劉琪琪，王春柳，周潔，宗時宇，劉洋，張紅，李曄（.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 70003；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 72046）

肝臟疾病如病毒性肝炎、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌等在我國的發(fā)病率一直居高不下。據(jù)統(tǒng)計，在中國有超過20%的人群受到肝臟疾病的困擾，尤其是乙肝、丙肝、肝硬化、肝癌、酒精性肝病和藥物性肝損傷等。開展肝靶向給藥系統(tǒng)研究，將藥物定位、聚集于肝臟病變部位一直是臨床和基礎研究的關注點。甘草次酸（GA）為甘草的主要有效成分，大量研究表明，肝細胞膜上有大量與GA 相結(jié)合的位點，是天然的肝靶向遞藥系統(tǒng)的修飾分子[1-2]。

脂質(zhì)-聚合物雜化納米粒（LPHNPs）是一類基于脂質(zhì)體和聚合物納米粒發(fā)展的新型載藥系統(tǒng)，在靶向給藥方面優(yōu)勢獨特[3-6]，其核殼結(jié)構(gòu)兼具聚合物納米粒的剛性與磷脂結(jié)構(gòu)的柔性，且易于修飾，具有廣泛的應用前景。芍藥苷（Pae）是中藥芍藥的主要有效成分，已有研究表明，芍藥苷在脂肪肝、肝纖維化、肝腫瘤中均有顯著療效[7-9]。

本文制備了一種載芍藥苷的甘草次酸介導的脂質(zhì)-聚合物雜化肝靶向給藥系統(tǒng)（GA-LPHNPs-Pae），并對其進行體外理化性質(zhì)表征和基于體外細胞模型的初步靶向性驗證，可為新型中藥肝靶向藥物開發(fā)奠定基礎。

1 儀器與試藥

超聲波細胞粉碎機（MD-1000D，南京舜瑪儀器設備有限公司）；激光粒度分析儀（ZEN3600，馬爾文儀器）；數(shù)顯多頭磁力恒溫攪拌器（HJ-6B，金壇市城東盛聯(lián)實驗儀器廠）；精密電子天平（BT125D）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA）（上海亞榮生化儀器廠）；光學顯微鏡（CKX31，日本奧林巴斯）；二氧化碳培養(yǎng)箱（3111，Thermo 公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS MP5，LEICA）；傅里葉變換紅外光譜儀（Tensor27，Bruker 公司）。

芍藥苷對照品（批號：110736-201943，純度：95.7%，成都克洛瑪生物科技有限公司），PEG-PLGA、GA-DSPE-PEG、大豆卵磷脂（西安瑞希生物科技有限公司），聚乙烯醇（PVA，Mn ＝13 000 ～23 000， 美國Sigma Aldrich 公司），葡聚糖凝膠G-50（長征制藥廠），HepG2細胞（中國科學院細胞庫），DMEM 培養(yǎng)基（批號：ME100202P1）、 胎牛血清（批號：10099-141）、胰酶消化液（批號：25200-056）、青鏈霉素雙抗混合液（批號：15140）（GIBCO），DAPI（1∶2000，上海碧云天生物技術研究所），F(xiàn)ITC（95%，美倫生物），甲醇（賽默飛世爾科技中國有限公司），無水乙醇、乙酸乙酯及其他試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 GA-LPHNPs-Pae 制備

以大豆卵磷脂、GA-DSPE-PEG、膽固醇作為殼層材料，以PEG-PLGA 為核層材料，采用兩步法制備GA-LPHNPs-Pae，其中內(nèi)核層采用復乳法制備。

精密稱取PEG-PLGA 聚合物適量置于西林瓶中，加入乙酸乙酯5 mL 溶解。稱取適量芍藥苷，加水配至質(zhì)量濃度為500 mg·mL－1，移液器移取0.5 mL 超聲分散于有機相中，采用細胞破碎儀300 W 功率超聲乳化3 min，形成油包水（W/O）型初乳，在1500 r·min－1磁力攪拌下將初乳緩慢滴加到1% PVA 分散液中，冰浴下繼續(xù)采用細胞破碎儀乳化2 min，在1000 r·min－1磁力攪拌6 h 以除去有機溶劑，即得NPs-Pae 分散液。

取一定量蛋黃卵磷脂、GA-DSPE-PEG、膽固醇以適量乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，40℃減壓去除溶劑至內(nèi)壁形成均勻脂質(zhì)膜，采用10 mL NPs-Pae 分散液在60℃水化30 min，取出采用細胞破碎儀100 W 功率超聲3 min，即得GALPHNPs-Pae 粗分散液。

2.2 GA-LPHNPs-Pae 粒徑分布與電位分析

分別取NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae 溶液適量，經(jīng)蒸餾水稀釋10 倍后進行Zeta 電位測定，稀釋100 倍后測定粒徑分布，結(jié)果見圖1。

圖1 粒徑與分布Fig 1 Particle size and distribution

NPs-Pae 的粒徑、分散指數(shù)和Zeta 電位分別為（90.27±1.99）nm、（0.115±0.001）、（－6.78±1.70）mV，表明納米粒的粒徑大小均一、整個體系比較穩(wěn)定。

GA-LPHNPs-Pae 的粒徑、分散指數(shù)和Zeta電位分別為（96.98±0.39）nm、（0.104±0.005）、（－13.10±0.26）mV，表明經(jīng)過修飾后的納米粒粒徑稍有增大，分布較窄，電位絕對值有增加，整個體系更加穩(wěn)定。

2.3 GA-LPHNPs-Pae 紅外分析[4，10]

采用KBr 壓片法，將 NPs-Pae、GA-LPHNPs-Pae 和GA-DSPE-PEG 粉末樣品分別與溴化鉀1∶100 混合研磨至均勻，壓成透明的薄片，在400 ～4000 cm－1內(nèi)記錄樣品骨架紅外振動吸收峰，測試分辨率為 4 cm－1，結(jié)果見圖2。

由圖2 可知，與NPs-Pae 相比，GA-DSPE-PEG和GA-LPHNPs-Pae 在1250 cm－1處有一銳利小峰，為羧基中的羥基峰峰位，雖然3 個樣本中均有羥基存在，但PEG 中的羥基為聚合狀態(tài)，而GA 中羥基屬為游離態(tài)；另外，在指紋區(qū)690 cm－1峰位處，GADSPE-PEG 和GA-LPHNPs-Pae 較NPs-Pae 多出一個銳利小峰，可能為GA 結(jié)構(gòu)中C 環(huán)和D 環(huán)共有13號碳的三取代的特征峰位，上述兩處峰位對比說明GA-LPHNPS-Pae 表面修飾了具有游離羥基的GA。

圖2 紅外分析圖Fig 2 IR analysis diagram

2.4 GA-LPHNPs-Pae 包封率測定

由于LPHNPs 外層殼層屬于柔性結(jié)構(gòu)，不適合采用高速離心法、超濾法等強烈機械力涉及的方法，因此，本項目中采用葡聚糖凝膠柱法[11]進行包封率測定。

2.4.1 芍藥苷HPLC 測定條件

① 色譜條件：C18色譜柱，以乙腈-0.1% 磷酸溶液（14∶86）為流動相，檢測波長為230 mm，進樣量10 μL，柱溫為30℃。

② 線性關系考察：取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL 含60 μg 的溶液，作為母液。精密吸取適量芍藥苷母液配制成質(zhì)量濃度為4.12、6.18、8.24、12.36、16.48、20.6 μg·mL－1的系列標準工作液，進樣分析，以峰面積對進樣量回歸分析作圖，得到芍藥苷標準曲線為Y＝1.024×104X＋368.3，r＝0.9997，表明進樣量在0.0206 ～0.206 μg 與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

③ 洗脫液測定樣品處理方法：收集包封率樣品于玻璃試管中，加入3 倍量二氯甲烷，渦旋混合1 min，待分層徹底后，分離下層水層，再加入3 倍量二氯甲烷，同法萃取后，棄去二氯甲烷層，水層采用0.22 μm 針孔濾器濾過，續(xù)濾液進行含量測定分析。

2.4.2 葡聚糖凝膠柱洗脫曲線建立 稱取適量葡聚糖G-50 作為固定相，溶脹好之后濕法填入10 mL 一次性注射器，洗脫約10 個柱體積后，移液器吸取上樣液0.5 mL，輕輕上樣至凝膠柱頂部，以純化水洗脫，1.5 mL EP 管依次接取洗脫液，每0.5 mL 一管，采用“2.4.1”項下色譜條件測定樣本濃度，以樣品管編號為橫坐標，以芍藥苷濃度為縱坐標作圖，分別繪制Pae 游離藥物及GA-LPHNPS-Pae 洗脫曲線，見圖3。納米粒子在7 ～14 管被首先洗出，游離藥物在17 ～31 管洗出，粒子和游離藥物基本達到分離。

圖3 GA-LPHNPs-Pae 葡聚糖凝膠柱分離洗脫曲線Fig 3 Elution curve of gel column separation of GA-LPHNPs-Pae

2.4.3 包封率測定

① 總藥物量：取0.5 mLGA-LPHNPs-Pae 分散液，稀釋至線性范圍內(nèi)，進樣測定，通過Pae標準曲線計算其中所含有的Pae 藥物質(zhì)量作為總藥量WT。

② 包封藥量：收集GA-LPHNPs-Pae 分散液，上樣洗脫第7 ～14 管樣本測定，通過Pae 標準曲線計算其中所含有的Pae 藥物質(zhì)量作為包封藥量，記為WE。

③ 包封率測定樣品制備：收集包封率樣品于玻璃試管中，加入3 倍量二氯甲烷，渦旋混合1 min，待分層徹底后，分離下層水層，再加入3倍量二氯甲烷，同法萃取后，棄去二氯甲烷層，水層采用0.22 μm 針孔濾器濾過，續(xù)濾液進行含量測定分析，根據(jù)以下公式計算包封率：

包封率＝We/Wt×100%[注：We為包封的藥物的質(zhì)量（mg），Wt為體系中藥物總質(zhì)量]。

測定3 批GA-LPHNPs-Pae 包封率結(jié)果分別為41.6%、52.3%、48.6%，平均包封率為（47.5±5.4）%。

2.5 GA-LPHNPs-Pae 釋放度測定

取各組聚合物納米粒1 mL，加入到3kD透析袋中，置于40 mL pH 7.4 PBS，再置于（37±0.5）℃恒溫震蕩搖床中，分別于0、2、4、8、12、24、36、48、72 h 取樣2 mL，同時補給等體積的釋放介質(zhì)。使用HPLC 法測定樣品溶液中芍藥苷的含量，計算釋放度，并繪制累積釋放曲線，見圖4。

圖4 GA-LPHNPs-Pae 體外釋放度Fig 4 In vitro drug release of Pae in GA-LPHNPs

由圖4 可知，在24 h 內(nèi)GA-LPHNPs-Pae 中芍藥苷釋放呈現(xiàn)先快后慢趨勢，在前2 h 內(nèi)，GALPHNPs-Pae 可釋放出約50%藥量，在2 ～12 h內(nèi)釋放速度顯著下降，曲線平緩，12 h 后釋放曲線基本平衡，但絕對藥量并未達到100%釋放。基于LPHNPs 的核-殼結(jié)構(gòu)推測，在前2 h 快速釋放的，可能在初期釋放的是外脂質(zhì)層包封的藥物，內(nèi)核聚合物材料中藥物則釋放較緩慢。

2.6 GA-LPHNPs-Pae 體外靶向性評價[12]

2.6.1 孵化時間的考察 以FITC 為熒光探針，與芍藥苷一起載入NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae中，制備帶熒光的納米粒樣品，葡聚糖凝膠柱純化后冷凍干燥，用HBSS 充分溶解至藥物當量為50 μg·mL－1。

HepG2 細胞以1×105個·cm－2密度接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 ～48 h。細胞用HBSS 溶液預先孵育15 min后，每孔加入0.5 mL，放入培養(yǎng)箱中分別孵育1、2、4 h，考察孵化時間對結(jié)果影響。孵育結(jié)束后，吸棄納米粒溶液，PBS 沖洗3 次，取出玻片放入4%多聚甲醛中，于室溫固定20 min，PBS 漂洗3次，DAPI 染色10 min，以磷酸甘油封片，以不加納米粒的細胞為空白對照，激光共聚焦觀察。結(jié)果如圖5（其中藍色為細胞核顏色，綠色為FITC熒光顏色）。GA-LPHNPs-Pae 可被HepG2 細胞攝取，且胞內(nèi)熒光強度2 h 較1 h 明顯增強，4 h 與2 h 相比略弱。因此，確定孵化時間為2 h。

圖5 兩種納米粒孵育HepG2 細胞不同時間的攝入情況Fig 5 Uptake of two nanoparticles incubating HepG2 cells at different times

2.6.2 細胞攝取納米粒的定性觀察 取50 μg·mL－1的NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae 分 散液，按照“2.6.1”項下方法孵化2 h 后進行細胞攝取定性考察，結(jié)果如圖6 所示。在2 h 時間點GA-LPHNPs-Pae 組熒光強度明顯大于NPs-Pae，表明GA-LPHNPs-Pae 較未修飾的NPs-Pae 更易于被肝細胞攝取，從體外細胞模型中驗證了GALPHNPs-Pae 的肝靶向性。

圖6 兩種納米粒孵育2 h HepG2 細胞攝取定性Fig 6 Uptake characterization of two nanoparticles incubating HepG2 cells for 2 h

3 討論

在GA-LPHNPs-Pae 處方優(yōu)化時候發(fā)現(xiàn)，水溶性藥物在GA-LPHNPs 遞藥系統(tǒng)中載藥有限，整體包封率效率未達到80%，原因可能是因為Pae 水溶性很強，與有機聚合物材料親和性不強導致[13-14]。對納米粒乳化體系篩選、工藝優(yōu)化反復摸索，最終確定本研究中所用的聚合物材料乳化體系，所得到最優(yōu)包封率在50%。通過本項目的實施發(fā)現(xiàn)，聚合物納米粒構(gòu)建過程中，不同藥物在不同乳化體系、不同聚合物材料中的物理化學相容性對于處方優(yōu)化非常重要，因此針對此方向開展的工作具有很好的應用價值。

對于GA-LPHNPs-Pae 中藥物包封率的測定也是一個值得探索的問題。通常納米材料包封率測定方法有葡聚糖凝膠柱法、超濾離心法、高速離心法[15-16]。對于聚合物納米?？蛇x用超濾離心法或高速離心法，而脂質(zhì)體由于其結(jié)構(gòu)柔軟性則多采用葡聚糖凝膠柱法，脂質(zhì)聚合物雜化納米粒集合了聚合物納米粒的硬度和脂質(zhì)體的柔軟性，在實驗中綜合考慮采用了葡聚糖凝膠柱法，以防止破壞殼-核結(jié)構(gòu)[17-19]。

本文制備了GA-LPHNPs-Pae，并對其藥劑學性質(zhì)進行了初步理化評價，在體外采用細胞模型進行了初步靶向性評價，本課題研究的脂質(zhì)聚合物雜化納米粒是一個復雜體系，分為內(nèi)外兩部分：內(nèi)核的載藥PEG-PLGA 聚合物納米粒是經(jīng)復乳法制得，殼層經(jīng)水化法包被帶GA 修飾的磷脂（GADSPE-PEG）[20]，目前暫未對GA 的表面修飾進行詳細的研究，但課題組認為通過后續(xù)的細胞靶向攝取結(jié)果也可以間接證實GA 的表面修飾，并且會進一步有效證明靶向修飾[21]。在今后的研究中，本課題組將繼續(xù)對GA-LPHNPs-Pae 的體內(nèi)靶向性進行驗證，為新型肝靶向藥物開發(fā)奠定基礎。