梁 瀟 劉 嬌 胡 濤 阮婧華 錢海兵*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

國際疼痛研究學(xué)會(huì)將疼痛定義為“一種與實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)的感覺、情感、認(rèn)知和社會(huì)維度的痛苦體驗(yàn)”[1]，疼痛反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的生活。我國民族藥藥物資源豐富，且有多種鎮(zhèn)痛藥物及制劑應(yīng)用于臨床并取得顯著的效果，從傳統(tǒng)藥物中尋找副作用小且鎮(zhèn)痛效果顯著的藥物已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。苗藥弩藥液為外用制劑，具有活血化瘀-祛風(fēng)止痛的功效，臨床用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕等引起的關(guān)節(jié)疼痛，亦可用于癌性疼痛輔助治療，主要由大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜和黑骨藤組方而成，實(shí)驗(yàn)研究[2-6]表明，以上藥物對(duì)多種疼痛模型均具有顯著鎮(zhèn)痛作用。

本研究采用熱板實(shí)驗(yàn)、醋酸扭體實(shí)驗(yàn)和福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)，以行為學(xué)和血清疼痛因子水平為指標(biāo)，研究弩藥液的鎮(zhèn)痛作用以及可能的作用受體及機(jī)制，旨在闡明弩藥液對(duì)不同疼痛模型的作用，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠(雌性75，雄性25)，體質(zhì)量(20±2)g；SD大鼠(雌性15,雄性15)，體質(zhì)量(200±20)g。所有動(dòng)物購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 弩藥液由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，取原液為高劑量、稀釋一倍為中劑量、稀釋兩倍為低劑量；納絡(luò)酮(批號(hào)：MB5693，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，配制成 5 mg/kg的納絡(luò)酮生理鹽水溶液；福爾馬林(批號(hào)：20170204，重慶江川化工集團(tuán)有限公司)，配制成5%福爾馬林生理鹽水溶液；冰醋酸(批號(hào)：20190221，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，配制成0.8%冰醋酸生理鹽水溶液；大鼠IL-6(Interleukin 6，批號(hào)：KKSX3XLXAQ)、TNF-α(Tumor Necrosis Factor Alpha，批號(hào)：CFDS7MDM1E)、PGE2(Prostaglandin E2，批號(hào)：F21MQ8N8J6)ELISA試劑盒。

1.3 儀器 熱板測(cè)痛儀(由貴州中醫(yī)藥大學(xué)提供)、JJ224BF型電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，編號(hào)：W162419080116)、80-1醫(yī)用離心機(jī)(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)、Infinite M200酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司)。

1.4 小鼠熱板舔足實(shí)驗(yàn) 雌性ICR小鼠50只，置于 55 ℃ 熱板測(cè)痛儀上，以小鼠初次舔咬后足反應(yīng)潛伏期為痛閾指標(biāo)即痛閾值(s)，間隔 20 min 測(cè)定兩次，取平均值作為基礎(chǔ)痛閾值，隨機(jī)選擇40只基礎(chǔ)痛閾值在5～30 s 內(nèi)且無跳躍反應(yīng)小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。小鼠腹部以給藥面積 1.5 cm2備皮，模型組涂抹生理鹽水，高、中、低劑量組分別均勻涂抹相應(yīng)藥物，2次/d，連續(xù) 7 d，末次給藥后 30 min、60 min、90 min 各組小鼠分別測(cè)定痛閾值(s)，計(jì)算痛閾提高百分率=(給藥后痛閾值-基礎(chǔ)痛閾值)×100%/基礎(chǔ)痛閾值。

1.5 小鼠納絡(luò)酮拮抗-醋酸扭體實(shí)驗(yàn) ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、納絡(luò)酮+高劑量組，每組10只。除模型組外，其余各組按1.3項(xiàng)下方法給藥，末次給藥后 45 min，除納絡(luò)酮+高劑量組腹腔注射納絡(luò)酮溶液(5 mg/kg，0.1 mL/10 g)外，其余各組均腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/只)，15 min 后，模型組和納絡(luò)酮組涂抹生理鹽水，其余各組分別涂抹相應(yīng)藥物，40 min 后各組均腹腔注射0.8%冰醋酸生理鹽水溶液(0.1 mL/10 g)，立即觀察并記錄各組小鼠初次出現(xiàn)扭體反應(yīng)時(shí)間即扭體潛伏期(s)和 15 min 內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)，15 min 內(nèi)未出現(xiàn)扭體的，潛伏期記為 900 s，計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))×100%/模型組扭體次數(shù)。

1.6 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn) SD大鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組6只，按1.3項(xiàng)下方法給藥(空白組參照模型組給藥方式)，末次給藥 30 min 后，除空白組外，其余各組大鼠右側(cè)后足皮下注射5%福爾馬林 100 μL，以皮丘形成為注射成功，立即觀察并記錄各組大鼠第一時(shí)相(0～5 min)和第二時(shí)相(15～60 min)舔咬后足持續(xù)時(shí)間(s)，作為疼痛評(píng)價(jià)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)完成后，各組大鼠采用腹主動(dòng)脈取血，于離心機(jī)分離血清，按照ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定IL-6、TNF-α和PGE2濃度。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小鼠熱板舔足實(shí)驗(yàn) 各組小鼠基礎(chǔ)痛閾值相比較無顯著性差異(P>0.05)，給藥后 30 min 和 60 min 高劑量組與模型組痛閾值相比有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組給藥后 60 min 和 90 min 的痛閾值與給藥后 30 min 相比均有顯著性差異(P<0.05)，各組給藥后 60 min 和 90 min 的痛閾值相比無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 小鼠熱板實(shí)驗(yàn)各組間痛閾值變化

2.1.2 小鼠納絡(luò)酮拮抗-醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 模型組、低劑量組及納絡(luò)酮+高劑量組與高劑量組潛伏期及扭體次數(shù)相比均有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠納絡(luò)酮拮抗醋酸扭體實(shí)驗(yàn)

2.1.3 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn) 各組大鼠舔咬后足持續(xù)時(shí)間第一時(shí)相相比無顯著性差異(P>0.05)，高、中劑量組與模型組舔咬后足持續(xù)時(shí)間第二時(shí)相相比有顯著性差異(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)

2.2 血清指標(biāo) 空白組、高劑量組和中劑量組大鼠血清IL-6濃度均與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)；空白組血清TNF-α濃度與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)；空白組、高劑量組和中劑量組血清PGE2濃度與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表4 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)血清IL-6、TNF-α、PGE2水平

3 討論

疼痛是炎癥和癌癥等病理狀態(tài)下機(jī)體的主要反應(yīng)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用物理刺激和化學(xué)刺激兩種致痛模型，以行為學(xué)和血清致痛因子濃度為指標(biāo)研究弩藥液的鎮(zhèn)痛作用。

熱板法是篩選鎮(zhèn)痛藥物的一個(gè)經(jīng)典的熱刺激致痛法[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著降低小鼠熱板致痛模型末次給藥后 30 min 和 60 min 的痛閾值，高劑量組在末次給藥后 30 min 的痛閾值與末次給藥后 60 min 和 90 min 均有顯著性差異，說明弩藥液對(duì)小鼠熱板致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且在末次給藥后 30 min 的鎮(zhèn)痛作用最為顯著。

醋酸扭體法是篩選鎮(zhèn)痛藥物的一個(gè)常用化學(xué)刺激致痛法[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著減少小鼠醋酸扭體致痛模型扭體潛伏期和 15 min 內(nèi)的扭體次數(shù)，說明弩藥液對(duì)小鼠醋酸扭體致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加入納絡(luò)酮拮抗組，結(jié)果顯示納絡(luò)酮能顯著拮抗弩藥液的鎮(zhèn)痛作用，納絡(luò)酮是阿片類受體拮抗劑，說明弩藥液的鎮(zhèn)痛作用可能作用于阿片類受體。

福爾馬林致痛法是經(jīng)典的炎癥致痛模型，第二時(shí)相為體內(nèi)炎癥因子大量產(chǎn)生而導(dǎo)致疼痛的時(shí)期[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著減輕大鼠福爾馬林致痛模型第二時(shí)相舔咬后足反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，說明弩藥液對(duì)大鼠福爾馬林致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且可能與下調(diào)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

炎性疼痛是疼痛的主要類型[11]，IL-6、TNF-α和PGE2是與疼痛相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，福爾馬林致炎后大鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子濃度升高，促進(jìn)疼痛產(chǎn)生[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2濃度均顯著升高，說明造模成功，弩藥液高劑量組和中劑量組血清中IL-6和PGE2濃度與模型組相比均顯著性降低，TNF-α濃度與模型組相比呈降低趨勢(shì)但差異不顯著，即弩藥液可顯著降低血清中IL-6和PGE2濃度，降低TNF-α濃度，說明弩藥液的對(duì)大鼠福爾馬林致痛模型的鎮(zhèn)痛作用可能與顯著下調(diào)IL-6、PGE2濃度有關(guān)，而與TNF-α濃度相關(guān)性不大。

綜上所述，弩藥液可能是阿片類鎮(zhèn)痛藥，對(duì)多種疼痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且對(duì)炎性疼痛模型的作用可能與下調(diào)炎性因子表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。