徐飛飛，崔 愷，王立有，管雅琪，劉 銘，李欽青，田雅娟，楚世峰，賀文彬

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)腦病學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030619；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)水平的不斷發(fā)展，國(guó)民生活方式的改變以及高壓的生活節(jié)奏，在對(duì)近30年(1990—2017年)來影響中國(guó)人疾病負(fù)擔(dān)以及風(fēng)險(xiǎn)因素的大型分析中，腦卒中死亡率逐年升高，成為國(guó)民死亡的第一病因，嚴(yán)重威脅國(guó)民健康水平[1]。腦卒中(cerebral stroke)，又稱中風(fēng)，包括出血性卒中和缺血性卒中，臨床稱之為腦出血和腦梗死。其中缺血性腦卒中占腦卒中比例約為85%。缺血性腦卒中病因復(fù)雜、誘因多，溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療是目前臨床常用的兩類治療方法，但均無明顯療效。此外，溶栓治療后會(huì)誘導(dǎo)腦缺血部位繼發(fā)性損傷，使腦損傷更為嚴(yán)重[2]。

缺血性腦卒中是由于血管堵塞促使血流供應(yīng)不足誘導(dǎo)的腦血管性疾病，因此中醫(yī)臨床常用活血藥和開竅藥作為主要治療藥物。其中，已有研究表明，開竅藥石菖蒲揮發(fā)油中的活性物質(zhì)α-和β-細(xì)辛醚在改善缺血性腦卒中誘導(dǎo)的腦損傷中發(fā)揮了明顯作用[3-4]。石菖蒲(AcorustatarrinowiiSchott)來源于多年生草本植物石菖蒲的干燥根莖，其性辛，味苦，溫，歸胃、心經(jīng)，具有化濕開胃、豁痰鎮(zhèn)咳、醒神益智等功效。石菖蒲化學(xué)成分多樣，包括揮發(fā)油、有機(jī)酸、萜類、黃酮以及氨基酸等成分。雖然揮發(fā)油僅占石菖蒲化學(xué)成分的0.7%～1.3%，但它是石菖蒲發(fā)揮藥理作用的有效成分。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲揮發(fā)油中β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有重要藥理活性，尤其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚憑借其揮發(fā)油特性，能快速通過血腦屏障發(fā)揮作用。β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚互為同分異構(gòu)體，藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚在機(jī)體內(nèi)約22%可轉(zhuǎn)變?yōu)棣?細(xì)辛醚(順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉词浇Y(jié)構(gòu))，使得β-細(xì)辛醚的藥理作用變得不明確。已有研究表明，α-細(xì)辛醚具有保護(hù)心腦血管細(xì)胞、抑制血小板聚集、降血脂等多種藥理活性及特點(diǎn)，這在防治腦血管疾病中具有重要意義[5-6]。

炎性反應(yīng)作為缺血性腦卒中級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要部分，在整個(gè)腦損傷過程中起到關(guān)鍵作用。炎性因子的過度釋放能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集，上調(diào)黏附因子阻塞微血管造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大量氧自由基釋放，從而引起氧化應(yīng)激。在炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激的雙重作用下，血腦屏障破壞，腦組織含水量增多，加重腦損傷[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，在腦損傷后迅速激活，釋放炎性因子進(jìn)行組織修復(fù)；但過度激活后炎性因子釋放過量，導(dǎo)致炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的不斷發(fā)生。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后能夠向M1型與M2型極化，過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞其M1型極化率不斷增加，促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型和M2型極化率能夠明顯降低腦缺血/再灌注造成的損傷。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)是由免疫細(xì)胞分泌的一類炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，其中IL-1β和IL-18是M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的分泌性標(biāo)記物，NOD樣受體家族3(NOD-like receptors 3，NLRP3)炎性小體作為這兩種促炎因子重要的上游蛋白，調(diào)控其成熟與釋放。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路作為IL-1β和IL-18雙向調(diào)節(jié)通路之一，其磷酸化能夠也能夠調(diào)節(jié)NLRP3的活化。已有研究證實(shí)，α-細(xì)辛醚能夠抑制鈣超載及其誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性，還能夠阻斷NF-κB激酶的降解途徑抑制NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，降低了促炎介質(zhì)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β的產(chǎn)生[8-9]。本研究主要以氧糖剝奪/再灌注(oxygen and glucose deprivation/referfusion，OGD/R)建立腦缺血/再灌注損傷模型，通過測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞極型轉(zhuǎn)化及相關(guān)炎性蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)α-細(xì)辛醚對(duì)腦缺血/再灌注損傷的小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(BV2)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。α-細(xì)辛醚(MXUO-AAQ4)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；連二亞硫酸鈉(分析純)，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(8020251)、胎牛血清(10099141)，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；無糖Earle’s平衡鹽液(G20609)，上海源培生物科技股份有限公司；10×電轉(zhuǎn)液(D1060)、20× TBST緩沖液(T1082)、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(T1070)，北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶(15H25C15)、蛋白酶抑制劑PMSF(15H14B78)、磷酸酶抑制劑混合物(14L09A83)、增強(qiáng)型RIPA裂解液(15I11B02)、羊抗兔IgG(BA1052)武漢博士德生物工程有限公司；p-NF-κB(SAB4301496)、NF-κB(SAB4502615)抗體，Sigma-Aldrich公司；TNF-α(183218)、TGF-β1/2(ab124894)、NLRP3(ab263899)、caspase 1(ab207802)、β-actin(ab8226)抗體，英國(guó)Abcam公司。SDS-PAGE凝膠試劑盒(15L15B38)、CCK-8試劑盒(15I28C60)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(15F08A46)、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物(15I08A97)，武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β(MU30369)、IL-18(MU30380)、IL-10(MU30055)、IL-4(MU30385)ELISA試劑盒，武漢貝茵萊生物科技有限公司；ROS試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。VERSA max酶標(biāo)儀(BNRO5709)，上海美谷分子儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)(Heraeus Multifuge X1R)，賽默飛世爾科技公司；全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ChampChemi Professional)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；電泳儀(DYY-6D)，北京六一生物科技有限公司；電轉(zhuǎn)儀(TE77XP)，豪沃生物科技(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BV2細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)條件下(37 ℃、5 % CO2、飽和濕度、無菌條件)傳代培養(yǎng)。生長(zhǎng)狀態(tài)良好后調(diào)整細(xì)胞密度約2×108L-1，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，以備藥物劑量篩選及模型建立方法對(duì)比。

1.2.2細(xì)胞給藥劑量及模型建立方法篩選 將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、α-細(xì)辛醚組(1、2、4、8、16 μmol·L-1)。各組細(xì)胞棄去廢液后，PBS清洗2遍，正常組細(xì)胞每孔加完全培養(yǎng)基100 μL，α-細(xì)辛醚組細(xì)胞每孔加含藥培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)2 h。以CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞活力，讀取吸光度值(OD值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析篩選出合適藥物濃度。

本研究采用化學(xué)誘導(dǎo)法損傷BV2細(xì)胞。氧化代謝抑制劑主要選擇保險(xiǎn)粉(連二亞硫酸鈉，Na2S2O4)，無糖培養(yǎng)基選擇無糖厄爾平衡鹽溶液，又稱無糖Earle’s液(Earle's BSS，EBSS)。配制10、20、30 μmol·L-1劑量的含Na2S2O4無糖Earle’s液。避光條件下用無糖Earle’s液洗細(xì)胞2次，加入含Na2S2O4無糖Earle’s液處理，即為氧糖剝奪(OGD)。后換回含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，即為再灌注(referfusion，R)，整個(gè)過程可模擬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中腦缺血/再灌注損傷模型，稱為氧糖剝奪/再灌注模型(OGD/R)。篩選構(gòu)建OGD/R細(xì)胞模型合適的氧糖剝奪時(shí)間和再灌注時(shí)間，以及氧化代謝抑制劑Na2S2O4的劑量大小。首先取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度約2×108L-1，24 h后，以行或列為單位將細(xì)胞隨機(jī)分為6組，分別選取含有10、20、30 μmol·L-1劑量Na2S2O4的無糖Earle’s液對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行處理，處理時(shí)間(即氧糖剝奪時(shí)間)分別選取2 h和4 h，再灌注時(shí)間分別選取0、12和24 h。模型建立完成后由CCK-8試劑盒檢測(cè)各篩選條件下BV2細(xì)胞活力，選擇合適的Na2S2O4劑量及氧糖剝奪時(shí)間和再灌注時(shí)間，確定模型建立方法。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞接種于96孔板24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分正常組、OGD/R組、α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組(1、4、16 μmol·L-1)；再以10 μmol·L-1Na2S2O4建立OGD/R模型，先將含有α-細(xì)辛醚的完全培養(yǎng)基預(yù)處理BV2細(xì)胞，2 h后再進(jìn)行OGD/R模型建立。

1.2.3細(xì)胞分組及給藥 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞接種于96孔板，將細(xì)胞隨機(jī)分正常組、OGD/R組、α-細(xì)辛醚低、中和高劑量組；24 h后棄去廢液，均用PBS清洗2遍，正常組及模型組細(xì)胞換為新的完全培養(yǎng)基，α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組換為分別含有1、4、16 μmol·L-1劑量α-細(xì)辛醚的完全培養(yǎng)基；2 h后棄去孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，除正常組PBS清洗2遍，換為新的完全培養(yǎng)基，模型組及α-細(xì)辛醚組均用無糖Earle’s液清洗2遍，換為含有10 μmol·L-1劑量Na2S2O4的無糖Earle’s液；1.5 h后棄去孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，各組細(xì)胞均換為新的完全培養(yǎng)基；12 h后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，提取細(xì)胞上清液和細(xì)胞蛋白進(jìn)行其余指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.4酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)炎性因子水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞接種于6孔板，接種密度為2×108個(gè)·L-1，將細(xì)胞隨機(jī)分正常組、α-細(xì)辛醚對(duì)照組(16 μmol·L-1)、OGD/R組、OGD/R+α-細(xì)辛醚低、中和高劑量組(1、4、16 μmol·L-1)；步驟同“1.2.3”細(xì)胞給藥操作方法。OGD/R模型建立后，吸取細(xì)胞上清液至離心管中，離心15 min(12 000 r·min-1，4 ℃)，小心吸取上清，分裝后-20 ℃冷凍待用。按照ELISA試劑盒步驟以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為Y軸，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品OD值為X軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；將各組測(cè)得OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可得到相應(yīng)的待測(cè)樣本中分泌因子IL-1β、IL-18、IL-10、IL-4及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的濃度。

1.2.6免疫蛋白印跡法檢測(cè)炎性相關(guān)蛋白表達(dá)量 將吸取上清的6孔板中的細(xì)胞用冷的PBS清洗3遍，每孔加入已配制的細(xì)胞裂解液100 μL(細(xì)胞裂解液 ∶PMSF ∶磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)，于冰上用細(xì)胞刮刀刮至6孔板底部無貼壁細(xì)胞，收集到離心管中置于冰上充分裂解，離心30 min(12 000 r·min-1，4 ℃)。吸取上清分裝于新的EP管中，每組取10 μL用于測(cè)定蛋白濃度，剩余樣品加相應(yīng)體積的5× Loading Buffer變性(100 ℃，10 min)。根據(jù)BCA試劑盒說明計(jì)算各組細(xì)胞蛋白濃度，求出細(xì)胞蛋白原濃度(細(xì)胞蛋白原濃度=計(jì)算的蛋白濃度×10×0.8)。根據(jù)細(xì)胞上樣量為20～60 μg，求得上樣體積(上樣體積=上樣量/蛋白原濃度)。

按說明書配膠，電泳，先80 V后轉(zhuǎn)120 V；結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜2 h；后放入封閉液中，封閉2 h；用TBST洗液洗3×10 min，放入一抗孵育盒中，4 ℃過夜；洗膜3×10 min，用標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再洗膜3×10 min。將蛋白印跡膜放置凝膠成像系統(tǒng)暗室中，滴加ECL顯色液。ImageJ軟件分析曝光后所得條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量α-細(xì)辛醚對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響將1、2、4、8、16 μmol·L-1劑量的α-細(xì)辛醚作用于正常細(xì)胞2 h，與正常狀態(tài)下細(xì)胞相比，結(jié)果見Fig 1，與正常組細(xì)胞相比，1、2、4、8、16 μmol·L-1劑量的α-細(xì)辛醚進(jìn)行2 h干預(yù)后，BV2細(xì)胞出現(xiàn)增殖趨勢(shì)(1.16±0.08vs1.00±0.13，1.13±0.18vs1.00±0.13，1.17±0.22vs1.00±0.13，1.12±0.09vs1.00±0.13，1.18±0.12vs1.00±0.13)，但均無明顯差異(P>0.05)。所以α-細(xì)辛醚再1～16 μmol·L-1劑量范圍內(nèi)進(jìn)行藥物干預(yù)是安全的，本研究選用1、4、16 μmol·L-1作為α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組進(jìn)行研究。

Fig 1 Effect of different doses of α-asarone on cell vitality

2.2 OGD/R模型建立方法篩選結(jié)果篩選構(gòu)建OGD/R細(xì)胞模型合適的氧糖剝奪時(shí)間和再灌注時(shí)間，以及氧化代謝抑制劑Na2S2O4的劑量大小，分別選取含有10、20、30 μmol·L-1劑量Na2S2O4的無糖Earle’s液對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行處理，及氧糖剝奪時(shí)間分別選取2 h和4 h，再灌注時(shí)間分別選取0、12和24 h，各組細(xì)胞活力結(jié)果詳見Tab 3。通過觀察10、20、30 μmol·L-1劑量的Na2S2O4，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的不斷增加，細(xì)胞活力明顯降低；通過觀察腦缺血時(shí)間和再灌注時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著隨著OGD和R時(shí)間的增加，細(xì)胞活力也明顯降低。根據(jù)以上結(jié)果，所以本研究選擇10 μmol·L-1劑量的Na2S2O4進(jìn)行模型的建立，因各時(shí)間段OGD/R條件下BV2細(xì)胞活力過低(低于正常組的60%)，所以腦缺血時(shí)間和再灌注時(shí)間仍需要篩選。

Tab 1 Comparison of cell vitality of different OGD/R model establishment methods

經(jīng)過α-細(xì)辛醚給藥劑量及OGD/R模型方法篩選后，已確定α-細(xì)辛醚給藥劑量分為低、中、高劑量組(1、4、16 μmol·L-1)；確定以10 μmol·L-1劑量的Na2S2O4建立OGD/R模型。將氧糖剝奪時(shí)間選為2和1.5 h，再灌注時(shí)間為12和24 h,再次進(jìn)行篩選。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞接種于96孔板，分為正常組、OGD/R組、α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組。

由Fig 2A結(jié)果可得，與正常組相比，模型組BV2細(xì)胞活力過低(0.47±0.16vs1.00±0.22；0.55±0.08vs1.00±0.19，P<0.01)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚給藥組無明顯差異。Fig 2B結(jié)果可得，與正常組相比，模型組BV2細(xì)胞活力接近于60%(0.55±0.05vs1.00±0.08；0.60±0.06vs1.00±0.19，P<0.01)；與模型組相比，OGD 1.5 h+R 24 h條件下α-細(xì)辛醚給藥組無明顯差異，OGD 1.5 h+R 12 h條件下α-細(xì)辛醚中、高劑量組細(xì)胞活力明顯提高(0.72±0.05vs0.60±0.06，P<0.05；0.80±0.09vs0.60±0.06，P<0.01)。綜上，OGD/R模型篩選結(jié)果，氧糖剝奪2 h或再灌注24 h條件下BV2細(xì)胞損傷過于嚴(yán)重，所以可將氧糖剝奪時(shí)間定為1.5 h，再灌注時(shí)間定為12 h，在此條件下，模型組細(xì)胞活力約為正常組細(xì)胞的60%，符合模型建立的標(biāo)準(zhǔn)。且α-細(xì)辛醚也表現(xiàn)出明顯的提高細(xì)胞活力的作用，這一結(jié)果表明，α-細(xì)辛醚預(yù)處理能夠明顯改善對(duì)OGD/R模型誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，促進(jìn)損傷細(xì)胞的恢復(fù)。

Fig 2 Effect of α-asarone on cell vitality of OGD/R model cells

2.3 細(xì)胞一般形態(tài)變化如Fig 3所示，正常組BV2細(xì)胞在正常未激活狀態(tài)下生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞體飽滿立體，胞間偶見突觸連接，背景清晰；α-細(xì)辛醚對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目及胞間突觸連接增多；OGD/R模型組細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞碎片增多，出現(xiàn)胞體較大的“阿米巴樣”細(xì)胞，且背景不清晰；α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組細(xì)胞隨著給藥劑量的增加，“阿米巴樣”細(xì)胞減少，胞體逐漸立體飽滿。從細(xì)胞形態(tài)結(jié)果可直觀顯示，α-細(xì)辛醚對(duì)正常細(xì)胞具有一定的促增殖作用；α-細(xì)辛醚預(yù)處理對(duì)腦缺血/再灌注損傷模型細(xì)胞有一定保護(hù)作用。

Fig 3 Effect of α-asarone morphological changes on damaged cells of OGD/R model

2.4 BV2細(xì)胞促炎因子與抗炎因子水平

2.4.1促炎因子IL-1β及IL-18水平 建立IL-1β標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度與對(duì)應(yīng)OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=491.66X-14.302，R2=0.9944；建立IL-18標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度與對(duì)應(yīng)OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=375.28X-20.713，R2=0.9917。

將各組OD值為X值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求Y值，即得到各組細(xì)胞分泌的促炎因子IL-1β和IL-18的濃度(ng·L-1)，結(jié)果見Fig 4。與正常組相比，模型組細(xì)胞分泌的促炎因子IL-1β水平明顯升高，約為正常組細(xì)胞的2倍(400.5±28.25vs192.8±18.63，P<0.01)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組細(xì)胞分泌的IL-1β水平明顯降低(314.2±9.05vs400.5±28.25，301.5±9.17vs400.5±28.25，281.0±12.45vs400.5±28.25)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常組相比，模型組細(xì)胞分泌的促炎因子IL-18水平明顯升高(263.7±20.66vs143.5±27.25，P<0.01)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚低劑量組細(xì)胞分泌的IL-18水平降低(231.3±17.18vs263.7±20.66，P>0.05)；α-細(xì)辛醚中、高劑量組均表現(xiàn)出極明顯差異(P<0.01)，IL-18水平降低明顯(210.9±16.45vs263.7±20.66，201.2±21.81vs263.7±20.66)。

Fig 4 Effect of α-asarone on IL-1β and IL-18 in OGD/R model cells

根據(jù)以上結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醚對(duì)正常細(xì)胞炎性因子的水平無影響；OGD/R模型損傷后，BV2細(xì)胞的促炎因子水平急劇上升，α-細(xì)辛醚預(yù)處理能夠明顯降低腦缺血/再灌注損傷BV2細(xì)胞促炎因子IL-1β和IL-18的釋放，并且呈量效關(guān)系，以α-細(xì)辛醚高劑量(16 μmol·L-1)效果最佳。

2.4.2抑炎因子IL-10及IL-4水平 建立IL-10標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度與對(duì)應(yīng)OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=585.37X-25.179，R2=0.994 4；建立IL-4標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度與對(duì)應(yīng)OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=191.01X-16.792，R2=0.994 5。結(jié)果見Fig 5。與正常組相比，模型組細(xì)胞分泌的抑炎因子IL-10水平升高(308.3±24.61vs242.3±27.47，P<0.001)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚低劑量組細(xì)胞分泌的IL-10水平有升高趨勢(shì)(336.4±27.87vs308.3±24.61)，無明顯差異(P>0.05)；α-細(xì)辛醚中、高劑量組細(xì)胞分泌的IL-10水平較模型組明顯升高(358.5±13.58vs336.4±27.87，P<0.01；392.3±49.89vs336.4±27.87，P<0.01)。與正常組相比，模型組細(xì)胞分泌的促炎因子IL-4水平明顯升高(118.2±12.36vs95.59±17.95，P<0.01)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚低、中劑量組細(xì)胞分泌的IL-4水平明顯升高(136.3±8.29vs118.2±12.36，135.1±10.70vs118.2±12.36，P<0.05)；α-細(xì)辛醚高劑量組也表現(xiàn)出明顯差異(139.3±8.00vs118.2±12.36，P<0.01)。

Fig 5 Effects of α-asarone on IL-10 and IL-4 in OGD/R injured cells

根據(jù)以上結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醚對(duì)正常細(xì)胞炎性因子的水平無明顯影響；OGD/R模型損傷后，BV2細(xì)胞的促炎因子水平急劇上升外，同時(shí)抑炎因子的水平也呈上升趨勢(shì)；α-細(xì)辛醚預(yù)處理能夠明顯升高腦缺血/再灌注損傷BV2細(xì)胞抑炎因子IL-10和IL-4的釋放，并且呈量效關(guān)系，以α-細(xì)辛醚高劑量(16 μmol·L-1)效果最佳。

與正常組細(xì)胞相比，模型組細(xì)胞IL-1β、IL-18和IL-10、IL-4均升高，說明正常BV2細(xì)胞在OGD/R激活后，向M1型和M2型均有明顯轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。α-細(xì)辛醚預(yù)處理的損傷細(xì)胞，除了能夠明顯降低促炎因子水平之外，還能夠明顯提升抑炎因子水平，α-細(xì)辛醚能夠降低活化的BV2細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其向M2型轉(zhuǎn)化，起到抗炎作用。

2.4.3促炎介質(zhì)TNF-α和抑炎因子TGF-β蛋白表達(dá)量 如Fig 6所示，與正常組相比，OGD/R模型組細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)量有升高趨勢(shì)(1.209±0.095vs1.000±0.076)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚對(duì)TNF-α蛋白表達(dá)量有降低趨勢(shì)(0.945±0.131vs1.209±0.095，0.903±0.068vs1.209±0.095，0.925±0.131vs1.209±0.095)，其中α-細(xì)辛醚中劑量組與高劑量組表現(xiàn)出明顯差異(P<0.05)，α-細(xì)辛醚低劑量組差異無顯著性(P>0.05)。與正常組相比，OGD/R模型組細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)量有升高趨勢(shì)(1.808±0.277vs1.000±0.183)，差異明顯(P<0.01)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚對(duì)TGF-β蛋白表達(dá)量有降低趨勢(shì)(2.008±0.120vs1.808±0.277，2.509±0.177vs1.808±0.277，2.554±0.312vs1.808±0.277)，其中α-細(xì)辛醚中劑量組與高劑量組表現(xiàn)出差異有顯著性(P<0.05)，α-細(xì)辛醚低劑量組差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 6 Effect of α-asarone on expression of TNF-α and TGF-β in OGD/R model cells

Fig 7 Effect of α-asarone on expression of NLRP3 and caspase 1 in OGD/R model cells

Fig 8 Effect of α-asarone on expression of p-NF-κB in OGD/R model cells

由上述結(jié)果可得，α-細(xì)辛醚對(duì)腦缺血/再灌注損傷BV2細(xì)胞能夠起到抗炎作用，與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致。綜上，通過對(duì)6種M1型和M2型極型分泌性標(biāo)記物的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醚可以降低M1型分泌性標(biāo)記物的分泌，促進(jìn)M2型分泌性標(biāo)記物的分泌，所以α-細(xì)辛醚對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷能夠起到明顯的改善作用，可能與調(diào)節(jié)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的M1、M2極型轉(zhuǎn)化有關(guān)。

2.5 炎癥小體NLRP3及caspase 1蛋白表達(dá)量與正常組相比，OGD/R模型組細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)量有明顯升高趨勢(shì)(1.918±0.104vs1.000±0.207)；與模型組相比，各劑量α-細(xì)辛醚預(yù)處理后NLRP3蛋白表達(dá)量有降低趨勢(shì)，其中α-細(xì)辛醚低劑量組和中劑量組差異無顯著性(1.826±0.149vs1.918±0.104，1.728±0.1451vs1.918±0.104，P>0.05)，α-細(xì)辛醚高劑量組明顯降低(1.439±0.246vs1.918±0.104，P<0.05)。與正常組相比，OGD/R模型組細(xì)胞caspase 1蛋白表達(dá)量升高(1.603±0.071vs1.000±0.066)，差異有顯著性(P<0.01)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚低、中、高劑量均對(duì)caspase1蛋白表達(dá)量差異有降低趨勢(shì)(1.004±0.067vs1.603±0.071，1.036±0.065vs1.603±0.071，0.906±0.069vs1.603±0.071，P<0.01)。

由上述結(jié)果可得，α-細(xì)辛醚能夠降低NLRP3和caspase 1蛋白表達(dá)。

2.6 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的蛋白表達(dá)量與正常組相比，OGD/R模型組細(xì)胞p-NF-κB蛋白表達(dá)量升高(1.554±0.123vs1.000±0.114)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚低、中、高劑量對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)量降低(1.113±0.068vs1.554±0.123，1.027±0.1822vs1.554±0.123，1.042±0.182vs1.554±0.123)(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果表明，腦缺血/再灌注損傷后BV2細(xì)胞出現(xiàn)了NF-κB的過度磷酸化，而α-細(xì)辛醚改善OGD/R模型誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷與其降低NF-κB磷酸化有關(guān)。

2.7 ROS活性測(cè)定結(jié)果如Fig 9所示，與正常組相比，模型組細(xì)胞ROS活力明顯升高(21.92±3.37vs10.22±2.02，P<0.001)；與模型組相比，α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組細(xì)胞ROS活性明顯降低(14.84±1.18vs21.92±3.37，12.04±2.634vs21.92±3.37，10.98±2.088vs21.92±3.37)，均表現(xiàn)出明顯差異(P<0.01)。該結(jié)果表明，Na2S2O4結(jié)合無糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)BV2細(xì)胞線粒體損傷，能夠產(chǎn)生過量的ROS，各劑量α-細(xì)辛醚對(duì)線粒體損傷后ROS的活力有抑制作用，通過減少細(xì)胞質(zhì)中過多的ROS產(chǎn)生，以降低其對(duì)線粒體及細(xì)胞的損傷。

Fig 9 Effect of α-asarone on ROS activity of OGD/R model cells

3 討論

局部小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血發(fā)作后幾分鐘內(nèi)被激活，腦缺血后48～72 h出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖高峰，損傷后可持續(xù)數(shù)周，并產(chǎn)生大量的促炎介質(zhì)，包括IL-1β和TNF-α，加劇腦組織損傷。然而，多種證據(jù)表明，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦卒中中起著雙重作用，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能產(chǎn)生多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，這些因子參與腦組織的修復(fù)，還能夠保護(hù)大腦免受興奮性毒性損傷。越來越多的研究認(rèn)為，引起此現(xiàn)象的原因是由于的小膠質(zhì)細(xì)胞在激活狀態(tài)下的細(xì)胞極型轉(zhuǎn)化[8]。在病理?xiàng)l件下，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能極化為M1型(促炎作用)和M2型(抑炎或保護(hù)作用)。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-18和NO等，加重炎癥和組織損傷。相反，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-4、IL-10和RELM-α等，此外還能夠分泌VEGF、BDNF和PDGF等，通過抑制炎癥促進(jìn)組織恢復(fù)。Kanazawa等[10]認(rèn)為以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的治療可能是腦卒中的保護(hù)性治療策略。

體外實(shí)驗(yàn)研究腦缺血/再灌注損傷主要以建立OGD/R模型為主，該模型通過氧糖剝奪建立腦缺血條件下缺糖缺氧的培養(yǎng)細(xì)胞環(huán)境，再通過復(fù)糖復(fù)氧模擬再灌注環(huán)境[11]。本研究采用化學(xué)試劑 Na2S2O4抑制線粒體氧化磷酸化過程，結(jié)合無糖Earle’s液模擬缺糖缺氧環(huán)境，但現(xiàn)在研究中對(duì)于Na2S2O4劑量及氧糖剝奪/再灌注的時(shí)間選擇不一，所以本研究增加了劑量篩選實(shí)驗(yàn)，確定以10 μmol·L-1劑量的Na2S2O4建立OGD/R模型，氧糖剝奪/再灌注時(shí)間分別為1.5 h與12 h。

IL-1β、IL-18作為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的分泌型標(biāo)記物，本研究對(duì)BV2細(xì)胞培養(yǎng)液中的促炎因子IL-1β、IL-18進(jìn)行水平檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)OGD/R模型細(xì)胞分泌的炎性因子比正常細(xì)胞明顯升高，而α-細(xì)辛醚預(yù)處理的損傷細(xì)胞分泌的炎性因子明顯降低；同時(shí)，本研究也檢測(cè)了抑炎因子IL-10、IL-4水平，發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，OGD/R模型細(xì)胞分泌的抑性因子明顯升高，而α-細(xì)辛醚預(yù)處理的損傷細(xì)胞分泌則更高。該結(jié)果與Ding等[12]以及Chen等[9]的研究結(jié)論相一致，所以可認(rèn)為α-細(xì)辛醚預(yù)給藥能夠保護(hù)BV2細(xì)胞，通過降低促炎因子，同時(shí)升高抑炎因子水平發(fā)揮抗炎作用，從而減輕OGD/R造成的細(xì)胞損傷。不過，在Jiang等[13]測(cè)得抑炎因子的結(jié)果與本研究相反，他們的研究結(jié)果顯示損傷細(xì)胞與正常細(xì)胞相比其抑炎因子水平呈降低趨勢(shì)，出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是本研究采用的是小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞(BV2細(xì)胞)，該細(xì)胞在活化條件下，向促炎型(M1型)和抑炎型(M2型)均有轉(zhuǎn)化，所以跟正常細(xì)胞相比其炎性因子和抑炎因子都會(huì)表現(xiàn)出升高趨勢(shì)。此外，通過對(duì)各組BV2細(xì)胞蛋白中促炎介質(zhì)TNF-α及抑炎介質(zhì)TGF-β進(jìn)行蛋白表達(dá)量測(cè)定，得到與ELISA檢測(cè)相同的結(jié)果?？梢哉J(rèn)為OGD/R損傷后BV2細(xì)胞過度激活，向M1型和M2型轉(zhuǎn)化，雖然M2型作起到抗炎作用，但M1型細(xì)胞大量釋放促炎因子，所以BV2細(xì)胞M1型極化率明顯高于M2型，仍使得損傷細(xì)胞處于過度炎性反應(yīng)中；α-細(xì)辛醚預(yù)處理能夠使OGD/R損傷后激活的BV2細(xì)胞向M2型極化，釋放抑炎因子，從而平衡促炎因子過多誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)來保護(hù)細(xì)胞。

IL-1β、IL-18作為炎癥反應(yīng)的重要參與者，它們的激活和分泌與兩條通路密切相關(guān)，即 NLRP3炎性小體和 NF-κB信號(hào)通路[14]。其中，NLRP3炎癥小體是一種大分子多復(fù)合蛋白體，NLRP3炎癥小體最廣泛的特征是控制IL-1β、IL-18前體蛋白pro-IL-1β/18的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。激活后的NLRP3炎癥小體在接頭蛋白ASC的幫助下募集pro-caspase 1，將其剪切成為有活性的caspase 1，活化后的caspase 1能夠?qū)ro-IL-1β/-18剪切成為有活性的IL-1β、IL-18，促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生。NLRP3與caspase 1作為IL-1β、IL-18上游調(diào)節(jié)其分泌的蛋白分子。多數(shù)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制NLRP3的活化能夠降低炎性反應(yīng)發(fā)生，減輕腦缺血/再灌注損傷。并且，近年來大量證據(jù)表明，調(diào)節(jié)NLRP3的活性是改善腦卒中的潛在治療手段[15]。本研究通過測(cè)定NLRP3及caspase 1表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，OGD/R模型細(xì)胞NLPR3及caspase 1蛋白表達(dá)量明顯升高，而α-細(xì)辛醚預(yù)處理能降低它們的過度激活，可以認(rèn)為α-細(xì)辛醚預(yù)處理對(duì)OGD/R損傷BV2細(xì)胞的保護(hù)作用，及α-細(xì)辛醚能夠起到的抗炎作用，與調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活化有關(guān)。

NF-κB作為一種多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在腦缺血/再灌注損傷中的作用機(jī)制主要通過促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展來實(shí)現(xiàn)。腦缺血時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB被激活后，促使IL-1β、IL-18、TNF-α等炎性因子表達(dá)。同時(shí)這些促炎因子又可以激活NF-κB，從而使該過程在腦細(xì)胞間不斷擴(kuò)散，加重炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB作為炎性通路TLR/NF-κB的參與蛋白，也能上調(diào)NLRP3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)NLRP3炎性小體的激活[14]。本研究通過測(cè)定NF-κB及其磷酸化蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醚能明顯OGD/R損傷后BV2細(xì)胞出現(xiàn)的NF-κB過度磷酸化。綜上，可以認(rèn)為NLRP3炎性小體和NF-κB經(jīng)典信號(hào)通路均參與到α-細(xì)辛醚調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)改善腦缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制中。不過，α-細(xì)辛醚是作為炎性蛋白抑制劑發(fā)揮作用，還是在對(duì)炎性蛋白上游調(diào)控因子產(chǎn)生作用？這些可以簡(jiǎn)單從OGD/R細(xì)胞模型建立的原理推測(cè)。

本研究主要采用的是Na2S2O4進(jìn)行OGD/R細(xì)胞模型的建立，其原理主要是通過抑制線粒體產(chǎn)生ATP，作為氧化代謝抑制劑起到細(xì)胞除氧的作用。由此看來，線粒體是病理改變最先發(fā)生的細(xì)胞器。研究表明，活性氧，尤其是來自線粒體的活性氧，參與了NLRP3炎癥物質(zhì)的激活。并且，許多NLRP 3炎癥小體激活劑都能在多種細(xì)胞中觸發(fā)線粒體活性氧的產(chǎn)生[16]。 線粒體作為ROS產(chǎn)生的部位，損傷后其能產(chǎn)生大量ROS，而過高水平的ROS又能刺激線粒體和NLRP3，促進(jìn)其激活后發(fā)揮促炎作用[17-18]。本研究經(jīng)過ROS檢測(cè)，Na2S2O4結(jié)合無糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)BV2細(xì)胞線粒體損傷，能夠產(chǎn)生過量的ROS，α-細(xì)辛醚對(duì)線粒體損傷后ROS的活力有抑制作用，通過減少細(xì)胞質(zhì)中過多的ROS產(chǎn)生，以降低其對(duì)線粒體及細(xì)胞的損傷。

綜上，α-細(xì)辛醚能夠改善氧糖OGD/R導(dǎo)致的BV2細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體及BV2細(xì)胞M1型與M2型轉(zhuǎn)化有關(guān)。相對(duì)于OGD/R損傷細(xì)胞，α-細(xì)辛醚預(yù)干預(yù)能夠提高細(xì)胞活力，減輕受損細(xì)胞產(chǎn)生的ROS活性，抑制NF-κB的磷酸化，以降低NLRP3炎癥小體的過度活化；降低caspase 1對(duì)促炎因子前體pro-IL-1β/18的剪切，進(jìn)而降低IL-1β與IL-18的分泌，促進(jìn)抑炎因子IL-10與IL-4的分泌，起到保護(hù)細(xì)胞的抗炎作用。