賈學敏，程鋮，劉麗婭，聶久偉，付恒建，湯磊,，楊元勇*

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004)

在過去的幾十年中，許多含氮雜環(huán)在藥物設計中發(fā)揮了重要作用。嘧啶環(huán)被認為是藥物化學中的一種特殊結(jié)構(gòu)，以嘧啶為核心的化合物具有多種類型的生物和藥物活性，嘧啶衍生物常被作為抗菌劑、抗病毒劑及抗腫瘤劑等[1-4]。Nagender等[5]研究開發(fā)了一系列新的吡唑[3,4-b]吡啶和嘧啶功能化1,2,3-三唑衍生物，抗菌結(jié)果表明該系列化合物在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)MTCC 96，S.aureusMLS-16 MTCC 2940的拮抗關系中都顯示出較好的抑菌活性，其中活性最優(yōu)化合物的最低抑菌濃度可低至15.6 mg/L；Suresh等[6]研究合成了一系列新型吡喃并[2,3-d]嘧啶類化合物，并對其進行了一系列的抗生物膜活性的篩選，結(jié)果顯示此系列化合物對S.aureusMTCC 96和S.aureusMLS-16 MTCC 2940有著較好的抑菌活性，最低抑菌濃度可分別低至15.6 mg/L和3.9 mg/L。同時，哌嗪因其廣泛的藥理活性而在藥物化學中受到關注[7]。許多哌嗪衍生物通常表現(xiàn)出一系列顯著的治療活性，包括抗分枝桿菌、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、抗鎮(zhèn)痛、抗驚厥活性等[8-9]；Chaudhary等[10]合成了一系列取代的哌嗪衍生物并測試了其抑菌活性，結(jié)果表明1-甲基-4-(3-苯基-2-丙基)哌嗪在30 mg/L的濃度下對S.aureusMTCCB 737的抑制區(qū)為18 mm；Chandra等[11]設計合成了一系列新型取代的 1-[雙(4-氟苯基)甲基]哌嗪衍生物，顯示1-[雙(4-氟苯基)甲基]-4-戊基哌嗪對S.aureusATCC 25953的最低抑菌濃度約30.00 mg/L。已有研究顯示嘧啶與哌嗪片段耦合的部分化合物對S.aureus顯示出一定的抗菌活性，但是活性相對較低[10-12]。因此，本研究根據(jù)活性拼合原理，合成一系列哌嗪取代嘧啶類化合物并對其進行抗菌活性的研究，以期篩選出活性更好的抗菌化合物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗菌株S.aureusATCC 433000和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，S.epidermidis)102555購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)Dh5a、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Ps.aeruginosa)ATCCC 9027及MRSA 20151026025為貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科饋贈。

1.1.2主要試劑 2-氨基-4,6-二氯嘧啶、哌嗪類底物和酰氯類底物(上海畢得醫(yī)藥)，米勒頓肉湯(mueller-hinton broth，MHB)培養(yǎng)基、96 孔板、無菌培養(yǎng)皿、無菌離心管、一次性槍頭及一次性比色皿(貴陽超遠志誠)，實驗柱層析所用200～300目的硅膠(煙臺新諾化工)，實驗所用化學反應試劑和層析溶劑均為分析純(上海沃化化工)。

1.1.3主要儀器 SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗)；ZF-Ⅰ型三用紫外分析儀(上海顧村)，81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂)，WRX-4顯微熔點儀(上海易測)，Xevo G2-XS型四極桿-飛行時間質(zhì)譜(美國Waters)；600M超導核磁共振波譜儀(德國Bruker)，BSC-1600IIB2蘇凈安泰生物安全柜(南京貝登)，震蕩培養(yǎng)箱和THZ-82N臺式恒溫震蕩培養(yǎng)器(上海躍進)，DW-86W海爾醫(yī)用超低溫保存箱(青島海爾)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)，SH-250生化培養(yǎng)箱(上海精宏)，721G-100紫外可見分光光度計(上海儀電)，ZYCGF-II-107超純水機(四川卓越)，LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安)，ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國伯騰)。

1.2 實驗方法

1.2.1目標化合物的合成 室溫氮氣下將1.5 mmol/L酰氯原料滴加入含有1 mmol/L 2-氨基-4,6-二氯嘧啶原料和2 mmol/L N, N-二異丙基乙胺的干燥甲苯溶液2 mL中，110 ℃下反應4 h，用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)監(jiān)測反應進度；待2-氨基-4,6-二氯嘧啶完全反應后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，經(jīng)乙酸乙酯和1 mol/L鹽酸溶液萃取，飽和碳酸氫鈉溶液萃取有機層，經(jīng)無水硫酸鈉，過柱層析，得到相應的目標化合物中間體3；在氮氣保護下，2 mL異丙醇中依次加入1 mmol/L化合物3、1.1 mmol/L取代哌嗪原料、1.5 mmol/L三乙胺，室溫溫反應1～2 h，用TLC監(jiān)測反應進度；完全反應后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，乙酸乙酯和1 mol/L鹽酸溶液萃取，飽和碳酸氫鈉溶液萃取有機層，經(jīng)無水硫酸鈉，過柱層析，得到相應的目標化合物4a～4j[13-14]。見圖1。

圖1 目標化合物的合成路線

1.2.2抑菌活性的測試 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(clinical and laboratory standards institute, CLSI)的方法，從-80 ℃冰箱取一環(huán)菌液于含MHB培養(yǎng)基5 mL 的無菌離心管中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h；取200 μL活化后菌液于含 MHB 5 mL培養(yǎng)基的無菌離心管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 h，菌液濃度調(diào)至1×109CFU/L(D600=0.1時，菌濃度為1×1010CFU/L)[15]；將待測化合物配成5120 mg/L后待用；標記編號96孔聚苯乙烯板，從第3列開始在每孔中加上述配好的化合物10 μL及MHB 100 μL，每個化合物設置1個復孔(即每塊96孔聚苯乙烯板測4個化合物)，以苯唑西林(Oxacillin)加于96孔板的第1～2行作為陽性對照組，第3～8行分別加3個目標化合物作為實驗組；分別于第1列和第3列加MHB 100 μL和90 μL；將第3列混勻后吸取100 μL混液加入第4列，按此方法等倍稀釋至第12列，第12列吸取混液100 μL后棄之；第2列到第12列分別加上述配好的菌液100 μL；第1列為空白對照組，第2列為陰性對照組，藥物的終濃度為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/L，菌液終濃度為5×108CFU/L，總體積為200 μL；96孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，比較觀察孔中培養(yǎng)基渾濁情況，觀察到澄清的1孔濃度即為對該菌的最低抑制濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)[16]；分別選取革蘭陽性菌S.aureusATCC 433000、S.epidermidis102555、MRSA 20151026025和革蘭陰性菌E.coliDh5a、Ps.aeruginosaATCC 9027測定目標化合物4a～4j的MIC。

2 結(jié)果

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1化合物4a系N-[4-氯-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]十四酰胺，白色固體，產(chǎn)率為99%，熔點為128～130 ℃；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ6.55(s，1H)，3.71(s，4 H)，2.55(t，J=7.4 Hz，2H)，2.52～2.47(m，4H)，2.34(s，3H)，1.71～1.61(m，2H)，1.40～1.27(m，20H)，0.91(t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ173.8，163.1，159.9，156.7，96.6，54.0，44.7，43.5，36.7，31.7，29.4，29.3，29.3，29.2，29.2，29.1，29.0，28.9，24.9，22.3，13.1；HRMS(ESI)C23H40ClN5O[M+H]+的理論值和實際值均為438.300 0。

2.1.2化合物4b系N-[4-氯-6-(4-苯基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]十四酰胺，白色固體，產(chǎn)率為30%，熔點為82～84 ℃；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ7.30(d,J=8.7 Hz，2H)，6.98～6.88(m，3H)，6.25(s，1H)，3.82(s，3H)，3.29～3.24(m，4H)，2.69(s, 2H)，2.36(t，J=7.5 Hz，1H)，1.70(d，J=7.6 Hz，2H)，1.29～1.25(m，20H)，0.88(t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ163.0，160.0，156.4，150.7，129.3，120.6，116.5，96.3，49.0，44.2，37.6，31.9，29.7，29.6，29.6，29.5，29.5，29.4，29.3，29.3，24.8，22.7，14.1；HRMS(ESI)C28H42ClN5O[M+H]+的理論值和實際值分別為500.315 6和500.315 7。

2.1.3化合物4c系N-4-(6-氯-2-十四烷氨基嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸乙酯，白色固體，產(chǎn)率為63%，熔點為87～89 ℃；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ6.21(s，1H)，4.18(q，J=7.1 Hz，2H)，3.62(m，7H)，2.66(d，J=6.8 Hz，2H)，2.35(t，J=7.5 Hz，1H)，1.69(m，2H)，1.30～1.25(m，23H)，0.88(d，J=6.9 Hz，3H)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ163.0，160.2，156.3，155.4，96.3，61.8，37.6，31.9，29.7，29.6，29.6，29.5，29.4，29.4，29.3，29.2，29.1，24.8，22.7，14.6，14.1；HRMS(ESI)C23H38ClN5O3[M+H]+的理論值和實際值分別為468.274 1和468.273 4。

2.1.4化合物4d系N-[4-氯-6-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]十四酰胺，白色固體，產(chǎn)率為95%，熔點為74～76 ℃；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ6.53(s，1H)，3.04(d，J=12.5 Hz，1H)，2.96(t，J=12.0 Hz，1H)，2.82～2.74(m，2H)，2.61(t，J=11.4 Hz，1H)，2.54(t，J=7.2 Hz，2H)，1.71～1.63(m，2H)，1.44～1.20(m，22H)，1.14(d，J=6.4 Hz，3H)，0.90(t，J=7.0 Hz，3H)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ173.9，163.1，160.0，156.6，96.6，51.8，43.3，36.7，31.7，29.4，29.3，29.3，29.2，29.2，29.1，29.1，28.9，24.9，22.3，13.0，10.3；HRMS(ESI)C23H40ClN5O[M+H]+的理論值和實際值分別為438.300 0和438.299 9。

2.1.5化合物4e系N-[4-氯-6-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]十四酰胺，白色固體，產(chǎn)率為99%，熔點為76～78 ℃；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ6.58(s，1H)，3.76(s，2H)，3.59(s，2H)，3.09～3.02(m，2H)，2.52(t，J=7.4 Hz，2H)，1.66(d，J=7.3 Hz，2H)，1.37～1.26(m，20H)，1.23(s，6H)，0.89(t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ173.9，163.3，160.1，156.6，96.4，53.0，51.7，48.1，42.6，39.3，36.7，31.6，29.4，29.3，29.3，29.2，29.1，29.1，29.0，28.9，24.9，22.7，22.3，13.0；HRMS(ESI)C24H42ClN5O[M+H]+的理論值和實際值均為452.315 6。

2.1.6化合物4f系N-[4-氯-6-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]辛酰胺，淺黃色固體，產(chǎn)率為99.0%，熔點為226～228 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ10.15(s，1H)，6.57(s，1H)，3.52(s，2H)，3.37(s，2H)，2.77～2.70(m，2H)，2.45(t，J=7.0 Hz，2H)，1.53(d，J=14.1，7.0 Hz，2H)，1.25(t，J=7.8 Hz，8H)，0.99(s，6H)，0.85(t，J=7.0 Hz，3H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ172.0，163.4，159.9，157.0，96.8，54.6，38.4，36.9，34.1，31.6，29.0，28.9，25.0，22.5，22.0，14.4；HRMS(ESI)C18H30ClN5O[M+H]+的理論值和實際值分別為368.221 7和368.220 2。

2.1.7化合物4g系N-[4-氯-6-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]己酰胺，白色固體，產(chǎn)率為93.3%，熔點為281～282 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ10.35(s，1H)，6.76(s，1H)，3.96(d，J=6.5 Hz，2H)，3.74(s，2H)，3.15(d，J=6.4 Hz，2H)，2.43(t，J=7.4 Hz，2H)，1.54(d，J=7.2 Hz，2H)，1.31(d,J=7.5 Hz, 6H)，1.26(m，4H)，0.86(t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ172.1，163.4，159.9，157.0，96.8，54.6，38.4，36.9，31.3，24.6，22.3，22.0，14.3；HRMS(ESI)C18H22ClN5O2[M+H]+的理論值和實際值分別為340.190 4和340.189 3。

2.1.8化合物4h系N-2-{[4-氯-6-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]氨基}-2-氧代乙酸乙酯，白色固體，產(chǎn)率為93.0%，熔點為253～255 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6/CD3OD)δ6.03(s，1H), 4.30～4.24(m，4H)，3.44(s，3H)，3.25(s，2H)，3.12(s，1H)，2.70～2.68(m，2H)，0.97(s，6H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ 163.7，162.7，159.6，90.7，61.7，49.9，40.1，39.8，39.7，24.9；HRMS(ESI)C14H20ClN5O3[M+H]+的理論值和實際值分別為342.133 3和342.131 7。

2.1.9化合物4i系N-N-[4-氯-6-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]-2-(噻吩-2-基)乙酰胺，淺棕色固體，產(chǎn)率為97.0%，熔點為216～219 ℃；1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ10.64(s，1H)，7.38(dd，J=4.8，1.5 Hz，1H)，7.03～6.87(m，2H)，6.76(s，1H)，4.01(s，2H)，3.89(s，2H)，3.67(s，2H)，3.08～3.04(m，2H)，1.90(s，1H)，1.25(s，6H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ169.2，163.9，160.3，157.4，137.5，127.6，126.1，97.6，54.5，39.2，38.4，23.0；HRMS(ESI)C16H20ClN5OS[M+H]+的理論值和實際值分別為366.115 5和366.112 1。

2.1.10化合物4j系N-[4-氯-6-(3,3-二甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基]-2,4,6-三甲基苯甲酰胺，白色固體，產(chǎn)率為97.2%，熔點為423～425 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ10.68(s，1H)，6.83(s，2H)，6.50(s，1H)，3.46～3.22(m，4H)，2.61(s, 2H)，2.22(s，3H)，2.09(s，6H)，1.86(s，1H), 0.84(s，6H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ182.0，170.5，168.1，166.5，162.8，159.5，156.5，136.8，128.1，96.1，40.2，40.1，24.7，20.9，19.1；HRMS(ESI)C20H26ClN5O[M+H]+的理論值和實際值分別為388.190 4和388.188 2。

2.2 抑菌活性

以Oxacillin作為陽性對照，分別選取革蘭陽性菌S.aureusATCC 433000、S.epidermidis102555、MRSA 20151026025和革蘭陰性菌E.coliDh5a、Ps.aeruginosaATCC 9027用于評估目標化合物4a～4j的抑菌活性。結(jié)果顯示，目標化合物4a～4j起始濃度256.00 mg/L時，化合物4a對S.aureusATCC 433000、S.epidermidis102555及MRSA 20151026025的MIC分別為16.00 mg/L、8.00 mg/L及128.00 mg/L；化合物4d和4e對S.aureusATCC 433000、S.epidermidis102555及MRSA 20151026025的MIC均為2.00 mg/L；其余化合物于256.00 mg/L濃度時對它們沒有明顯抑菌活性；其中化合物4d、4e對MRSA 20151026025的MIC明顯優(yōu)于陽性對照組，但目標化合物對革蘭陰性菌E.coliDh5a、Ps.aeruginosaATCCC 9027并在256.00 mg/L濃度下未顯示出抑菌活性。見表1。

表1 目標化合物4a～4j的抗菌活性

3 討論

S.aureus是分布最廣的細菌病原體之一，每年在全球范圍內(nèi)引起嚴重的皮膚感染及難以估計的侵襲性感染[17]。它是引起呼吸道、手術部位、假體關節(jié)與心血管感染，以及醫(yī)院菌血癥和其他感染疾病的主要病原體，通常不會危及生命，但發(fā)病率較高并可能伴有嚴重疼痛[18-20]。細菌感染對醫(yī)療保健和社區(qū)環(huán)境存在著嚴重的威脅，尤其是耐藥菌的廣泛傳播。由于S.aureus分離株中經(jīng)常出現(xiàn)抗生素耐藥性，S.aureus感染尤為棘手，其中MRSA與甲氧西林敏感的S.aureus相比，MRSA感染更可能造成公共衛(wèi)生負擔增加[21]。MRSA是引起高發(fā)病率醫(yī)院獲得性感染的主要原因，包括軟組織和骨骼感染、菌血癥及心內(nèi)膜炎，其發(fā)病率和死亡率都很高[20，22-23]。同時，MRSA對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類及林可酰胺等抗生素產(chǎn)生耐藥性的菌株的數(shù)量也一直在增加[24]。據(jù)中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年S.aureus占全國革蘭陽性菌病原菌的32.56%，對MRSA的檢出率和耐藥率均在35%以上[25]。因此，具有臨床應用前景的抗S.aureus活性先導化合物成為科研工作者們的研究熱點。眾所周知，嘧啶和哌嗪是許多大體積化合物的骨架，也是多種上市藥物的重要核心結(jié)構(gòu)[26-27]。Moesslacher等[28]研究表明，在單一結(jié)構(gòu)框架內(nèi)將吡啶環(huán)與哌嗪部分結(jié)合可增強生物活性。近年來研究結(jié)果顯示，抗MRSA活性的先導化合物常常通過引入鹵代基團或增加化合物的脂溶性提高其抗菌活性[29]。本研究在嘧啶環(huán)與哌嗪環(huán)活性拼接的基礎上，考慮嘧啶環(huán)有較強的親水性，故于2位引入親脂性的酰胺脂肪長鏈，同時于4位引入氯原子，得到化合物4a～4j共10個化合物；后續(xù)抑菌活性測試結(jié)果提示，當哌嗪環(huán)的氮上有給電子基的甲基存在時，化合物4a對S.aureusATCC 433000、S.epidermidis102555及MRSA 20151026025有一定的抑制效果；含有空間位阻和吸電子基的化合物4b和4c于256.00 mg/L濃度下，則無明顯抑制效果；意外的是，當哌嗪氮上為氫原子時，化合物4d和4e對S.aureusATCC 433000、S.epidermidis102555及MRSA 20151026025的抑菌作用明顯增強，可能是氫鍵作用的影響或者是仲胺較強的親核性使其可以與親電中心進行共價鍵結(jié)合而發(fā)揮作用；隨后對嘧啶環(huán)上酰胺側(cè)鏈進行構(gòu)效關系的研究顯示，當酰胺側(cè)鏈的烷基鏈縮短后抑菌活性也隨之降低，引入酯基后化合物4h于256.00 mg/L濃度時也沒有產(chǎn)生抑菌效果；引入芳族基團，試圖與抗菌靶點形成潛在的π-π共軛，然而化合物4i和4j于256.00 mg/L濃度時并沒有表現(xiàn)出抑菌活性；隨后選用革蘭氏陰性菌E.coliDh5a、Ps.aeruginosaATCCC 9027對目標化合物作進一步活性評估，結(jié)果表明它們并沒有對這2個菌株表現(xiàn)出抑菌活性。

綜上所述，本研究設計合成的哌嗪取代嘧啶類化合物4a、4d和4e對革蘭氏陽性菌S.aureusATCC 433000和S.epidermidis102555具有較好的抗菌潛力，尤其是4d與4e對MRSA 20151026025的抗菌活性明顯優(yōu)于陽性藥Oxacillin。因此，本研究可為抗葡萄球菌提供新的先導化合物，并為后續(xù)的抗生素開發(fā)提供理論參考，但是對于目標化合物抑菌的作用機制還需要進一步的探索。