歐陽賢華，陳福艷，陳麗霞*，黎建斌*，李大列，梅寧

（1.廣西安桂水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，廣西 南寧 530228；2.廣西芳草安桂生物科技有限公司，廣西 南寧 530001；3.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院，廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖遺傳重點實驗室，廣西 南寧 530021）

近20年來，隨著羅非魚（）養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖技術不斷完善，已頗具規(guī)模。但隨著養(yǎng)殖面積不斷擴大，密度不斷增加，水環(huán)境持續(xù)惡化，病害頻繁暴發(fā)，特別是鏈球菌病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的損失。養(yǎng)殖戶在病害防治過程中，由于防治技術水平參差不齊、病急亂投醫(yī)和節(jié)省成本等原因，發(fā)病季節(jié)大量頻繁地濫用藥物，造成食品安全、環(huán)境污染、產(chǎn)生耐藥性和抗藥性等隱患。因此，一方面如何在養(yǎng)殖過程中有效改善水質(zhì)，快速修復水體環(huán)境，減輕環(huán)境污染的壓力；另一方面，如何增強魚體免疫力，減少病害發(fā)生和藥物使用，成為當今羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關鍵問題。

有效微生物群（Effective Microorganisms, EM）為復合微生物菌群，被廣泛應用于環(huán)境保護、農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖等領域，取得了顯著的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。EM菌在水產(chǎn)行業(yè)上的應用，通過外潑達到較好的凈化水質(zhì)、提高水體自凈能力的目的；內(nèi)服可增強機體免疫力，促進生長和提高成活率。胡京、夏來根等、張衛(wèi)芳、田功太等、馬江耀等在海滲、青蝦和淇河鯽等養(yǎng)殖池塘使用EM 菌，達到較好的調(diào)節(jié)水質(zhì)、促進生長和提高免疫力的目的。但通過定期投喂EM 菌，對羅非魚養(yǎng)殖池塘水質(zhì)和羅非魚生長性能、抗氧化及非特異性免疫方面的研究尚未見報道。現(xiàn)于2018年4月在廣西某羅非魚養(yǎng)殖基地，采用定期投喂EM 菌的養(yǎng)殖模式，分析其對池塘以及羅非魚的生長性能、血清抗氧化和非特異免疫指標的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗位于廣西某羅非魚養(yǎng)殖基地，該基地向陽通風、規(guī)劃整齊、交通便利、排灌方便。試驗池塘為4 口（1、2、3和4塘），面積分別為2.53，2.73，3.00，2.87 hm。每口池塘均配備3 kW 葉輪式增氧機3 臺，150 W 自動投料機1 臺。

將4 口魚塘分為2 組，對照組（1塘）與試驗組（2、3和4塘），分別投喂不同飼料。對照組（1塘）只投喂基礎飼料；試驗組（2、3和4塘）投喂基礎飼料加EM 菌液，每隔3 d 拌料投喂1 次，EM 菌液添加量為飼料量的4%，定期投喂直至收獲。

1.2 EM 菌發(fā)酵

EM 菌種由廣西助農(nóng)畜牧科技有限公司提供；培養(yǎng)基（碳源）由南寧歐海生物科技有限公司提供。EM 菌發(fā)酵方法根據(jù)說明書，材料質(zhì)量比為：m（EM菌）∶m（碳源）∶m（自來水）=1∶3∶18。將其充分攪拌均勻，密封于塑料桶（100 kg）內(nèi)發(fā)酵2～3 d，避免陽光暴曬，1 次未用完的發(fā)酵液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 清塘與放苗

開春后，當水溫高于20 ℃時，開始清塘、蓄水和消毒。4月3日投放苗種，水溫21～23 ℃；羅非魚養(yǎng)殖面積、苗種規(guī)格和放養(yǎng)密度見表1。

表1 各池塘羅非魚種苗投放情況

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗魚的投喂按照“定時、定量、定點和定質(zhì)”的“四定”原則，同時視天氣、水溫和魚的攝食情況適當調(diào)整。每天投喂2 次，08：00 和16：00，投喂量早期按體質(zhì)量的4%～5%，中后期按體質(zhì)量的2%～3%，以40～60 min 吃完為宜。視水質(zhì)情況，每月加注新水10～20 cm；每天開啟增氧機，中午1～2 h，夜間2～5 h。每天早晚巡塘，發(fā)現(xiàn)問題及時處理，做好養(yǎng)殖日志。

1.5 水質(zhì)與病害監(jiān)測

每月定期采用奧克丹便攜式測水儀（I 代）測定溶解氧（DO）、銨態(tài)氮（NH-N）、亞硝酸鹽氮（NO-N）和pH 值。病害監(jiān)測方法為常見魚病檢查及細菌分離方法。

1.6 生長性能、血清抗氧化和非特異性免疫指標測定

養(yǎng)殖后期，大部分羅非魚達到500 g/尾的上市規(guī)格，對其進行隨機抽樣，測量生長性能（體長和體質(zhì)量），數(shù)量為30 尾/口，測量方法按照常規(guī)方法進行。另外，隨機抽取羅非魚10 尾/口，抽取血清檢測抗氧化指標和溶菌酶的活力。尾靜脈抽血，操作緩慢，將血液置于1.5 mL EP 管，于4 ℃冰箱靜置4 h 后，離心（4000 r/min，10 min），取上清液分裝于1.5 mL EP 管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清中的總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、溶菌酶（LZM）的活力和丙二醛（MDA）含量的測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

檢測數(shù)據(jù)通過Excel 2016 軟件進行初步處理并分析；采用SPSS22 軟件進行單因素分析（Oneway ANOVA），Duncan 氏多重比較，結(jié)果采用“平均數(shù)±標準差”表示，P<0.05 為差異具統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 池塘水質(zhì)

連續(xù)4 個月對池塘水質(zhì)檢測，結(jié)果見圖1（a）（b）（c）（d）。由圖1 可見，ρ（DO）不斷升高，但到9月有所下降，試驗組（2、3和4塘）ρ（DO）比對照組（1塘）高，但是各組之間差異不顯著；養(yǎng)殖早期ρ（NH-N）和ρ（NO-N）較低，但到高溫投料旺季，各組的ρ（NH-N）和ρ（NO-N）都有所升高，且試驗組（2、3和4塘）ρ（NH-N）和ρ（NO-N）比對照組（1塘）低，但各組間差異不顯著（P<0.05）；pH 值在養(yǎng)殖過程中略有上升，試驗組（2、3和4塘）上升的幅度比對照組（1塘）小，但各組間pH 值差異不顯著?？梢娡段笶M 菌液，有助于提高池塘的ρ（DO），降低ρ（NH-N）和ρ（NO-N），穩(wěn)定pH 值。

圖1 養(yǎng)殖過程中池塘水質(zhì)變化情況

2.2 試驗魚生長性能

各池塘魚抽樣測量生長性能，結(jié)果見表2。各池塘羅非魚平均體長和平均體質(zhì)量差異顯著，試驗組（2和3塘）的平均體長和平均體質(zhì)量均大于對照組（1塘）；試驗組（2和3塘）全部達到上市規(guī)格（500 g 以上），而1和4塘羅非魚規(guī)格次之；從抽樣結(jié)果推算各池塘產(chǎn)量，試驗組（2塘）和對照組（1塘）最高，試驗組（3塘）次之，而試驗組（4塘）最低。

表2 羅非魚抽樣檢測生長性能結(jié)果①

2.3 試驗魚血清抗氧化及非特異性免疫

各池塘羅非魚血清抗氧化及非特異性免疫檢測結(jié)果見表3。試驗組（2、3和4塘）血清中TAOC顯著高于對照組（1塘），且各組之間差異顯著；試驗組（2和3塘）的血清CAT 活力顯著高于對照組（1塘），而試驗組（4塘）CAT 活力顯著低于對照組（1塘）；試驗組（2和4塘）的血清SOD 活力顯著高于對照組（1塘），而試驗組（3塘）SOD 活力顯著低于對照組（1塘）。試驗組（3和4塘）的血清LZM 活力顯著高于對照組（1塘），而試驗組（2塘）LZM 活力顯著低于對照組（1塘）。試驗組（2、3和4塘）血清MDA 含量顯著低于對照組（1塘）。可見試驗組（2、3和4塘）羅非魚抗氧化能力和LZM活力相對優(yōu)于對照組（1塘），而試驗組（2、3和4塘）MDA 濃度顯著低于對照組（1塘）。

表3 各池塘試驗魚血清抗氧化指標檢測結(jié)果①

2.4 養(yǎng)殖過程中試驗魚病害及防治情況

羅非魚養(yǎng)殖過程中，池塘曾用生石灰、二氧化氯、聚維酮碘和濃戊二醛進行消毒，定期用EM 菌液拌飼料預防病害，但在整個養(yǎng)殖過程中，各池塘均發(fā)生病害并造成死亡，可見以上措施并不能完全杜絕病害的發(fā)生，各池塘發(fā)病情況見表4。各池塘病害發(fā)生時間和程度不盡相同，各池塘羅非魚死亡數(shù)量分別為對照組（1塘）死亡3300 多尾，試驗組（2塘）死亡2200 尾，試驗組（3塘）死亡1800 尾，試驗組（4塘）死亡3600 尾；病死率分別是7.0%，4.6%，4.6%和8.5%。各池塘死亡情況不一致，對照組（1塘）、試驗組（2和3塘）羅非魚養(yǎng)殖早中期發(fā)生細菌性敗血病并造成持續(xù)性死亡，后期少部分魚因捕魚造成應激死亡；試驗組（4塘）在養(yǎng)殖早中期較為順利，生長速度快，但在養(yǎng)殖后期，因增氧機出現(xiàn)故障，造成大規(guī)格羅非魚缺氧死亡，損失較大。

表4 羅非魚養(yǎng)殖過程中病害及死亡情況

3 討論

3.1 投喂EM 菌對池塘水質(zhì)的影響

EM 菌是復合微生物，包含有乳酸菌、芽孢桿菌、光合細菌和酵母菌等。將EM 菌應用于水體，發(fā)揮各種菌不同生長特性，在水體環(huán)境中進行生長繁殖，通過氧化、硝化、反硝化、氨化、硫化、解磷和固氮等作用，將水體中易引起水質(zhì)惡化的剩餌、排泄物等有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化或分解為無害的硝酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽等物質(zhì)，直接排放或被水中植物或藻類吸收利用，實現(xiàn)水生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)，起到修復和優(yōu)化環(huán)境的作用。在本試驗中，將EM 菌與飼料攪拌混合后投喂，其中一部分EM 菌被魚吞食進入消化道；另一部分EM 菌散落水體，逐漸在水體中生長繁殖，形成優(yōu)勢菌群，從而起到調(diào)節(jié)水質(zhì)的作用。本試驗中，各池塘pH 值略有升高，可能與藻類生長旺盛、利用水體CO間接提升pH 值有關。而對照組（1塘）pH 值上升幅度較大，但各組間差異不顯著，這一結(jié)果與馬江耀等研究結(jié)果相似，EM 菌能顯著提高pH 值；與張衛(wèi)芳的研究結(jié)果也相似，使用EM 菌有逐漸增大pH 值的作用。本試驗中，試驗組（2、3、4塘）ρ（DO）在6—8月逐漸升高，9月份開始下降，可能與9月份氣溫開始下降、藻類不穩(wěn)定有關，與劉其芝等認為EM 菌提高甲魚養(yǎng)殖水體的ρ（DO）結(jié)果相同，而與馬江濯等使用EM 菌對ρ（DO）無顯著影響的研究結(jié)果有差異，具體原因有待研究。EM菌有助于降低水體中的ρ（NH-N），本試驗中，圖1顯示，對照組（1塘）ρ（NH-N）達到2.2 mg/L 以上，而試驗組在1.5 mg/L 左右，較對照組要低很多；ρ（NO-N）的控制效果與ρ（NH-N）類似，試驗組（2、3、4塘）明顯低于對照組（1塘），這一結(jié)果與高征等、李先明等和黃培鈴等的研究結(jié)果一致。本試驗中EM 菌投喂量為飼料的4%，對銨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮有明顯的調(diào)節(jié)作用，但對DO 和pH 值的改善不顯著，是否與用量有關，有待進一步研究。

3.2 投喂EM 菌促進羅非魚生長

本試驗中抽樣結(jié)果表明，試驗組（2和3塘）羅非魚的平均體質(zhì)量比對照組（1塘）高，試驗組（2塘）放養(yǎng)密度、放養(yǎng)規(guī)格與對照組（1塘）很接近，但試驗組（2塘）平均體質(zhì)量比對照組（1塘）高；試驗組（3塘）的密度比對照組（1塘）稍低，但試驗組（3塘）平均體質(zhì)量比對照組（1塘）高；試驗組（4塘）魚苗放養(yǎng)規(guī)格比對照組（1塘）小，試驗組（4塘）平均體質(zhì)量比對照組（1塘）小，可能受缺氧死亡一批大規(guī)格魚的影響，具體原因有待研究。研究表明，EM 菌發(fā)酵飼料有諸多優(yōu)點：EM 菌營養(yǎng)豐富，富含有蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)等，能促進生物生長發(fā)育；各種有益菌在代謝過程中能產(chǎn)生生長促進因子和酶類，能提高生物機體免疫力；EM 菌在腸道中發(fā)揮占位優(yōu)勢，被吞食的EM 菌在生物腸道中生長繁殖，形成優(yōu)勢菌群，在一定程度上抑制有害菌生長，減少病害發(fā)生；EM 菌發(fā)酵飼料，對生物起到脫毒和提高品質(zhì)的作用，促進其消化吸收和生長。伍莉等在飼料中添加EM菌，改善了大口鲇和鯽血液指標，加快了試驗魚的生長。胡京研究認為，潑灑EM 菌改善海參腸道環(huán)境，提高飼料轉(zhuǎn)化率，預防疾病，提高其生長性能。李紹戊等通過投喂及外潑枯草芽孢桿菌促進鯉和草魚的生長，提高了飼料利用率。馮俊榮等通過投喂和外潑EM 菌的方式，提高了牙鲆的生長速度。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，投喂EM 菌可促進魚的生長。

3.3 長期投喂EM 菌對羅非魚抗氧化和非特異性免疫的影響

抗氧化能力是機體應對環(huán)境脅迫的重要指標，其活性和含量隨環(huán)境脅迫的發(fā)生而改變，可用于衡量環(huán)境污染程度和機體免疫能力。CAT 和SOD 是抗氧化酶系統(tǒng)中重要的酶類，對生物體內(nèi)活性氧自由基的清除起重要作用；MDA 是脂質(zhì)過氧化物反應中的最終產(chǎn)物，累積到一定量可導致機體細胞的損傷；LZM 是機體非常重要的非特異性免疫指標，其水平和活性直接關系到魚類的免疫能力和健康，它通過酶解破壞病原體的細胞壁，使水分進入細胞，造成細胞的崩解，從而殺滅入侵的細菌和真菌，對機體起到積極的防衛(wèi)作用。該研究中，試驗組（2、3和4塘）的T-AOC、CAT、SOD、LZM 相對高于對照組（1塘），但有個別指標比對照組（1塘）低，具體原因有待研究；試驗組（2、3和4塘）MDA 顯著低于對照組（1塘）。可見試驗組（2、3和4塘）的血清抗氧化能力相對優(yōu)于對照組（1塘），可能與定期投喂EM 菌有關系，發(fā)揮了以上抗氧化酶對魚機體的作用，具體作用機制有待進一步深入研究。