黃樺，王晶晶，李騫，張峻（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科，昆明 650032）

妊娠期用藥安全性受到社會高度關(guān)注，過去臨床上通常以美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）的“妊娠期用藥安全分級”為主要依據(jù)對孕期用藥安全及風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，因FDA 分級過于依賴動物研究，且存在更新慢、分級簡單、爭議大等問題，越來越多的專家和學(xué)者建議完善妊娠期用藥安全性信息，F(xiàn)DA 也于2015年提出更新妊娠期用藥評價(jià)規(guī)則。但是，種屬差異和倫理原則的限制給妊娠期用藥安全性信息的獲取帶來困難。胎盤作為母體與胎兒之間的營養(yǎng)物質(zhì)交換場所，是維持胎兒生長發(fā)育的重要器官和保護(hù)屏障?；谌颂ケP建立的體外循環(huán)灌注模型是目前唯一一種用于研究物質(zhì)在完整人胎盤組織中轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，是研究外來物質(zhì)（如藥物、毒物、環(huán)境污染物等）能否透過胎盤、對胎兒造成暴露的經(jīng)典模型，應(yīng)用該模型進(jìn)行藥物的體外胎盤透過性研究是評價(jià)妊娠期用藥安全性的重要依據(jù)[1-3]。

妊娠期糖尿病是妊娠期常見的并發(fā)癥之一。妊娠期糖尿病患者應(yīng)及時進(jìn)行營養(yǎng)與運(yùn)動干預(yù)，當(dāng)飲食治療和運(yùn)動不能有效控制血糖時，胰島素是治療的首選藥物。但由于給藥途徑和治療費(fèi)用等原因，孕產(chǎn)婦常無法堅(jiān)持胰島素治療。因此，口服降糖藥在妊娠期糖尿病治療中的合理使用備受關(guān)注。第二代口服磺酰脲類降糖藥格列本脲因使用方便，且經(jīng)濟(jì)有效，已被美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會納入妊娠期糖尿病可選擇的口服降糖藥之一[4]。但目前格列本脲在國內(nèi)妊娠期使用安全性數(shù)據(jù)有限，并未納入我國妊娠期治療糖尿病的注冊適應(yīng)證。為此，本課題組前期應(yīng)用人胎盤體外循環(huán)灌注模型開展了格列本脲的體外胎盤透過性研究，結(jié)果表明，格列本脲在中國人群中的胎盤透過率極低[5]，其原因除了較高的血漿蛋白結(jié)合率（99.8%）和較短的終末消除半衰期（約10 h）外，更重要的還歸因于胎盤合胞體滋養(yǎng)層中的ATP 結(jié)合盒（ABC）外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括P-糖蛋白（PGP）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）以及多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRPs）等，格列本脲已被證明是ABC 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物[6-7]。PGP 可將藥物外排至細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)濃度，是胎盤屏障的重要組成部分，但是研究未證明PGP 參與了格列本脲的轉(zhuǎn)運(yùn)[6，8]。MRPs 主要分布在胞內(nèi)膜系統(tǒng)上，通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)排出進(jìn)入細(xì)胞或胞內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)。一項(xiàng)基于人胎盤體外灌注模型的研究表明，吲哚美辛的加入并未影響格列本脲的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)[9]；但另有研究表明，MRPs 能夠優(yōu)先參與格列本脲的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。BCRP 廣泛分布于胎盤合體滋養(yǎng)層中，研究表明，BCRP 是格列本脲的主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)體[7-8，10-11]。Hemauer 等[12]研究結(jié)果則表明，格列本脲被PGP、BCRP 和MRPs 轉(zhuǎn)運(yùn)的比例分別為（9±5）%、（25±5）%以及（43±4）%。由此可見，國外研究結(jié)果對于ABC 家族中參與格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的主要外排蛋白結(jié)論不一，且胎盤是最具種屬差異的器官，因此，在中國人群中開展相關(guān)研究尤為重要。

為進(jìn)一步明確格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的主要外排蛋白，本研究應(yīng)用人胎盤體外循環(huán)灌注模型，并結(jié)合特異性PGP 抑制劑維拉帕米、BCRP 抑制劑尼卡地平和MRPs 抑制劑吲哚美辛，進(jìn)行ABC外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)影響的研究，為格列本脲在妊娠期的合理使用提供參考。

1 材料

自然分娩或剖宮產(chǎn)剛娩出的健康、完整、足月（孕37 ～41 周）的人胎盤222 例（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科），研究方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[倫理批件號：（2016）倫理L 第5-1 號]。

磁力加熱攪拌器P-HPS75（美國Talboys 公司）；蠕動泵（含Masterflex L/S 07523-90 泵控制臺和Masterflex L/S easy-load Ⅱ泵頭，美國Cole-Parmer 公司）；透明加熱循環(huán)浴槽Itherm-19M（德國Vivo 公司）；Simplicity 純水儀（美國Millipore公司）；血?dú)夥治鰞xSH138-iSTAT（美國雅培公司）；全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀UniCel DxI 800（美國貝克曼庫爾特公司）。

格列本脲對照品（美國Alfa Aesar 公司，批號：10099682，純度＞99%）；維拉帕米對照品（批號：100223-200102，純度＞99.9%）、尼卡地平對照品（批號：100586-201102，純度＞99.9%）、安替比林對照品（批號：100506-200301，純度＞99.9%）（中國食品藥品檢定研究院）；吲哚美辛對照品（大連美侖公司，批號：J0426A，純度＞99.7%）；Krebs-Ringer Bicarbonate 緩沖液（邁晨科技有限公司，批號：D2712140）；牛血清白蛋白（美國Biosharp 公司，批號：MR30354）；碳酸氫鈉注射液（濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司，批號：13120802，規(guī)格：0.5 g）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：1312108，規(guī)格：12500 單位）；乙腈（Merck 公司，色譜純）；甲醇（Merck 公司，色譜純）；甲酸（Adamas 公司，色譜純）；水為自制超純水。

2 方法

胎盤娩出運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，按照參考文獻(xiàn)方法[2，5]建立母體側(cè)和胎兒側(cè)的雙向閉合循環(huán)，并分為4 組，每組循環(huán)灌注10 例。各組的試驗(yàn)藥物及其在母體池中的濃度分別為：

格列本脲組：格列本脲（200 ng·mL－1）；PGP 抑制劑組：格列本脲（200 ng·mL－1）和維拉帕米（13.5 μg·mL－1）；BCRP 抑制劑組：格列本脲（200 ng·mL－1）和尼卡地平（40 μg·mL－1）；MRPs 抑制劑組：格列本脲（200 ng·mL－1）和吲哚美辛（280 μg·mL－1）。30 min 預(yù)灌注后，在母體池中加入適量安替比林（終質(zhì)量濃度為100 μg·mL－1）；并按照分組在母體池中加入試驗(yàn)藥物。

循環(huán)灌注3 h，于循環(huán)開始后0、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min 采集母體側(cè)與子體側(cè)的樣本，按本實(shí)驗(yàn)室前期建立的UFLCMS/MS 法[13]測定胎盤灌流液中格列本脲濃度。每30 min 從母體池取樣，使用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀UniCel DxI 800 測定人絨毛膜促性腺激素 （β-hCG）濃度；每30 min 分別從母體和子體灌流液取樣，使用血?dú)夥治鰞xSH138-iSTAT 檢測pH 值、pO2、葡萄糖和乳酸。

模型建立成功的評價(jià)指標(biāo)為[2-3，5]：① 陽性標(biāo)記物安替比林的透過率＞20%；②3 h 循環(huán)灌注的子體側(cè)滲漏量≤12 mL；③ 母體側(cè)pO2維持在187 ～262 mmHg（1 mmHg ＝0.133 kPa），子體側(cè)pO2維持在75 ～112 mmHg；④ 母體池和子體池pH 值維持在7.2 ～7.45；⑤ 葡萄糖消耗量、乳酸生成量以及母體池β-hCG 無較大波動。

格列本脲胎盤透過率按如下公式計(jì)算：FTR ＝Cf×100/Cm，其中Cf為循環(huán)結(jié)束時子體側(cè)藥物濃度，Cm為母體側(cè)初始藥物濃度。為降低不同胎盤小葉之間大小、絨毛層厚度、血管壁厚度等差異造成的誤差，同時計(jì)算其相對透過率，即格列本脲胎盤透過率與陽性標(biāo)記物安替比林胎盤透過率的比值。

3 結(jié)果

本研究共建立222 例胎盤體外循環(huán)灌注模型，其中符合評價(jià)指標(biāo)的成功建模40 例。3 h 循環(huán)灌注過程中子體側(cè)平均滲漏量（6.20±4.35）mL（n＝40），乳酸生成量、葡萄糖消耗量及hCG分泌（見表1）保持穩(wěn)定，pH 和pO2均符合模型建立成功的評價(jià)指標(biāo)要求（見表2）。

表1 3 h 格列本脲胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中葡萄糖消耗量、乳酸生成量及β-hCG 的平均變化量(n ＝36)Tab 1 Glucose consumption，lactate production and β-hCG secretion in 3 hours of glyburide (n ＝36)

表2 3 h 格列本脲胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中pH、pO2 檢測結(jié)果(n ＝36)Tab 2 pH and pO2 of glyburide in 3 hours (n ＝36)

3 h 循環(huán)結(jié)束時，陽性標(biāo)記物安替比林的胎盤透過率為（28.09±6.81）%（n＝40）。格列本脲組、PGP 抑制劑維拉帕米組、BCRP 抑制劑尼卡地平組以及MRPs 抑制劑吲哚美辛組格列本脲的胎盤透過率分別為（0.78±0.66）%、（2.17±0.90）%、（1.45±0.70）%、（3.65±2.10）%（n＝10）。不同ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑均不同程度地增加了格列本脲的胎盤透過率，見表3。

表3 不同ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對格列本脲胎盤透過率的影響(x±s，n ＝10)Tab 3 Effect of different ABC transporters inhibitors on glyburide transplacental transfer (x±s，n ＝10)

4 討論

本研究成功建立40 例人胎盤體外循環(huán)灌注模型，研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)運(yùn)體PGP、BCRP 與MRPs均不同程度地參與了格列本脲的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)，與未加入特異性蛋白抑制劑相比，MRPs 對格列本脲平均胎盤透過率的影響最大，PGP 次之，BCRP的影響最弱；根據(jù)相對胎盤透過率結(jié)果，MRPs和PGP 均對其有不同程度的影響，其中MRPs 影響較大，BCRP 基本無影響。推測在PGP、BCRP與MRPs 中，MPRs 可能是參與中國人群格列本脲胎盤外排的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。

預(yù)測藥物的胎兒暴露情況對妊娠期用藥安全性評價(jià)至關(guān)重要，人胎盤體外循環(huán)灌注模型直接應(yīng)用人類胎盤組織進(jìn)行研究，能夠更真實(shí)直接地反映胎盤功能（包括物質(zhì)交換、代謝和分泌等功能）及藥物在胎盤中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。但該模型通常納入健康足月胎盤建模，尚存在一定局限性。例如，對于妊娠期糖尿病患者，高血糖環(huán)境可能影響其胎盤的生理結(jié)構(gòu)和功能，一項(xiàng)針對廣東地區(qū)妊娠期糖尿病胎盤的研究表明，在基礎(chǔ)胰島素分泌降低并伴有胰島素分泌紊亂及胰島素功能抵抗的情況下，胎盤的組織結(jié)構(gòu)和功能可能會發(fā)生變化[14]。格列本脲在妊娠期糖尿病患者胎盤中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況是否與正常健康胎盤一致，仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

本研究應(yīng)用人胎盤體外循環(huán)灌注模型，為國內(nèi)首次進(jìn)行ABC 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)影響的研究。結(jié)果表明，在PGP、BCRP 與MRPs 中，MPRs 可能是參與中國人群格列本脲胎盤外排的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。本研究對完善格列本脲妊娠期用藥的安全性信息具有重要意義，同時為我國妊娠期糖尿病患者用藥選擇提供決策參考。