陳琪，劉婷婷，白圖雅，2，3，張夢迪，2，3*，胡玉霞，2，3，李君，2，3，常福厚，2，3*（.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價(jià)研究中心，呼和浩特 000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 000）

藥物代謝酶在人體維持正常生理活動中發(fā)揮重要功能，比如攝入的藥物、食物等大部分物質(zhì)是通過藥物代謝酶代謝后排出人體的，藥物代謝酶分為Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ相[1]。其中細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）屬于單氧酶的一類，在許多藥物代謝中起著關(guān)鍵作用，常見的Ⅰ相酶（CYP1A1、CYP1A2 和CYP1B1 等）將疏水化合物轉(zhuǎn)化為親水性發(fā)揮排毒過程；Ⅱ相酶，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases，GSTS），NAD（P）H：醌氧化還原酶-1 [NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO1]，UDP-葡糖醛陽糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTS）和血紅素氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1），可以催化結(jié)合反應(yīng)，使結(jié)合產(chǎn)物滅活，并增加代謝產(chǎn)物的水溶性以利于排泄；Ⅲ相酶系統(tǒng)由各種ATP 結(jié)合（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族組成，參與排除藥物和異生物質(zhì)及其代謝物[2]。代謝酶的不同活性狀態(tài)對抗腫瘤藥物有效性的影響非常重要，明確代謝酶在攝入藥物或者食物后的狀態(tài)是保證藥物活性的前提，本文欲探究天然植物中富含的槲皮素對谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione-S-transferase P1，GSTP1）的具體影響及機(jī)制。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，與芳烴核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（aryl hydrocarbon nuclear translocator，ARNT） 作為核伴侶蛋白形成異二聚體后，調(diào)節(jié)幾種藥物代謝酶的表達(dá)。這種 AhR/ARNT 復(fù)合物與二噁英或異生物質(zhì)反應(yīng)元件（dioxin or xenobiotic responsive element，DRE/XRE）的特定 DNA 序列結(jié)合，導(dǎo)致Ⅰ相酶和Ⅱ相酶的相鄰基因的轉(zhuǎn)錄激活，以及Ⅲ 期轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如多藥耐藥蛋白及相關(guān)蛋白的激活[3]。研究表明，AhR 還調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid-2-related factor 2，Nrf2）的表達(dá)[4]。細(xì)胞在受到氧化應(yīng)激刺激后，Nrf2 逃離KELCH 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（kelch-like ECHassociated protein 1，Keap1）介導(dǎo)的蛋白體降解并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中。在細(xì)胞核中，Nrf2 與小Maf 蛋白形成異二聚體，復(fù)合物再與ARE 結(jié)合并誘導(dǎo)Nrf2 依賴性藥物代謝基因，包括 NQO1、UGT 和GST[5]。因此，AhR 通過Nrf2 途徑直接或間接調(diào)節(jié)藥物代謝酶的表達(dá)。

槲皮素（quercetin）為黃酮類化合物，具抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)心血管等多種藥理作用[6]，抗肝癌活性尤為顯著，可以阻滯肝癌細(xì)胞周期，抑制肝癌細(xì)胞生長，具有顯著的抗腫瘤活性[7]。其抗腫瘤和化學(xué)預(yù)防特性可能是由于不同機(jī)制，包括自由基清除，改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)凋亡，抑制Ⅰ相酶對致癌物質(zhì)的代謝和誘導(dǎo)Ⅱ相酶對致癌物質(zhì)解毒。其中槲皮素在不同類型細(xì)胞中均可激活Nrf2-ARE 信號通路[8-9]。對GSTP1 表達(dá)的影響及對活性氧（reactive oxygen species，ROS）和電親物種的生物轉(zhuǎn)化特別有益。但具體的抗腫瘤機(jī)制目前尚未完全明確[10]，同時(shí)槲皮素以GSTP1為靶點(diǎn)發(fā)揮抗肝癌的作用機(jī)制也未闡明。本研究主要驗(yàn)證槲皮素影響HepG2 細(xì)胞GSTP1 表達(dá)及分子機(jī)制，對今后槲皮素抗肝癌機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)，為肝癌預(yù)防和診治方面提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試藥

人肝癌細(xì)胞株（HepG2）、抗體AhR（ab190797）、CYP1A1（ab235185）、Nrf2（ab62352）、NQO1（ab80588）、GSTP1（ab138491）、β-actin 抗體（英國Abcam），RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天），總RNA 提取試劑盒（TIANGEN），AhR 抑制劑（CH-223191）、Nrf2 抑制劑（ML-385）、槲皮素（B20527）（上海源葉有限公司），MTT、青霉素、鏈霉素、胰酶、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma 公司），Nuclear Extraction Kit（美國Thermo 公司），Rever Tra Ace q PCR RT Kit、SYBR Green 試劑盒（日本TOYOBO 公司），RNA simple Total RNA Kit（北京天根生化科技有限責(zé)任公司），DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）。

1.2 儀器

倒置生物顯微鏡（BDS200，德國Leica 公司），垂直電泳儀（HE99X-15-1.5，美國Hoefer 公司），臺式高性能離心機(jī)（ST16R，德國Leica 公司），金屬浴（OSE-DB-01，北京天根生化科技有限責(zé)任公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus HERA cell 150i，美國 Thermo Fisher 公司），多模式微孔板檢測儀（Multiskan Mk3，Perkin Elimer 公司），－80℃超低溫冰箱、熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Thermo-Forma-702，美國Thermo Fisher 公司），超微量核酸蛋白測定儀（ND2000C，Nanodrop 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞系HepG2 置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至對數(shù)期，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代。

2.2 槲皮素對細(xì)胞活力影響

取HepG2 細(xì)胞接種96 孔板培養(yǎng)24 h 后，不同濃度槲皮素（20、40、80、160 μmol·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)基后向細(xì)胞中加入含有0.5 mg·mL－1MTT 試劑，37℃孵育4 h，吸出MTT加入150 μL DMSO 震蕩搖勻10 min，570 nm 處測量吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

2.3 核蛋白提取

取HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板，采取不同濃度槲皮素（20、40、80、160 μmol·L－1）處理后，按照核蛋白提取試劑盒（ab78833）提取核蛋白。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測mRNA表達(dá)

取HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板，分為對照組，槲皮素組（40 μmol·L－1），Nrf2 抑制組（1 μmol·L－1），槲皮素＋Nrf2 抑制組，觀察槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 的影響。另將細(xì)胞分為對照組，槲皮素組（40 μmol·L－1），AhR 抑制組（1 μmol·L－1），槲皮素＋AhR 抑制組，觀察槲皮素通過AhR 對GSTP1 的影響。收集各組細(xì)胞，按照TRIzol 說明書裂解細(xì)胞，使用氯仿提取總RNA，用紫外分光光度法測定RNA 樣品的OD260/OD280值，并進(jìn)行定量。反轉(zhuǎn)錄引物見表1，擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min，92℃ 30 s，62 ℃ 30 s，74 ℃ 1 min，32 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 儀器自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線，所得結(jié)果直接在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行比較分析，目標(biāo)基因的相對定量用2－ΔΔCT計(jì)算。

表1 基因引物序列信息Tab 1 Gene primer sequence information

2.5 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

收集藥物作用后細(xì)胞，離心和裂解收集后用BCA 方法測定蛋白濃度。取等量的蛋白質(zhì)，SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶印跡到硝酸纖維素膜上，封閉緩沖液中培養(yǎng)，相應(yīng)一抗在4℃的封閉緩沖液中孵育過夜，室溫下進(jìn)行二次抗體培養(yǎng)1 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)，采用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)相對灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對GSTP1 表達(dá)的影響

不同濃度槲皮素對HepG2 活力影響如圖1A 所示，當(dāng)濃度達(dá)到80 μmol·L－1時(shí)對細(xì)胞增殖有抑制作用（P＜0.01）。不同濃度的槲皮素對GSTP1的表達(dá)影響如圖1B 所示，與對照組相比，不同濃度槲皮素組GSTP1mRNA 表達(dá)升高（P＜0.001），蛋白表達(dá)與基因水平結(jié)果一致，如圖1C、1D。根據(jù)上述結(jié)果選取槲皮素40 μmol·L－1的劑量作為后續(xù)研究分子機(jī)制的藥物濃度。

圖1 槲皮素對HepG2 活力及GSTP1 表達(dá)的影響Fig 1 Effect of quercetin on the vitality of HepG2 cells and the expression of GSTP1

3.2 槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 的影響

槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 的影響如圖2所示。與對照組相比，槲皮素組Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表達(dá)升高（P＜0.001），Nrf2 抑制劑組Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Nrf2 屬于核轉(zhuǎn)錄因子，單獨(dú)添加抑制劑并不影響Nrf2 表達(dá)。與槲皮素組相比，槲皮素＋Nrf2 抑制劑組Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表達(dá)下降（P＜0.001）。蛋白表達(dá)與基因水平結(jié)果一致，說明槲皮素可以通過 Nrf2 激活GSTP1 的表達(dá)。

圖2 槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 基因和蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of quercetin on the expression of GSTP1 gene and protein via Nrf2

3.3 槲皮素對Nrf2 核易位影響

如圖3 所示，隨著槲皮素濃度的升高，Nrf2從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核增多，說明槲皮素可以促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)錄活性，通過Nrf2 直接影響GSTP1 的表達(dá)。

圖3 不同濃度槲皮素對Nrf2 核易位的影響Fig 3 Effect of quercetin at different concentrations on Nrf2 nuclear translocation

3.4 槲皮素通過AhR 對GSTP1 的影響

槲皮素通過AhR 對GSTP1 的影響如圖4 所示。與對照組相比，槲皮素組的AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01，P＜0.001），AhR 抑制劑組AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于AhR 為芳香烴受體，屬于受體蛋白，單獨(dú)添加抑制劑不會影響AhR及下游CYP1A1、GSTP1 的表達(dá)。與槲皮素組相比，槲皮素＋AhR 抑制劑組AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01，P＜0.001）。表明槲皮素可以通過激動AhR 信號通路進(jìn)而影響GSTP1mRNA 的表達(dá)。AhR 與GSTP1 蛋白表達(dá)與基因水平一致。而CYP1A1 在蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能因?yàn)殚纹に刈鳛锳hR 低親和力配體低濃度時(shí)僅促進(jìn)下游mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，在翻譯過程可能受其他因素的干擾，導(dǎo)致CYP1A1 蛋白表達(dá)無明顯變化（見圖4）。

圖4 槲皮素通過AhR 對GSTP1 基因和蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of quercetin on the expression of GSTP1 gene and protein via AhR

4 結(jié)論

天然植物富含抗氧化和抗腫瘤的活性，大多與類黃酮的含量相關(guān)，此類物質(zhì)可以調(diào)節(jié)藥物代謝酶活性[11]，故明確類黃酮對代謝酶的影響是研究黃酮類物質(zhì)抗腫瘤機(jī)制必不可少的過程。本研究主要探討了槲皮素對GSTP1 代謝酶的調(diào)節(jié)作用，首先給予安全劑量范圍的槲皮素，GSTP1 以及AhR 下游CYP1A1 均有所上調(diào)（P＜0.01），阻斷AhR 后則下調(diào)（P＜0.01），證明了槲皮素可以通過AhR 信號通路影響GSTP1 的表達(dá)；同時(shí)還通過核轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)證明槲皮素可以通過Nrf2直接影響GSTP1 的表達(dá)，同樣Nrf2 相關(guān)信號通路標(biāo)記物NQO1 在給予槲皮素刺激后表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），給予Nrf2 阻斷劑后GSTP1 表達(dá)下降（P＜0.01）。這些結(jié)果均證明槲皮素可通過AhR 及Nrf2 信號通路激動GSTP1 的表達(dá)。

目前GSTs 被分為7 個亞型，分別為alpha（α）、pi（π）、mu（μ）、theta（θ）、omega（ω）、sigma（σ）和zeta[12]，這些同工酶參與了通過谷胱甘肽結(jié)合的外源性藥物的Ⅱ期解毒反應(yīng)[13-14]，這在致癌物解毒和抗腫瘤藥物代謝過程中起到重要作用。它們可以通過結(jié)合活性化合物或藥物直接影響過度氧化或烷基化藥物的理化性質(zhì)[15]。同時(shí)GST 酶在化療藥物的解毒中也發(fā)揮著重要作用[16]。有些藥物（如環(huán)磷酰胺）需要代謝酶轉(zhuǎn)化為強(qiáng)效烷化劑才能發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，但同時(shí)需要代謝酶轉(zhuǎn)化為易排泄的復(fù)合物才可以消除毒副作用[17]。此外GST 的多態(tài)性與氟尿嘧啶和鉑為基礎(chǔ)的化療化合物藥效相關(guān)[18-19]，因此GST 家族成員在保證藥效及排泄解毒方面發(fā)揮重要的作用。

GSTP1 是GST 家族中研究最多的成員[20]。GSTP1基因位于染色體11q13 上，由9 個外顯子組成，長度為3.2 kb。GSTP1 具有廣泛的生理功能：參與代謝、解毒和消除潛在基因毒性異物復(fù)合物，代謝多種致癌化合物，保護(hù)細(xì)胞免受DNA 損傷和癌變。體現(xiàn)在細(xì)胞中的功能包括親電化合物的催化和脫氧、氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)[21-22]。GSTP1 能有效地保護(hù)細(xì)胞免受致癌物和親電化合物的傷害[23-24]。在前列腺癌中普遍存在的GSTP1 的表觀遺傳沉默機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞長期氧化損傷后的存活率改變，表明GSTP1 具有保護(hù)和抗腫瘤功能[25]。GSTP1 還能縮短As2O3在細(xì)胞中的滯留時(shí)間。GSTP1 的分解代謝功能降低了細(xì)胞中As2O3的含量，從而阻斷As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26]。此外，GSTP1 還參與了煙草中致癌物的消除過程，且在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中都發(fā)揮著清除有毒物質(zhì)的作用[27]。GSTP1 還參與保護(hù)細(xì)胞免受氧化劑誘導(dǎo)的DNA 損傷[28]，阻止脂多糖誘導(dǎo)的促炎因子過度產(chǎn)生，并具有抗炎作用[29]?？傊?，GSTP1 作為一種藥物代謝酶，在解毒、抗氧化及維持抗腫瘤藥物的活性中發(fā)揮著重要作用，機(jī)體需要保持一定含量及穩(wěn)態(tài)的GSTP1 以維持機(jī)體的健康運(yùn)轉(zhuǎn)。

本研究分析表明，槲皮素可以激動HepG2 細(xì)胞中GSTP1 的表達(dá)，其通過激動AhR 及Nrf2 信號通路進(jìn)而改變GSTP1 的表達(dá)，這可以從AhR的下游CYP1A1 的表達(dá)被槲皮素激活所證實(shí)，Nrf2 的下游NQO1 同樣被槲皮素激動，雖然激活能力不一致，但對照已發(fā)表的研究表明，槲皮素產(chǎn)生的對抗氧化應(yīng)激的保護(hù)趨勢一致[30-32]?？傊?，槲皮素可以激活HepG2 細(xì)胞中的AhR 和Nrf2信號通路，并且通過AhR 和Nrf2 信號通路調(diào)節(jié)GSTP1 的表達(dá)，這對理解槲皮素通過調(diào)節(jié)肝藥酶的活性進(jìn)而發(fā)揮解毒抗氧化作用具有重要意義。