李穗敏，秦曉玥，曾 鵬，陳淑貞，鄺素娟，楊 慧，饒 芳，鄧春玉，3

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006，2.廣東省人民醫(yī)院、廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究部臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；3.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

高血壓是一種以體循環(huán)血壓升高為特征的慢性疾病，可導(dǎo)致心、腦、腎等器官發(fā)生器質(zhì)性病變，誘發(fā)冠心病、腦卒中、慢性腎衰竭等疾病，是全球心血管疾病的主要誘因，也是死亡的主要原因[1]。對(duì)2012-2015年間中國(guó)高血壓狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)成年人患病率高達(dá)27.9%，且呈逐年上升的趨勢(shì)，僅2017年內(nèi)就有約243萬(wàn)人死于因高收縮壓引起的心血管疾病[2]。

血管可分為內(nèi)膜、中膜以及外膜三層結(jié)構(gòu)，血管的病理性改變主要涉及內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞受損，中膜的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，外膜纖維化，而VSMCs表型改變時(shí)產(chǎn)生的收縮蛋白斷裂、表達(dá)減少以及細(xì)胞外基質(zhì)的改變是導(dǎo)致血管重構(gòu)以及收縮功能障礙的主要原因之一[3]。既往研究表明，主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的收縮反應(yīng)主要由L型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC/Cav1.2)介導(dǎo)，而從自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)分離的冠脈平滑肌細(xì)胞中，Cav1.2表達(dá)低于Wistar大鼠[4]。在生理?xiàng)l件下，VSMCs為高度分化的收縮表型并大量表達(dá)可執(zhí)行收縮功能的收縮蛋白，包括α-肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain，SM-MHC)，而當(dāng)受到不良因素刺激則會(huì)轉(zhuǎn)化為分化程度較低的合成表型，其合成與分泌功能增強(qiáng)，能大量合成骨橋蛋白(osteopntin，OPN)、膠原蛋白(collagen)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等并分泌至胞外，參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular Matrix，ECM)重塑[5-6]。機(jī)械敏感性離子通道Piezo1是一種38次跨膜的非選擇性陽(yáng)離子通道，但對(duì)鈣離子具有輕微選擇性，可被剪切力、牽張力、靜水壓力等多種機(jī)械力激活，并將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生化信號(hào)，參與細(xì)胞的分化、增殖、遷移等生物過(guò)程[7]。現(xiàn)有研究表明[8]，Piezo1可促進(jìn)高血壓小鼠尾動(dòng)脈的重構(gòu)；從特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者中分離的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖及收縮能力增加與Piezo1的表達(dá)量及活性上升有關(guān)[9]。盡管近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Piezo1與多種血管病變相關(guān)，但Piezo1在高壓負(fù)荷下誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(coronary arterial smooth muscle cells，CASMCs)表型改變的作用尚不清楚。因此，本研究通過(guò)高靜水壓誘導(dǎo)原代Wistar大鼠CASMCs為模型，以Piezo1為切入點(diǎn)，探究Piezo1是否與高壓負(fù)荷下CASMCs 由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化相關(guān)，擬為高血壓相關(guān)的冠心病提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)，雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量為(220～250) g，共10只，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(粵)2016-0041。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查(No CDREC201208A)。

1.2 主要試劑與儀器XTL250型體視顯微鏡(上海光密儀器有限公司)；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(北京市六一儀器廠)；Leica SP5-FCS激光共聚焦顯微鏡(德國(guó))；DMEM 培養(yǎng)基(C11885500BT)、澳洲胎牛血清(FBS)、0.25% EDTA-胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素(Gibco)；抗Piezo1(APC-087)抗體、抗Cav1.2(ACC-003)抗體(Alomone)；抗 α-肌動(dòng)蛋白抗體、抗I型膠原蛋白α1鏈抗體(abcam)；抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2抗體(Millipore);抗骨橋蛋白抗體(Bioworld Technology)；抗平滑肌肌球蛋白重鏈抗體、抗GAPDH(60004-1-Ig)抗體(Proteintech)；Yoda1(HY-18723)、GsMTx4(HY-P1410A)(MedChemExpress)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；Piezo1小干擾RNA(siRNA-Piezo1；銳博生物)；磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS；武漢博士德公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 原代大鼠冠脈平滑肌細(xì)胞(CASMCs)的獲取及培養(yǎng)冠狀動(dòng)脈分離方法參照已發(fā)表的文獻(xiàn)處理[10]。Wistar大鼠吸入CO2麻醉后脫臼處死，皮膚經(jīng)75%乙醇棉球消毒后迅速打開(kāi)胸腔，取出心臟，放入經(jīng)4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶液(含1%雙抗)中，于超凈臺(tái)內(nèi)，體視顯微鏡下分離出大鼠心臟的左前降支、右冠脈及間隔支，小心去除冠脈周圍的心肌組織，將冠脈剪碎成長(zhǎng)度為0.5 mm左右的小段，滴2滴20% FBS的DMEM培養(yǎng)基(含1%雙抗)，用無(wú)菌巴氏管混合均勻并均勻平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)面朝上，加入5 mL的20% FBS的DMEM培養(yǎng)基(含1%雙抗)，于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中靜置約1.5 h，待組織塊貼牢后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)面朝下，培養(yǎng)基浸沒(méi)過(guò)所有組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔4 d換液，待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并生長(zhǎng)至融合成片達(dá)80%后，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，P2-P4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CASMCs的干預(yù)及分組

2.2.1壓力模型的構(gòu)建 待CASMCs密度生長(zhǎng)至約60%時(shí)，將細(xì)胞放置于自行研制的高壓裝置中(專利號(hào)201420109263. 1，中國(guó))，該裝置內(nèi)部可穩(wěn)定維持一定壓力。根據(jù)正常成年雄性大鼠的收縮壓約為100～120 mmHg，高血壓大鼠收縮壓約為180～200 mmHg，以0 mmHg為對(duì)照，分別在0、120、180 mmHg壓力下干預(yù)CASMCs 24 h。

2.2.2Piezo1參與CASMCs的表型改變 ① Yoda1干預(yù)，使用Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1在0 mmHg下濃度梯度干預(yù)CASMCs 48 h，實(shí)驗(yàn)分組依次為：對(duì)照組(Control)，DMSO組，Yoda1組(終濃度分別為：1、3、10 μmol·L-1)；②GsMTx4干預(yù)，使用不同濃度Piezo1抑制劑GsMTx4預(yù)處理CASMCs 2 h，再于180 mmHg下繼續(xù)干預(yù)24 h，實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組(Control)，GsMTx4組(終濃度分別為：0.3、1、3 μmol·L-1)。

2.2.3原代CASMCs的siRNA轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine 3000 試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別設(shè)置對(duì)照組(Control)、陰性對(duì)照組(NC)和siPiezo1組，于125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中加入100 μmol的siRNA，再加入等體積的含5 μL Lipofectamine 3000的Opti-MEM培養(yǎng)基，混合均勻，靜置15～20 min，加入CASMCs中轉(zhuǎn)染24 h后，于180 mmHg壓力下繼續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。

2.3 CASMCs細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的檢測(cè)將CASMCs種于激光共聚焦皿中，按“2.2.3”的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，在避光條件下加入3 μmol·L-1的Fluo-4AM熒光探針，37 ℃孵育30 min，用PBS洗3次，每皿加入1 mL的2 mmol·L-1含鈣臺(tái)式液，激光共聚焦顯微鏡下掃描6 min，于1 min時(shí)加入終濃度為10 μmol·L-1的Yoda1，記錄空白背景熒光值F0、細(xì)胞基礎(chǔ)熒光值F1以及峰值F2，計(jì)算方式以(F2-F1)/(F1-F0)表示。

2.4 Western blot處理后的細(xì)胞用PBS洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA于冰上裂解30 min，刮下細(xì)胞并收集裂解液，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液為總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液(4× loading buffer)和RIPA，使每組蛋白為等體積等質(zhì)量上樣，變性后依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉、一抗4 ℃孵育過(guò)夜、二抗室溫孵育1 h，采用ECL法于化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)顯影條帶，最后通過(guò)ImageJ軟件計(jì)算條帶灰度值及與內(nèi)參GAPDH的灰度比值。

3 結(jié)果

3.1 高靜水壓負(fù)荷促進(jìn)CASMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化將CASMCs分別置于0、120、180 mmHg條件下培養(yǎng)24 h，Western blot檢測(cè)不同壓力干預(yù)后對(duì)CASMCs收縮表型標(biāo)志物Cav1.2、SM-MHC、α-SMA以及合成表型標(biāo)志物OPN、MMP-2、Col1a1的表達(dá)變化。結(jié)果如Fig 1所示：與0 mmHg組相比，Cav1.2、SM-MHC以及α-SMA的蛋白表達(dá)水平均隨壓力增大而梯度降低，并在180 mmHg壓力下達(dá)到最大差異(P<0.01)，相反，MMP-2、Col1a1和OPN的表達(dá)水平則隨壓力增大而梯度升高，在180 mmHg壓力下達(dá)到最高水平(P<0.05)。以上結(jié)果提示，高靜水壓可以促進(jìn)CASMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化。

3.2 高靜水壓誘導(dǎo)CASMCs中Piezo1的表達(dá)水平升高及其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流增強(qiáng)結(jié)果如Fig 2所示：與0 mmHg組相比，Piezo1的表達(dá)水平在120和180 mmHg組均有所升高，且與壓力大小呈正相關(guān)，并在180 mmHg組達(dá)到最大值(P<0.05)。激光共聚焦測(cè)鈣結(jié)果顯示，加入Yoda1激活Piezo1后，180 mmHg-NC組的熒光升高比值高于0 mmHg-NC組(P<0.01)，但使用siRNA敲低Piezo1后，細(xì)胞熒光上升比值明顯低于180 mmHg-NC組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明，高靜水壓可誘導(dǎo)Piezo1的表達(dá)水平以及其通道活性升高。

3.3 Yoda1特異性激活Piezo1促進(jìn)CASMCs向合成表型轉(zhuǎn)化為了進(jìn)一步探究Piezo1與CASMCs表型改變的關(guān)系，在0 mmHg非高壓狀態(tài)下，使用不同濃度的Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1干預(yù)CAMSCs，結(jié)果如Fig 3所示：與DMSO組相比，收縮表型標(biāo)志物SM-MHC、α-SMA的表達(dá)水平隨Yoda1的濃度升高而降低，在10 μmol·L-1組達(dá)到最小值(P<0.01)，Cav1.2也在10 μmol·L-1組下降至最低(P<0.05)，而合成表型標(biāo)志物MMP-2、Col1a1表達(dá)水平隨Yoda1的濃度升高而升高，并在10 μmol·L-1組達(dá)到最高值(P<0.05)，OPN表達(dá)水平也達(dá)最大值(P<0.01)。以上結(jié)果提示，激活Piezo1可誘導(dǎo)CASMCs由收縮表型向合成表型改變。

Fig 1 Effect of high hydrostatic pressure on expression of contractile phenotype and synthetic phenotype-related

3.4 GsMTx4抑制Piezo1可減輕高靜水壓誘導(dǎo)的CASMCs表型改變?cè)?80 mmHg高壓條件下，使用Piezo1抑制劑GsMTx4濃度梯度干預(yù)CASMCs 24 h，結(jié)果如Fig 4所示：與對(duì)照組相比，收縮表型標(biāo)志物SM-MHC和α-SMA的表達(dá)水平隨GsMTx4的濃度升高而升高，在3 μmol·L-1組達(dá)到最大值(P<0.01)，Cav1.2也在3 μmol·L-1組上升至最高(P<0.05)，而合成表型標(biāo)志物OPN、Col1a1的表達(dá)水平隨GsMTx4的濃度升高而下降，并在3 μmol·L-1組達(dá)到最低值(P<0.01)，此時(shí)MMP-2表達(dá)水平也最低(P<0.05)。以上結(jié)果表明，抑制Piezo1的活性可減緩高靜水壓所致的CASMCs表型改變。

Fig 2 Effect of high hydrostatic pressure on expression of Piezo1 and calcium influx mediated by Piezo1 in CASMCs

Fig 4 Effect of GsMTx4 on expression of contractile phenotype and synthetic phenotype-related proteins in CASMCs under high

3.5 敲低Piezo1可減輕高靜水壓誘導(dǎo)的CASMCs表型改變結(jié)果如Fig 5所示：與陰性對(duì)照組相比，敲低Piezo1后，收縮表型標(biāo)志物SM-MHC和α-SMA表達(dá)水平升高(P<0.05)，而合成表型標(biāo)志物OPN和MMP-2有所降低(P<0.05)。與使用抑制劑GsMTx4干預(yù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，敲低Piezo1可以減少高靜水壓誘導(dǎo)的CASMCs表型改變。

Fig 5 Expression of contractile phenotype and synthetic phenotype-related proteins in CASMCs after knockdown Piezo1 under high

4 討論

以上研究結(jié)果表明，高壓負(fù)荷可上調(diào)并激活CASMCs的Piezo1，并下調(diào)收縮表型相關(guān)蛋白Cav1.2、SM-MHC、α-SMA，同時(shí)上調(diào)合成表型相關(guān)蛋白OPN、MMP-2、Col1a1，表明高壓負(fù)荷下CASMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，給予Piezo1激動(dòng)劑Yoda1干預(yù)CASMCs 48 h后，收縮表型相關(guān)蛋白表達(dá)下降而合成表型相關(guān)蛋白表達(dá)升高，結(jié)果與高壓干預(yù)的細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。為進(jìn)一步證實(shí)Piezo1與高壓負(fù)荷CASMCs表型改變之間的關(guān)系，在180 mmHg高壓培養(yǎng)條件下，分別使用Piezo1抑制劑GsMTx4和siRNA-Piezo1干預(yù)CASMCs后，收縮表型相關(guān)蛋白表達(dá)上升，合成表型相關(guān)蛋白表達(dá)有所下調(diào)，表明抑制或者敲低Piezo1可緩解高壓負(fù)荷導(dǎo)致的CASMCs表型改變，提示高靜水壓可通過(guò)激活Piezo1導(dǎo)致CASMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變。

高血壓是誘發(fā)冠狀動(dòng)脈疾病的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，流行病學(xué)調(diào)查顯示，收縮壓每增加20 mmHg或舒張壓每增加10 mmHg，發(fā)生致命冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)增加1倍[11]。另有研究證明，從SHR大鼠分離的冠狀動(dòng)脈對(duì)高濃度的血管收縮劑5-羥色胺(5-HT)以及血栓素類似物U46619的收縮反應(yīng)均低于Wistar大鼠[4]，提示高血壓會(huì)導(dǎo)致冠脈功能障礙，但其具體分子機(jī)制仍未清楚。

血管主要受到剪切力、牽張力以及靜水壓力這3種機(jī)械力刺激，而血流剪切力主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞感知，平滑肌細(xì)胞則更多的受血管收縮及舒張產(chǎn)生的牽張力和管腔內(nèi)血流對(duì)血管壁產(chǎn)生的靜水壓力影響，而這些外界的機(jī)械信號(hào)需要通過(guò)細(xì)胞膜上的某些特定機(jī)械敏感通道(包括Piezo1、瞬時(shí)受體電位transient receptor potential，TRP通道)和細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)才能影響細(xì)胞的狀態(tài)和功能[12]，但是，有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于平滑肌特異性敲除Piezo1的小鼠小動(dòng)脈則完全失去機(jī)械激活的離子通道活性，而且，只要持續(xù)激活Piezo1也可以使血壓正常的小鼠發(fā)生血管重塑[8]。因此，我們認(rèn)為，Piezo1在高血壓導(dǎo)致的冠脈重構(gòu)中起關(guān)鍵作用。然而，血管重塑的主要原因之一是VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，VSMCs分泌物如OPN、MMPs、膠原合成增多并分泌至胞外，參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑[5，13]。研究證實(shí)，自發(fā)性高血壓大鼠和由血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓小鼠的主動(dòng)脈組織以及血漿的OPN和MMP-2水平升高[14]，與WKY相比，SHR來(lái)源的主動(dòng)脈VSMCs的OPN表達(dá)水平升高，而α-SMA表達(dá)降低[15]。因此，我們采用壓力裝置給CASMCs施加不同的靜水壓力以模擬高血壓大鼠的血壓，通過(guò)壓力干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，Piezo1表達(dá)上升，合成表型標(biāo)志物OPN等表達(dá)增加，而收縮表型標(biāo)志物α-SMA等表達(dá)減少。由于Piezo1對(duì)鈣離子具有一定的選擇性，且其介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流強(qiáng)度與施加的剪切力大小或其激動(dòng)劑Yoda1的濃度呈正相關(guān)[16]，為了驗(yàn)證高壓干預(yù)CASMCs后，Piezo1不僅表達(dá)水平升高，而且其功能也有所提高，我們利用Fluo-4熒光法檢測(cè)了180 mmHg高壓干預(yù)后CASMCs對(duì)10 μmol·L-1Yoda1刺激下引起的鈣離子內(nèi)流程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高壓干預(yù)后的CASMCs對(duì)Yoda1引起的鈣離子內(nèi)流明顯高于常壓組。且隨Piezo1的敲低而減弱，證明高靜水壓可激活Piezo1。為進(jìn)一步證實(shí)Piezo1與CASMCs表型改變的相關(guān)性，我們使用Yoda1在0 mmHg常壓下持續(xù)性激活Piezo1，已有研究表明，Yoda1激活Piezo1可通過(guò)激活MT1-MMP-2信號(hào)通路促進(jìn)血管生成[17]，而本研究發(fā)現(xiàn)，Yoda1干預(yù)CASMCs后，MMP-2等合成表型標(biāo)志物表達(dá)升高，而收縮表型標(biāo)志物表達(dá)減少，且具有濃度依賴性，提示在沒(méi)有高壓情況下，激活Piezo1也可促進(jìn)CASMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，結(jié)果與高壓干預(yù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，而這種改變可被Piezo1抑制劑GsMTx4或敲低Piezo1所逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明高靜水壓可通過(guò)激活Piezo1，進(jìn)而促進(jìn)CASMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，但Piezo1調(diào)控CASMCs表型的具體機(jī)制仍有待研究。

綜上所述，本研究已初步證實(shí)高靜水壓通過(guò)上調(diào)并激活Piezo1促進(jìn)CASMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，為治療和預(yù)防高血壓所致的冠心病提供新的理論依據(jù)。