溫金華（南昌大學第一附屬醫(yī)院GCP，南昌 330006）

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，全球有一半以上的肝癌發(fā)生在我國，病死率在惡性腫瘤中居第二位。盡管肝癌的診療技術(shù)已取得很大進展，但仍有大約80%的病例發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，且多數(shù)合并肝硬化，并伴有肝功能異常，無法接受根治性手術(shù)治療[1]。作為肝癌綜合治療的重要手段，藥物治療在臨床上發(fā)揮著不可代替的作用，其中分子靶向治療藥物由于具有高選擇性、高敏感性及高效性的特點，逐漸成為肝癌傳統(tǒng)治療外一種重要的治療手段，如多靶點激酶抑制劑（TKIs，包括索拉非尼、尼洛替尼、凡德他尼、卡奈替尼等）[2]。其中，索拉非尼作為晚期肝癌的有效治療用藥，具有抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成的作用，可顯著延長晚期肝細胞癌（HCC）患者的生存時間[3-4]。索拉非尼作用的靶器官是肝臟，由于病理狀態(tài)下，肝臟的功能及藥物在其中的分布均可能發(fā)生變化，從而影響藥物的藥動學及藥效學特性。本文研究索拉非尼在肝癌細胞（HepG2）與正常肝細胞（LO2）中的攝取動力學特性，從而比較HepG2 與LO2 細胞對藥物的攝取變化，這對病理狀態(tài)下探索索拉非尼的藥物代謝動力學特性具有一定的臨床意義。

1 材料

高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津shimadzu 20AT）；Discovery 色譜柱ODS C18column （150 mm×4.6 mm，5 μm）； 保護柱為Agilent ODS C18column （12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；DHG-9070 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；MIKRO 22R 高速離心機（德國Hettich）。3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱、細胞培養(yǎng)皿（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ECLIPSE Ti-S倒置相差顯微鏡（日本Nikon 公司）；SpectraMax Plus 384 全波長酶標儀（美國MD）；TDZ4-WS低速自動平衡離心機（湖南湘儀）。

HepG2 與LO2 細胞（杭州赫貝公司）；HepG2細胞培養(yǎng)基（Gibco DMEM basic）；LO2 細胞培養(yǎng)基（Gibco RPMI Medium 1640）；胎牛血清（FBS，Gibco 公司，貨號10099-141）；索拉菲尼對照品[純度＞99%，中科華檢（北京）科技有限公司]；甲醇、乙腈（色譜純，SIGMA-ALORICH）；三氟乙酸（分析純，杭州米克化工有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HepG2 細胞株培養(yǎng)條件：含10% FBS 和1×青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基；LO2 細胞株培養(yǎng)條件：含10% FBS 和1×青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。將HepG2 或LO2 細胞在對應(yīng)的培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞處理

取正常培養(yǎng)的處于對數(shù)期的兩種細胞株，用0.25%Typsin 消化，1000 r·min－1離心5 min，計數(shù)板下計數(shù)，鋪6 孔板，每種細胞4 個孔，每孔均加入5×105個細胞，放入培養(yǎng)箱中靜置2 d。吸取培養(yǎng)液，加入10 μL 濃度分別為0.25×10－3、0.5×10－3、0.75×10－3、1.0×10－3、1.25×10－3、2.0×10－3mmol·L－1的索拉非尼，培養(yǎng)液終濃度達到5、10、15、20、25、40 μmol·L－1，加入至對應(yīng)的HepG2 及LO2 細胞中，10 min 后處理細胞，吸去含藥培養(yǎng)基，1×PBS 洗3 遍后，加入0.5 mL 無菌水于－80 ℃冰箱反復(fù)凍溶3 次，收集細胞裂解液，用于索拉非尼濃度檢測。采用同樣的方法，加入索拉非尼使其培養(yǎng)液終濃度為10 μmol·L－1，經(jīng)過5、10、20、40 min 孵育后處理細胞，用于藥物濃度檢測。

2.3 樣品的處理與制備

從超低溫冰箱中取出不同處理組細胞裂解液樣本，溶解后準確吸取0.2 mL 于5 mL 具塞離心管中，準確加入2 mL 乙酸乙酯，振蕩10 s，于4℃環(huán)境下5000 r·min－1離心5 min。取有機相于尖底玻璃管中，剩余細胞裂解液殘渣用2 mL乙酸乙酯重復(fù)萃取一次，離心后合并兩次有機相，于50 ℃水浴中氮氣流吹干，殘渣用0.1 mL甲醇復(fù)溶，超聲15 s，漩渦混勻1 min，18 000 r·min－1離心5 min，取上清液20 μL 進高效液相色譜系統(tǒng)分析。

2.4 細胞總蛋白提取

將各組細胞樣品收集到1.5 mL EP 管中，每管中加入200 μL Western blot 及IP 裂解液[使用前加入苯甲基磺酰氟（PMSF），終濃度1 mmol·L－1]，混勻后4℃裂解30 min，同溫條件12 000 r·min－1離心處理樣品，分別取上清液儲存。BCA 法測定蛋白濃度：將0.5 mg·mL－1標準牛血清蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20 μL 加到96 孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL。樣品用對照品稀釋液稀釋一定濃度后加20 μL 到96 孔板中。按50 倍體積BCA 試劑A 加1 倍體積BCA 試劑B（50∶1）配制適量BCA 工作液，充分混勻，各孔加入200 μL BCA 工作液，37℃放置30 min。測定562 nm 處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度。

2.5 色譜條件

色譜柱：Discovery 色譜柱ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流動相為乙腈-水-0.1%三氟乙酸＝45∶35∶20（V/V），流速1.0 mL·min－1，檢測波長266 nm，進樣量20 μL。采用該條件進行了索拉非尼HPLC 檢測方法的精密度、準確度和穩(wěn)定性等方法學考察，結(jié)果均符合要求。

2.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)米氏方程：V＝Vmax[S]/（Km＋[S]）計算攝取動力學參數(shù)，V（pmol·mg protein－1·min－1）為攝取速率，Vmax為最大攝取速率，Km為米氏常數(shù)，[S]為底物濃度。

3 結(jié)果

3.1 細胞培養(yǎng)及索拉非尼細胞裂解液中濃度檢測方法

按培養(yǎng)條件完成HepG2 與LO2 的細胞培養(yǎng)（見圖1），成功建立了索拉非尼的液相色譜檢測方法（見圖2），在本試驗提取方法和色譜條件下，索拉非尼在0.5 ～10.0 μg·mL－1吸光度線性關(guān)系良好，標準曲線方程為Y＝3.172×104X－2.966×103（r＝0.9999）。方法學驗證顯示精密度、準確度和不同條件下的穩(wěn)定性均達到相關(guān)要求（見表1 和表2）。

表1 索拉非尼檢測方法的精密度與準確度(n ＝5)Tab 1 Precision and accuracy of sorafenib (n ＝5)

表2 索拉非尼檢測方法的穩(wěn)定性考察(n ＝5，%)Tab 2 Stability of sorafenib (n ＝5，%)

圖1 HepG2 與LO2 細胞貼壁圖Fig 1 Attachment diagram of HepG2 and LO2 cells

圖2 索拉非尼色譜圖Fig 2 Chromatogram of sorafenib

3.2 索拉非尼的攝取動力學

HepG2 細胞對索拉非尼的攝取隨著索拉非尼濃度的增加而增加，在濃度為20 μmol·L－1時攝取趨于飽和；而LO2 細胞對索拉非尼的攝取亦隨著索拉非尼濃度的增加而增加，在濃度為15μmol·L－1時攝取趨于飽和；但與LO2 細胞相比較，HepG2 細胞對索拉非尼的攝取量明顯增加（見圖3）。當加入10 μmol·L－1的索拉非尼，HepG2 與LO2 細胞對索拉非尼的攝取隨著時間的增加而增加，均在20 min 時趨于飽和。HepG2 細胞的Vmax為（684.14±78.19）pmol·mg protein－1·min－1，Km為（93.3±17.56）μmol·L－1；LO2 細胞的Vmax為（335.61±69.73）pmol·mg protein－1·min－1，Km為（135.68±29.34）μmol·L－1； 結(jié)果顯示HepG2 細胞對索拉非尼的攝取速率明顯高于LO2細胞的攝取速率（見圖4）。

圖3 索拉非尼（5 ～40 μmol·L－1）在HepG2（A）與LO2（B）細胞中的攝取Fig 3 Uptake of sorafenib （5 ～40 μmol·L－ 1）in HepG2（A）and LO2（B）cells

圖4 索拉非尼（10 μmol·L－1）在HepG2（A）與LO2（B）細胞中孵育（5 ～40 min）后的攝取Fig 4 Uptake of sorafenib （10 μmol·L－1）after the incubation（5 ～40 min）in HepG2（A）and LO2（B）

4 討論

索拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的治療HCC 的一線小分子靶向藥物，為多靶點激酶抑制劑，可通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）受體酪氨酸激酶的活性，從而抑制腫瘤血管生成和增殖[5]。目前針對索拉非尼的藥理學作用機制及耐藥機制的研究較多，但對其在腫瘤中的藥物代謝動力學包括針對在肝癌細胞中的攝取動力學研究的報道較少[6]。本研究通過觀察索拉非尼在肝癌細胞及正常肝細胞中的攝取動力學特性，發(fā)現(xiàn)索拉非尼在肝癌細胞（HepG2）中攝取量及攝取速率明顯高于正常肝細胞（LO2）。HepG2 細胞對索拉非尼的攝取速率Vmax顯著高于LO2 細胞。因此索拉非尼對肝癌細胞具有一定的靶向性，這種攝取靶向性有利于提高治療效果并降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

有研究顯示，一些代謝酶如CYP3A5、CYP3A4、CYP2C19、CYP2D6 及藥物轉(zhuǎn)運體如P-糖蛋白、有機陽離子在介導索拉菲尼與其他藥物的體內(nèi)相互作用過程中扮演了重要的角色[7-8]，因此，這些代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運體在肝癌細胞中介導索拉非尼的攝取中可能也起著重要作用，如CYP3A5*3基因型患者中索拉非尼代謝水平極低，可能導致嚴重的肝和腎損害[9]。圍繞這些代謝酶及轉(zhuǎn)運體對索拉非尼的藥物代謝動力學及藥效學影響，需進一步開展相關(guān)的研究。