徐 昊 許閆嚴(yán) 馬中希 劉賢莉 尹秀萍

武漢市第四醫(yī)院/華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院骨科 湖北 武漢 430033

骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)為骨量減少、骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，導(dǎo)致骨骼脆弱而易發(fā)生骨折，嚴(yán)重威脅中老年人的身體健康。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，MSC）作為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞共同的前體細(xì)胞，其平衡分化過程直接決定骨骼質(zhì)量［1］。體外培養(yǎng)的MSC在成骨誘導(dǎo)劑（地塞米松、β-甘油磷酸鈉聯(lián)合維生素C）作用下，經(jīng)14～21 d可分化為具有一定功能的成骨細(xì)胞，利用這一體外誘導(dǎo)模型，可以較為方便地研究成骨分化的 部 分機(jī) 制［2］。微 小RNA（microRNA，miRNA，miR）是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的重要生物調(diào)節(jié)因子，對(duì)機(jī)體生理/病理活動(dòng)包括成骨分化過程產(chǎn)生復(fù)雜的調(diào)控作用［3］。前期工作中，我們通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)hsa-miRNA-216a-5p（miR-216a）在MSC向成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下降。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-216a在成骨分化過程中的表達(dá)，觀察其對(duì)成骨分化的影響，并證實(shí)其對(duì)侯選靶基因利尿鈉肽受體3（NPR3）的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑人源性原代培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）受贈(zèng)于江西省系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)環(huán)境：37℃，5%CO2，每隔48 h傳代1次。選擇第6代hMSC進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑成分為：DMEM培養(yǎng)液中含10%胎牛血清、100 mmol/L地塞米松、10 mmol/L甘油磷酸鈉和50 ng/mL維生素C。

1.2 慢病毒感染介導(dǎo)外源性miR-216a-5p表達(dá)的慢病毒顆粒及其陰性對(duì)照由上海吉?jiǎng)P基因公司提供。感染前12～18 h，hMSC接種于6孔板，細(xì)胞密度為50%左右加入慢病毒顆粒感染12 h后換液正常培養(yǎng)；72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.3 Real-time PCRRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司。收集各組細(xì)胞，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。反應(yīng)條件：94℃4 min→94℃30 s→56℃30 s→72℃30 s，循環(huán)40次。用2-△△Ct法計(jì)算靶基因相對(duì)表達(dá)量并根據(jù)分析結(jié)果繪制柱狀圖。

表1 Real-time PCR擴(kuò)增引物序列

1.4 茜素紅染色鑒定細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛固定，加入2%茜素紅染液染色30 min，倒置顯微鏡下觀察。

1.5 Wester n Blot檢測(cè)收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，使用RIPA強(qiáng)裂解液提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度，每個(gè)樣品取10μg細(xì)胞內(nèi)總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉，1∶1 000稀釋一抗（NPR3、GAPDH），1∶5 000稀釋二抗，TBST洗膜，ECL發(fā)光體系凝膠成像系統(tǒng)采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目的條帶的灰度值除以GAPDH（內(nèi)參）條帶灰度值，即為條帶經(jīng)過校正后的灰度值。

1.6 雙熒光素酶檢測(cè)包含NPR3-3'UTR的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和相應(yīng)的突變型質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因公司提供。HEK293細(xì)胞按50 000個(gè)/孔接種于24孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染。將野生型NPR3-3'UTR（WT）或突變型NPR3-3'UTR（Mut）與miR-216a或陰性對(duì)照（NC）聯(lián)合轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，6 h后換液正常培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Promega）檢測(cè)熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-216a在成骨分化過程中表達(dá)下降使用成骨誘導(dǎo)劑刺激hMSC成骨分化21 d，茜素紅染色顯示細(xì)胞外基質(zhì)礦化（圖1A）；同時(shí)，各種成骨相關(guān)基因如ALP、RUNX2和Osterix在第7天和第14天出現(xiàn)升高，表明成骨誘導(dǎo)成功（圖1B～1D）。在此基礎(chǔ)上，Real-time PCR顯示miR-216a的表達(dá)在成骨分化的第7和14天顯著下降（圖1E）。

圖1 miR-216a在h MSC成骨分化過程中表達(dá)下調(diào)

2.2 高表達(dá)miR-216a弱化hMSC的成骨分化能力通過慢病毒介導(dǎo)外源性在hMSC中高表達(dá)，并以成骨誘導(dǎo)劑進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-216a削弱成骨分化能力，表現(xiàn)在：①在分化第21天，高表達(dá)miR-216a的細(xì)胞礦化程度降低（圖2A）；②在分化的第7、14天，高表達(dá)miR-216a的細(xì)胞中ALP、RUNX2和Osterix表達(dá)受到抑制（圖2B～2D）。

圖2 高表達(dá)miR-216a抑制h MSC的成骨分化能力

2.3 miR-216a調(diào)控NPR3表達(dá)作為miR-216a潛在靶基因，NPR3的轉(zhuǎn)錄水平在成骨分化第7、14天升高（圖3A），趨勢(shì)與miR-216a相反。將miR-216a上調(diào)的hMSC進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，在分化的第7、14天，NPR3的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比受到抑制；同時(shí)NPR3在蛋白水平也有30%左右的下降（圖3B～3D）。

圖3 高表達(dá)miR-216a抑制NPR3表達(dá)

2.4 miR-216a作用于NPR3基因的3'UTRTargetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，miR-216a與NPR3的3'UTR存在1處序列互補(bǔ)，位于3'UTR的第31～37位核苷酸；而與ALP、RUNX2和Osterix基因的3'UTR無互補(bǔ)性。為了評(píng)估m(xù)iR-216a是否直接靶向NPR3，我們將包含NPR3-3'UTR的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒（WT）及其突變體質(zhì)粒（Mut）與miR-216a表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。熒光素酶活性測(cè)定的結(jié)果顯示，miR-216a可顯著抑制WT報(bào)告基因活性，但不抑制Mut報(bào)告基因的表達(dá)（圖4）。

圖4 miR-216a直接作用于NPR3的m RNA

3 討論

miRNA是調(diào)控成骨分化的重要因素之一，例如在成骨分化中RUNX2是miR-135的靶向調(diào)控基因［4］，miR-214則通過靶向Osterix抑制成骨分化［5］，而miR-216a尚未被報(bào)道參與成骨分化過程。該基因定位于人類染色體2p16.1，在其轉(zhuǎn)錄區(qū)上游有包括CAAT盒和CSX的結(jié)合位點(diǎn)的高度保守的序列［6］。Sun等［6］通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)miR-216a在人類腎臟中高度表達(dá)，在心臟、脾臟、肺、肌肉和前列腺中幾乎沒有表達(dá)，但是我們的研究結(jié)果顯示miR-216a在人間充質(zhì)干細(xì)胞中有表達(dá)。值得注意的是，在成骨分化的第7天和14天，miR-216a表達(dá)下降約50%，這種表達(dá)趨勢(shì)與上述調(diào)控成骨分化的miRNA具有相似性，提示miR-216a可能參與了成骨分化過程。進(jìn)一步研究顯示miR-216的高表達(dá)抑制了hMSC的成骨分化過程，表現(xiàn)為成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子ALP、RUNX2和Osterix的下降，并得到茜素紅染色結(jié)果的支持，這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了我們對(duì)miR-216a功能的認(rèn)識(shí)。

miRNA發(fā)揮作用通常是與靶基因的mRNA的3'UTR結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的翻譯抑制或者mRNA降解［7］。將TargetScan預(yù)測(cè)miR-216a的靶基因與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行合并分析，我們注意到NPR3基因。結(jié)果顯示，NPR3在成骨分化過程中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，與miR-216a的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，有可能受到miR-216a的調(diào)控。

NPR3基因定位于人類染色體5p13.3，編碼產(chǎn)物為三種利鈉肽受體之一［8］。利鈉肽功能廣泛，其與相應(yīng)的受體組成的信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)血容量和血壓、肺動(dòng)脈高壓、心臟功能等生理活動(dòng)［9］。而利鈉肽過度產(chǎn)生導(dǎo)致骨骼過度生長(zhǎng)和兒童骨骼異常，尤其影響身高、椎骨和手指長(zhǎng)度［10］，表明其對(duì)于軟骨內(nèi)骨化和骨生長(zhǎng)具有重要調(diào)節(jié)作用。利尿鈉肽受體是具有細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶活性的單跨膜催化受體，有3種亞型，其中NPR3基因的編碼產(chǎn)物被稱為C型利尿鈉肽受體，負(fù)責(zé)通過受體的內(nèi)吞作用清除循環(huán)和細(xì)胞外利鈉肽，調(diào)節(jié)利尿、血壓和骨骼發(fā)育［11］。NPR3突變的小鼠利鈉肽活性增高，表現(xiàn)出骨骼過度生長(zhǎng)表型，導(dǎo)致細(xì)長(zhǎng)的身體和駝背，與利鈉肽過度表達(dá)產(chǎn)生的表型類似［12］。在hMSC向成骨分化過程中，NPR3與RUNX2、DLX5等成骨基因一同表達(dá)上調(diào)［13］，但對(duì)成骨分化的作用還不清楚，我們推測(cè)可能與基因表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)控有關(guān)。

miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，目前有26個(gè)miRNA被報(bào)道參與調(diào)控NPR3的表達(dá)，其中包括人源性4個(gè)miRNA，如hsa-miR-16-5p（MIRT 001435）、hsa-miR-30a-5p（MIRT 005159）、hsa-miR-335-5p（MIRT 017512）、hsa-miR-98-5p（MIRT 027551），其余為鼠源性。有趣的是，以上4個(gè)miRNA都被報(bào)道參與骨骼的病理活動(dòng)［14-17］。我們的結(jié)果增加了NPR3基因的miRNA調(diào)控譜，也提示NPR3在成骨分化過程中的潛在作用。

綜上所述，hsa-miRNA-216a-5p負(fù)性調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程，NPR3是其中的潛在靶基因。后續(xù)研究將通過基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以及沉默NPR3表達(dá)來進(jìn)一步驗(yàn)證其中的分子機(jī)制。