王晨宇，黃鴻兵，李佳佳，尹思慧，代培，俞雅文，徐宇，許志強(qiáng)，唐建清

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

克氏原螯蝦（），又名淡水克氏原螯蝦，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼綱，十足目，爬行亞目，螯蝦科，原螯蝦屬。原產(chǎn)于北美洲，于1930年前后被引入中國(guó)，經(jīng)過(guò)近70年的發(fā)展，已成為我國(guó)重要的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。2021年中國(guó)小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告顯示，全國(guó)小龍蝦養(yǎng)殖面積達(dá)到145.64 萬(wàn)hm，養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到239.37 萬(wàn)t。

1981年，Meyers 等首次從克氏原螯蝦蝦殼中提取并獲得蝦青素。蝦青素（Astaxanthin）是一種類胡蘿卜素，屬于酮式類胡蘿卜素,化學(xué)名為3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，在自然界中廣泛存在，呈紅色固體粉末狀，脂溶性，不溶于水，對(duì)高溫和光照比較敏感，且具有很強(qiáng)的抗氧化性，其抗氧化性是維生素E 的5 倍以上。

Wade 等研究發(fā)現(xiàn)，成年澳洲龍蝦蝦殼中蝦青素的含量、結(jié)構(gòu)等因素與蝦殼殼色有一定的關(guān)系；蝦青素與蛋白質(zhì)多分子復(fù)合物殼青素的結(jié)合是龍蝦殼呈現(xiàn)藍(lán)色的原因。目前，有關(guān)蝦青素的提取方法比較多，常見(jiàn)的有油溶法、堿提法、有機(jī)溶劑提取法等，其中有機(jī)溶液提取法是目前市場(chǎng)上比較行之有效的提取方法之一。蝦青素的測(cè)定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、高效薄層析色譜法、LC-MS 分析法。目前大多數(shù)檢測(cè)儀器以高效液相色譜法為主，可準(zhǔn)確區(qū)分蝦青素和其他類胡蘿卜素，也有研究者采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法。

現(xiàn)以克氏原螯蝦為研究對(duì)象，利用高效液相色譜檢測(cè)克氏原螯蝦不同部位蝦殼中蝦青素含量，分析其中蝦青素中游離型和酯型蝦青素的相對(duì)含量，探究蝦青素含量與殼色的關(guān)系，旨在為克氏原螯蝦蝦青素綜合提取及后續(xù)相關(guān)體色研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀1260（美國(guó)Agilent 公司），T25 均質(zhì)機(jī)（德國(guó)IKA 公司），913 pH 計(jì)（瑞士萬(wàn)通公司），BSA822 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器），移液槍（德國(guó)Eppendorf 公司），14R 離心機(jī)（Dynamica Velocity）。

試劑分別為甲醇、乙腈（德國(guó)默克公司），全反式蝦青素標(biāo)品（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

克氏原螯蝦均采集于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所浦口基地，采集時(shí)間為2021年10月，選擇同一塘口的克氏原螯蝦，規(guī)格、體色均為隨機(jī)抽樣?？偣膊蓸? 只克氏原螯蝦，分別為1～9 號(hào)，采集其頭胸甲殼、尾肢殼、鉗甲、足甲部位的甲殼進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 殼色測(cè)定

采用HSB 模型對(duì)蝦殼殼色進(jìn)行測(cè)定，其中H為色調(diào)（°），S 為飽和度（%），B 為亮度（%），采樣前進(jìn)行拍照，記錄殼色，設(shè)備為佳能m 6 微單，圖像分析采用Adobe Photoshop CS6（美國(guó)Adobe）軟件，測(cè)定蝦殼不同部位顏色。

1.2.3 游離蝦青素的測(cè)定方法

1.2.3.1 樣品的提取

稱取樣品攪拌加無(wú)水硫酸鎂、均質(zhì)器、丙酮（20 mL）提取2 次；取2 mL 樣品提取液，加入2.9 mL 0.02 mol/L NaOH 甲醇過(guò)夜，渦旋混合后充氮密閉，在4 ℃冰箱中反應(yīng)12 h；然后在溶液中加入0.1 mL 0.6 mol/L 磷酸甲醇中和剩余的堿，再加100 mg PSA混勻靜置上機(jī)。

1.2.3.2 色譜條件

色譜柱：Cremo-LC-026 柱；流動(dòng)相：甲醇30%乙腈70%；流量：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：476 nm；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。分別取樣品溶液和蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下洗脫。游離蝦青素含量測(cè)定換算公式如下。

式中：ρ——樣品質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品體積，40 mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

ω——總蝦青素含量，μg/g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=100.0643 x-7.1980（R=0.99946），表明蝦青素在0～12 μg/mL 線性關(guān)系良好，可用于蝦青素總量的測(cè)定。

1.2.4 游離型和酯化型蝦青素測(cè)定方法

根據(jù)《水產(chǎn)品及其制品中蝦青素含量的測(cè)定高效液相色譜法》（SC/T 3053—2019），對(duì)樣品進(jìn)行皂化處理，皂化后測(cè)定的為酯化型和游離型蝦青素的總量，第一次未皂化測(cè)定的為游離型蝦青素的總量，將其減去第一次測(cè)定的蝦青素量即為酯化型蝦青素的含量。皂化后總蝦青素含量測(cè)定換算公式如下。

式中：ρ——樣品質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品體積，40 mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

ω——總蝦青素含量，μg/g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=103.7193 x-8.3930（R=0.99944），表明蝦青素在0～12 μg/mL 時(shí)，線性關(guān)系良好，可用于蝦青素總量的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測(cè)定結(jié)果采用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）（n=3）表示；采用Gragh Pad Prism 6 軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位蝦殼中總蝦青素含量差異分析

采用有機(jī)溶劑提取克氏原螯蝦不同部位的蝦殼蝦青素，采用高效液相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖1（a）（b）。由圖1 可見(jiàn)，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（游離型）在5.6 min附近處有特征吸收峰，為全反式蝦青素；在6.7 和7.1 min 處分別出現(xiàn)特征峰，為13-順式蝦青素和9-順式蝦青素。洗脫時(shí)間表明，克氏原螯蝦不同部位均有游離型全反式蝦青素存在。

圖1 蝦青素高效液相色譜圖

將對(duì)蝦殼提取物進(jìn)行皂化操作，將其中酯化性蝦青素轉(zhuǎn)化為游離型蝦青素，測(cè)量總蝦青素含量。不同編號(hào)克氏原螯蝦蝦殼總蝦青素含量對(duì)比見(jiàn)圖2（a）（b）（c）（d）。由圖2 可見(jiàn)，總蝦青素含量最高值為3 號(hào)尾肢殼（311.37±0.16）μg/g，最低值為8 號(hào)鉗殼（35.25±0.05）μg/g，同規(guī)格克氏原螯蝦尾肢殼蝦青素總量高于其他部位，頭甲殼和鉗殼含量相近，足殼中含量最少。

圖2 不同編號(hào)克氏原螯蝦蝦殼總蝦青素含量對(duì)比

2.2 不同部位蝦殼游離和酯化蝦青素含量差異分析

蝦青素六元環(huán)上的羥基能夠與脂肪酸結(jié)合形成蝦青素脂肪酸酯。蝦青素酯類在477 nm 附近也有特征吸收，但是因?yàn)槭杷愿哂谟坞x型，所以洗脫時(shí)間長(zhǎng)、出峰時(shí)間晚。樣品中待測(cè)物采用丙酮或二氯甲烷-甲醇混合溶液提取，經(jīng)堿皂化，其中的蝦青素酯轉(zhuǎn)化為游離態(tài)蝦青素。

不同編號(hào)克氏原螯蝦蝦殼中游離型蝦青素和酯化型蝦青素含量對(duì)比見(jiàn)圖3（a）（b）（c）（d）（e）（f）。由圖3 可見(jiàn)，游離型蝦青素含量最高值為4 號(hào)尾肢殼（140.29±0.19）μg/g，最低值為7 號(hào)足殼（20.65±0.07）μg/g。酯化蝦青素含量最高值為3 號(hào)頭甲殼（164.78 μg/g），最低值為2 號(hào)足殼（7.02 μg/g），酯化蝦青素量在頭胸甲和尾肢甲中含量高于游離蝦青素，而在蝦足殼中含量相似，游離型和酯型蝦青素的相對(duì)含量比例各不相同，差異較大，這可能由于選樣的克氏原螯蝦在大小規(guī)格體色上差異較大。由此可見(jiàn)，游離型蝦青素和酯化蝦青素的比例可能隨著龍蝦性征的改變而發(fā)生改變。

圖3 不同編號(hào)克氏原螯蝦蝦殼中游離型蝦青素和酯化型蝦青素含量對(duì)比

2.3 不同部位蝦殼中蝦青素含量與結(jié)構(gòu)差異和殼色深淺之間的關(guān)系

HSB 模型分析克氏原螯蝦蝦殼殼色見(jiàn)圖4（a）（b）（c）（d）（e）（f）（g）（h）（i）。根據(jù)HSB 顏色模型，色調(diào)越近0 點(diǎn)紅色加深，飽和度S 色，亮度B 越高色彩越明亮。運(yùn)用Adobe Photoshop CS6 對(duì)其進(jìn)行HSB 模型分析，分析后數(shù)值經(jīng)Gragh Pad Prism 6處理后得到圖5（a）（b）（c）（d）（e）（f）。

圖4 不同編號(hào)克氏原螯蝦HSB 模型體色分析。

由圖3 和圖5 可見(jiàn)，游離蝦青素含量較高的蝦普遍會(huì)呈現(xiàn)較深的殼色，色彩偏暗，飽和度也會(huì)較低，游離蝦青素含量較少，趨向于淺紅或者麻青的殼色，而色彩較明亮，飽和度較高。

圖5 不同編號(hào)克氏原螯蝦殼色的比較

3 討論

克氏原螯蝦獲得脂溶性類胡蘿卜素只能通過(guò)攝食，然后由代謝過(guò)程轉(zhuǎn)運(yùn)至色素細(xì)胞中。該試驗(yàn)選擇了同一塘口同一批次的克氏原螯蝦，規(guī)格多為5～8 cm 的紅殼蝦和青殼蝦，紅殼蝦性腺發(fā)育階段大多處于II、III 期，而青殼蝦性腺發(fā)育階段大多處于I、II 期，但也有部分5 cm 左右紅殼小蝦，性腺未成熟卻呈現(xiàn)紅色的狀態(tài)，這與郭風(fēng)英等、龔志等研究結(jié)果相似。由此可見(jiàn)，大部分的試驗(yàn)可以證明體色并非判定性成熟的標(biāo)志之一。費(fèi)志良等認(rèn)為青殼原螯蝦是當(dāng)年紅殼蝦蛻殼越冬后呈現(xiàn)的狀態(tài)。費(fèi)志良等還發(fā)現(xiàn)紅殼蝦生長(zhǎng)速度較慢，含肉率偏低，但營(yíng)養(yǎng)較為豐富，青殼蝦生長(zhǎng)速度較快。本試驗(yàn)對(duì)克氏原螯蝦蝦殼進(jìn)行HSB 模型分析發(fā)現(xiàn)，隨著殼色值的降低，殼色不斷加深，游離蝦青素的含量越高，說(shuō)明蝦青素含量的變化直接導(dǎo)致克氏原螯蝦殼色的改變。

黃永裕等研究不同類胡蘿卜素添加對(duì)中華鋸齒米蝦（）紅色品系體色的影響。結(jié)果顯示，天然蝦青素、螺旋藻、人工蝦青素、葉黃素對(duì)體色黃色值改善效果依次提升。河蟹的體色也基本取決于其類胡蘿卜素含量，蝦蟹類水生動(dòng)物一般不能自身合成類胡蘿卜素，將食物中的類胡蘿卜素直接轉(zhuǎn)化為自身所需要的類胡蘿卜素，當(dāng)蝦蟹機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，蝦青素可清除其體內(nèi)的活性氧自由基。因此，體色的變化還有可能受到外部環(huán)境刺激所致，類胡蘿卜素?cái)z入量和消耗量的變化同樣對(duì)蝦蟹類的體色具有較大的影響，增加了對(duì)蝦蟹體色與蝦青素含量探究的不確定性。該試驗(yàn)中，選擇的克氏原螯蝦均來(lái)自同一塘口，受到不同環(huán)境刺激的可能性較小，但在運(yùn)輸過(guò)程中部分蝦有應(yīng)激反應(yīng)，其對(duì)蝦青素含量變化的影響程度有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜檢測(cè)其蝦殼不同部位蝦青素的含量，分析克氏原螯蝦甲殼顏色與蝦青素含量的關(guān)系。結(jié)果表明，克氏原螯蝦尾肢殼蝦青素總量高于其他部位，頭甲殼和鉗殼含量相近，足殼中含量最少；克氏原螯蝦殼色與游離蝦青素的含量有著密切的關(guān)系；游離型蝦青素和酯化蝦青素的比例可能隨著龍蝦性征的改變而發(fā)生變化。今后，可以通過(guò)研究蝦青素形態(tài)變化的基因，進(jìn)一步探究克氏原螯蝦體色變化的具體調(diào)控機(jī)制，為克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展提供參考。