任天琦，劉澤霖，胡海，劉宏鵬，李小冬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 骨外科，黑龍江 哈爾濱 150001)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種慢性退行性骨關(guān)節(jié)病，以膝關(guān)節(jié)軟骨變性、損壞及繼發(fā)骨質(zhì)增生為主要病理特征，好發(fā)于中老年女性群體，可引起患者關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限、功能喪失甚至殘疾，給患者的日常生活帶來不便和痛苦[1-2]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一的細(xì)胞成分，其增殖與凋亡在關(guān)節(jié)軟骨組織的維持、塑形、更新中發(fā)揮重要作用[3]。大多數(shù)研究認(rèn)為，軟骨細(xì)胞的過度凋亡是引起關(guān)節(jié)軟骨變性、損壞并導(dǎo)致KOA發(fā)生、病情惡化的主要原因，阻止或延緩其凋亡是防治KOA的關(guān)鍵[4]。甘草甜素，又名甘草酸，是藥用植物甘草的有效活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素可通過調(diào)控炎癥和氧化應(yīng)激等途徑，對(duì)膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎起治療作用，但對(duì)KOA的影響及作用機(jī)制尚不明確[6]。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是具有雙磷酸化酶活性的抑癌基因，可抑制下游蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)通路活化，進(jìn)而阻斷環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)介導(dǎo)的炎癥途徑[7-8]。研究表明，COX-2介導(dǎo)的炎癥途徑在KOA的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[9]。因此，本研究將從PTEN/AKT/COX-2信號(hào)通路的角度探討甘草甜素對(duì)KOA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響，以期為防治KOA提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只雄性10周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量320 g左右，購自肇慶市瑞思元生物科技有限公司[SCXK(粵)2020-0053]。大鼠在無菌環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，飲水、進(jìn)食自由，12 h/12 h明暗光照，溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度50%左右。

1.1.2主要試劑和儀器 雙氯芬酸鈉緩釋片(南京易亨)，甘草甜素(美國(guó) Selleck)，大鼠血清白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒及蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色試劑盒(北京索萊寶)，原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(上海吉至)，一抗PTEN、p-AKT、AKT、COX-2、Bax、cleaved caspase-3、GAPDH及二抗(英國(guó) Abcam)，CKX41SF顯微鏡(日本 Olympus)，電子游標(biāo)卡尺(日本 Mitutoyo)。

1.2 造模和分組

將80只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、KOA組、陽性藥物組及低、高劑量甘草甜素組，每組16只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠根據(jù)Hulth法制備大鼠KOA模型[10]：大鼠禁食12 h，在無菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，以仰臥位固定，右膝關(guān)節(jié)常規(guī)備皮、消毒，于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱行切1 cm，打開關(guān)節(jié)腔，切除1/3的內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，止血并逐層縫合切口，術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射抗生素預(yù)防感染；假手術(shù)組僅打開關(guān)節(jié)腔，不進(jìn)行其他處理，縫合切口，防感染處理。術(shù)后2 周開始灌胃給藥，陽性藥物組大鼠灌胃6.75 mg/kg雙氯芬酸鈉，低、高劑量甘草甜素組大鼠分別灌胃50、100 mg/kg甘草甜素[11]，其余組灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥4 周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1膝關(guān)節(jié)腫脹情況 電子游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠術(shù)前、術(shù)后2 周、給藥2 周、給藥4 周的膝關(guān)節(jié)直徑，測(cè)量3次，取均值。

1.3.2IL-1β、IL-6、TNF-α含量 末次給藥24 h后，大鼠腹主動(dòng)脈取血3 mL于EP管中，3 000 r/min低溫離心5 min收集血清，采用大鼠 ELISA試劑盒分別檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按試劑盒說明書方法操作。

1.3.3軟骨組織形態(tài) 1.3.2項(xiàng)操作后，每組取8只大鼠斷頸處死，剝離右膝關(guān)節(jié)軟骨，生理鹽水沖洗，用4%多聚甲醛固定24 h，置于20%脫鈣液(EDTA)中4 ℃脫鈣4 周，1次/3 d換液，石蠟包埋，切片(4 μm)；取部分切片脫蠟脫水后行HE染色，顯微鏡觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)形態(tài)。

1.3.4關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況 取1.3.3項(xiàng)下右膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片，室溫下加蛋白酶K處理30 min，放入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中用微波爐修復(fù)抗原，加TUNEL反應(yīng)混合液處理，用DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5PTEN、p-AKT、AKT、COX-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá) 1.3.2項(xiàng)操作后，每組剩余8只大鼠斷頸處死，剝離右膝關(guān)節(jié)軟骨，加RIPA裂解液冰上研磨裂解，12 000 r/min低溫離心15 min收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠，取20 μg蛋白與4 μL SDS-PAGE(2×)上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，上樣進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫5%脫脂牛奶封閉，一抗(PTEN、p-AKT、AKT、COX-2、Bax、cleaved caspase-3、GAPDH，均1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(HRP標(biāo)記，1∶1 500)室溫孵育30 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，曝光，拍照，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，進(jìn)行灰度比分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)腫脹情況

KOA造模術(shù)后2 周，KOA組、陽性藥物組及低、高劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑均大于假手術(shù)組(P<0.05)。給藥2 周、4 周后，陽性藥物組及低、高劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑均小于KOA組(P<0.05)；低劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑大于陽性藥物組(P<0.05)；高劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑小于陽性藥物組、低劑量甘草甜素組(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與假手術(shù)組相比，P<0.05；(2)與KOA組相比，P<0.05；(3)與陽性藥物組相比，P<0.05；(4)與低劑量甘草甜素組相比，P<0.05。

2.2 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平

KOA組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平較假手術(shù)組高(P<0.05)；陽性藥物組及低、高劑量甘草甜素組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于KOA組(P<0.05)；低劑量甘草甜素組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量較陽性藥物組高(P<0.05)；高劑量甘草甜素組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于陽性藥物組、低劑量甘草甜素組(P<0.05)。見圖2。

注：A、B、C分別為大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平；(1)與假手術(shù)組相比，P<0.05；(2)與KOA組相比，P<0.05；(3)與陽性藥物組相比，P<0.05；(4)與低劑量甘草甜素組相比，P<0.05。

2.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)形態(tài)

假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列規(guī)整；KOA組軟骨組織結(jié)構(gòu)層次模糊，細(xì)胞數(shù)量少、排列散亂，有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；高劑量甘草甜素組軟骨組織結(jié)構(gòu)清晰可見，細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少；而陽性藥物組、低劑量甘草甜素組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、排列及炎細(xì)胞浸潤(rùn)較高劑量甘草甜素組略差。見圖3。

注：藍(lán)色箭頭所指為軟骨細(xì)胞。

2.4 膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞凋亡

KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組升高(P<0.05)；陽性藥物組及低、高劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞凋亡率較KOA組均降低(P<0.05)；低劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞凋亡率較陽性藥物組升高(P<0.05)；高劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞凋亡率較陽性藥物組、低劑量甘草甜素組均降低(P<0.05)。見圖4。

注：黑色箭頭所指為凋亡陽性細(xì)胞。

2.5 軟骨組織中PTEN/AKT/COX-2通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PTEN蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，p-AKT/AKT、COX-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；陽性藥物組及低、高劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PTEN蛋白表達(dá)水平較KOA組均升高(P<0.05)，p-AKT/AKT、COX-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平較KOA組均降低(P<0.05)；低劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PTEN蛋白表達(dá)水平較陽性藥物組降低(P<0.05)，p-AKT/AKT、COX-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平較陽性藥物組升高(P<0.05)；高劑量甘草甜素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PTEN蛋白表達(dá)水平較陽性藥物組、低劑量甘草甜素組均升高(P<0.05)，p-AKT/AKT、COX-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平較陽性藥物組、低劑量甘草甜素組均降低(P<0.05)，見圖5。

注：A為各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的蛋白表達(dá)(Western blot)，B為各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的蛋白表達(dá)；(1)與假手術(shù)組同蛋白相比，P<0.05；(2)與KOA組同蛋白相比，P<0.05；(3)與陽性藥物組同蛋白相比，P<0.05；(4)與低劑量甘草甜素組同蛋白相比，P<0.05。

3 討論

KOA是一種臨床發(fā)病率較高的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病，在我國(guó)中老年人群體中的發(fā)病率約12%～15%，是目前臨床治療研究及預(yù)防保健的重點(diǎn)[12]。目前臨床治療KOA的原則為緩解疼痛，延緩病情，避免膝關(guān)節(jié)畸形改變，改善膝關(guān)節(jié)功能，從而提升生存質(zhì)量[13]。而已有治療方法如手術(shù)治療、藥物治療、運(yùn)動(dòng)康復(fù)及關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸、糖皮質(zhì)激素等，療效參差不齊，且可能出現(xiàn)并發(fā)癥或不良反應(yīng)，所以，尋求更好的治療方法顯得尤為重要[14]。本研究根據(jù)Hulth法建立KOA大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠膝關(guān)節(jié)直徑、血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量及軟骨組織細(xì)胞凋亡率、凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3水平顯著升高，軟骨組織中出現(xiàn)軟骨細(xì)胞數(shù)量大量減少、排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變，提示KOA造模成功。

我國(guó)傳統(tǒng)中藥及其有效單體成分在治療疾病時(shí)具有多靶點(diǎn)、用藥安全等優(yōu)點(diǎn)，在關(guān)節(jié)炎治療方面日益受到重視[15]。甘草甜素是中藥藥用植物甘草中的有效活性成分，具有多種藥理作用，在減輕炎癥反應(yīng)方面有較好療效。胡志平等[16]研究表明，甘草甜素可有效控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥，減輕足跖關(guān)節(jié)的炎性腫脹情況。Jiang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素在體外可抑制人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IL-1β刺激的PI3K/AKT通路激活，在體內(nèi)可防止小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨被破壞。Luo等[18]研究顯示，甘草甜素治療可降低骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清和軟骨中炎癥因子水平，改善機(jī)械痛覺過敏及雙側(cè)關(guān)節(jié)水腫。本研究結(jié)果顯示，低、高劑量的甘草甜素均降低了KOA大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平，減小了膝關(guān)節(jié)直徑，且高劑量甘草甜素的效果優(yōu)于治療關(guān)節(jié)炎癥疾病的常用藥雙氯芬酸鈉，表明甘草甜素在改善KOA大鼠體內(nèi)炎癥狀態(tài)及關(guān)節(jié)水腫情況方面可能更有效。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一的細(xì)胞成分，與軟骨形成、狀態(tài)維護(hù)、修復(fù)過程關(guān)系密切，其凋亡是骨關(guān)節(jié)退行性改變的主要特征。本研究發(fā)現(xiàn)，低、高劑量的甘草甜素均可顯著降低軟骨組織中細(xì)胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平，改善軟骨組織的病變狀態(tài)，表明甘草甜素可能減少了軟骨細(xì)胞凋亡，具有延緩骨關(guān)節(jié)退行性改變的潛力。

PTEN/AKT/COX-2通路是一條調(diào)控炎癥反應(yīng)的通路。Xie等[19]研究認(rèn)為，維持關(guān)節(jié)軟骨需要PTEN抑制AKT信號(hào)通路，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中持續(xù)的AKT信號(hào)通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠衰老引起骨關(guān)節(jié)炎。Guan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可通過其代謝產(chǎn)物前列腺素調(diào)控炎癥因子、基質(zhì)降解酶表達(dá)，逐漸侵蝕軟骨，參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PTEN蛋白水平下調(diào)，p-AKT/AKT、COX-2蛋白水平上調(diào)，表明PTEN/AKT/COX-2炎癥通路參與KOA發(fā)生。而低、高劑量的甘草甜素均可提高KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中PTEN蛋白水平，降低p-AKT/AKT、COX-2蛋白水平，表明甘草甜素可上調(diào)PTEN表達(dá)，抑制AKT/COX-2通路激活，從而改善KOA病情。

綜上所述，甘草甜素可能通過上調(diào)PTEN表達(dá)并抑制AKT磷酸化、COX-2蛋白表達(dá)從而調(diào)控PTEN/AKT/COX-2炎癥通路，降低血清炎癥水平，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，改善軟骨組織病變狀態(tài)及膝關(guān)節(jié)水腫情況，延緩KOA病情。