘤密切相關(guān)，包含3個不同的轉(zhuǎn)錄本，可通過抑制線粒體磷脂酰絲氨酸脫羧酶進一步降低溶血磷脂酰乙醇胺和磷脂酰乙醇胺的水平，從而抑制腫瘤細胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞出現(xiàn)高分化表皮細胞形態(tài)[27]。在乳腺癌和結(jié)直腸癌中，LACTB主要受MicroRNA的負調(diào)控[16,19]；在結(jié)直腸癌細胞中誘導(dǎo)LACTB過表達后可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路調(diào)節(jié)自噬進而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)并增加上皮細胞標(biāo)記物的表達，抑制胃癌細胞的惡性行為[18]。而在鼻咽癌中，是通過沉默LACTB抑制ERBB3/EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加組蛋白H3的穩(wěn)定性進而抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移[21]，LACTB在不同腫瘤中的作用可能完全相反，原因可能是LACTB在不同腫瘤中發(fā)揮作用的機制不同，也有可能是LACTB產(chǎn)生功能作用的轉(zhuǎn)錄本不同，并且，不同的轉(zhuǎn)錄本表達模式還可預(yù)測癌癥的預(yù)后[28]。因此，探索LACTB基因在胃癌中的功能及作用機制前，首先需要了解該基因的轉(zhuǎn)錄本在胃癌細胞中的表達特點。

通過NCBI查詢可知，LACTB存在3個編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本和2個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本，針對轉(zhuǎn)錄本1的引物可同時擴增2個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本XR1、XR2，但在RT-PCR及DNA測序?qū)嶒灲Y(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)XR1、XR2，結(jié)果提示胃癌細胞中XR1、XR2的表達水平很低甚至不表達；雖然轉(zhuǎn)錄本2和3的DNA序列僅相差4個堿基，但擴增產(chǎn)物通過巢式PCR可擴增出特異性產(chǎn)物，同時將擴增產(chǎn)物進行T-A克隆后通過DNA測序進行序列比對，結(jié)果證實產(chǎn)物為LACTB的轉(zhuǎn)錄本2和3。

本研究中不同分化程度的胃癌細胞株中均表達LACTB的3個編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本，且在胃癌細胞中LACTB轉(zhuǎn)錄本1表達水平升高，轉(zhuǎn)錄本2和3水平降低。由此提示胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中主要表達的轉(zhuǎn)錄本類型為轉(zhuǎn)錄本1。此外，還發(fā)現(xiàn)LACTB轉(zhuǎn)錄本1在分化水平較好的細胞株中為高表達，而在未分化胃癌細胞株中表達水平顯著低于對照株，轉(zhuǎn)錄本2和3均為低表達，提示LACTB轉(zhuǎn)錄本1的表達水平可能是胃癌細胞分化的一個標(biāo)志物，由于LACTB可維持細胞的正常生長和分化[17]，因此當(dāng)胃癌細胞處于未分化階段時，轉(zhuǎn)錄本1表達水平低。當(dāng)胃癌細胞3個轉(zhuǎn)錄本表達水平顯著減低時可能預(yù)示細胞分化差，惡性程度高，這一結(jié)論需要進一步的實驗驗證。

綜上所述，在胃癌中主要表達LACTB轉(zhuǎn)錄本1，可能主要通過LACTB轉(zhuǎn)錄本1相關(guān)的作用途徑影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。目前所有的研究中只檢測了LACTB總mRNA的表達量，均未提及LACTB轉(zhuǎn)錄本的表達特點。而本研究涉及了LACTB轉(zhuǎn)錄本的表達情況，且研究結(jié)果顯示胃癌細胞中LACTB轉(zhuǎn)錄本1表達水平顯著上升，推測LACTB轉(zhuǎn)錄本1與胃癌發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系，而在其他實體腫瘤中主要表達的可能是其他轉(zhuǎn)錄本，從而呈現(xiàn)完全相反的作用。但目前對于LACTB在胃癌中的作用機制尚不清楚，因此后期可以此為實驗基礎(chǔ)進行下一步研究。