徐 穎 張 瑾 滕新棟 張 娟 孫燕茹 梁 潔 徐翮飛 杜建森青島國際旅行衛(wèi)生保健中心（山東，青島，266000）

腹瀉性腸道致病菌主要包括沙門氏菌、大腸O157：H7、志賀氏菌、副溶血弧菌等，是嚴(yán)重危害人類健康的主要因素。中國2009 年-2011 年從9 個口岸監(jiān)測采集79 例旅行者腹瀉樣本，其中57.52%是由沙門氏菌感染所致，4.35%由副溶血弧菌感染所致。在全世界范圍內(nèi)，大腸埃希菌感染占旅行者腹瀉的40%-70%，志賀氏菌在世界范圍內(nèi)也相當(dāng)常見。腸道致病菌的傳統(tǒng)檢測技術(shù)已經(jīng)越來越不能滿足人們的要求，隨著腸道致病菌檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于各類腸道致病菌的檢測中［1］。而腸道致病菌的快速檢測技術(shù)成為了國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點之一。

DNA 提取是腸道病原菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一，所提取的DNA 的含量和質(zhì)量不僅影響到檢測的速度，也影響著檢測的特異性和靈敏性。不同方法對不同類型病原菌的提取效率存在很大差異。細(xì)菌DNA 提取的方法有很多，本研究對比了水煮法、堿液加熱裂解法、Chelex-100 提取法、商品試劑盒DNA 提取法4 種方法對志賀氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、沙門氏菌基因組DNA 的提取效果，并用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗證核酸提取效率，比較4 種方法的提取效率和靈敏度，選出一種簡單、快速、適合大規(guī)模提取腸道致病菌核酸的方法，為進(jìn)一步進(jìn)行腸道致病菌分子檢測研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）標(biāo)準(zhǔn)菌株均來自青島海關(guān)技術(shù)中心實驗室保存菌株。

1.2 主要試劑

PCR 反 應(yīng) 試 劑、DNA Marker、TAE 緩 沖 液、Loading Buffer、瓊脂糖、蛋白酶K、細(xì)菌核酸提取試劑盒等均購自上海生工，Chelex-100 購自SIGMA 公司，NaOH（分析純）為上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品，營養(yǎng)瓊脂購自北京陸橋，引物由上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌液配制

將沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）標(biāo)準(zhǔn)菌株分別在固體培養(yǎng)基上劃線分離，用接菌環(huán)從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落，加入1 mL 生理鹽水中混勻，用濁度儀記錄濁度，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ蒙睇}水調(diào)整菌液濁度為0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌濃度約1×108-1×101CFU/mL的原始菌液。

1.3.2 引物

沙門氏菌的引物序列：Fsal：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’，Rsal：5’-GAGTTACTGAACCAA-CAGCT-3’，目標(biāo)擴(kuò)增片段長度為526 bp。志賀氏菌的引物序列：Fshig：5’-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3’，Rshig：5’-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3’，目標(biāo)擴(kuò)增片段長度為629 bp［2］。出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）的引物序列：F157：5’-TTCAAACAGAGGACCATC-3’，R157：5’-CCCAGCCACTAAGTATTG-3’，目標(biāo)擴(kuò)增片段長度為636 bp［3］。

1.4 DNA 提取方法

1.4.1 水煮法

取配置好的菌液1 mL，12 000 r/min 離心10 min，棄上清。加入150 μL 純水中，混勻，100 ℃煮沸15 min，10 00 0 r/min 離心5 min，上清液即為DNA［4］。

1.4.2 堿液加熱裂解法

取配制好的菌液1 mL，12 000 r/min 離心10 min，棄上清。加入20 mmol/L 的NaOH 溶液100 μL，混勻，煮沸10 min，置于4 ℃冰箱中30 min，12 000 r/min離心10 min，上清液即為DNA。

1.4.3 Chelex-100 提取法

取配置好的菌液1 mL，12 000r/min 離心10 min，棄上清。加入200 μL 5%的Chexlex-100，加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻，56 ℃下孵育20 min，然后放置在沸水浴中8 min，置于4 ℃冰箱中30 min，12 000 r/min 離心10 min，上清液即為DNA。

1.4.4 商品試劑盒DNA 提取法

使用生工細(xì)菌核酸提取試劑盒，操作過程依據(jù)說明書步驟進(jìn)行。

1.5 基因組DNA 檢測

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的基因組DNA，上樣量為3 μL，3-5 V/cm 恒壓電泳20-40 min。

1.6 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物分析

1.6.1 PCR 反應(yīng)體系

10×Buffer 5.5 μL，dNTP 1 μL，引物濃度20 μmol/L各1μL；模板3 μL；Taq DNA 聚合酶0.5 μL；ddH2O 13 μL［2］。

1.6.2 PCR 反應(yīng)條件

94 ℃3 min；94 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，30 次循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

1.6.3 產(chǎn)物分析1.8%-2%濃度的瓊脂糖凝膠，上樣量為5 μL，3-5 V/cm 恒壓電泳20-40 min，結(jié)果記錄保存。

1.7 堿液加熱裂解法提取的DNA 特異性檢測

按堿液加熱裂解法要求提取沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 的基因組DNA，分別用沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 的特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物分析。

1.8 堿液加熱裂解法靈敏度檢測

將沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 的原始菌液，用生理鹽水10 倍梯度稀釋至1×108-1×101CFU/mL。對8 個梯度的菌液按堿液加熱裂解法要求提取DNA，DNA 分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物分析。

2 結(jié)果

2.1 4 種方法提取效果

用水煮法、堿液加熱裂解法、Chelex-100 提取法、商品試劑盒DNA 提取法同時提取沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA，提取的核酸的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。商品試劑盒DNA 提取法提取的基因組DNA 條帶清晰且大小片段均有，Chelex-100 提取法條帶最明亮但是集中在小片段，堿液加熱裂解法片段有明顯的拖尾和彌散，水煮法有時不能顯示明顯的條帶。

圖1 4 種方法提取的DNA 電泳結(jié)果

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

4 種方法分別提取到的沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2-4。除水煮法外，其他方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較淡，其余方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶均清晰明亮。

圖2 4 種方法提取沙門氏菌DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.3 堿液加熱裂解法特異性檢測

分別用沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 的特異引物擴(kuò)增沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 的基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5，每種引物均能擴(kuò)增出各自菌株相應(yīng)的特異性條帶，且條帶清晰、單一、明亮，說明堿液加熱裂解法獲得的基因組DNA 可以滿足細(xì)菌檢測的特異性要求。

圖3 4 種方法提取志賀氏菌DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖4 4 種方法提取O157：H7 DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖5 堿液加熱裂解法提取志賀氏菌、O157：H7、沙門氏菌DNA 的特異性PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.4 堿液加熱裂解法靈敏度檢測

對沙門氏菌、志賀氏菌、O157：H7 1×108-1×101CFU/mL 8 個濃度梯度的菌液分別提取DNA，再分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖6-8。3 株細(xì)菌結(jié)果均顯示，在細(xì)菌濃度為1×102CFU/mL 時，堿液加熱裂解法提取得到的基因組DNA 可以被有效檢出。

圖6 梯度濃度的沙門氏菌核酸的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖7 梯度濃度的志賀氏菌核酸的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖8 梯度濃度的O157：H7 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

3 討論

目前腸道致病菌的基因組DNA 提取方法除了傳統(tǒng)的酚氯仿法以外，可以粗略的分為4 類，包括改良DNA 提取法、Chelex-100 提取法、加熱煮沸法和試劑盒提取法［1］。傳統(tǒng)的酚氯仿提取法和改良方法費時費力，且需要使用酚類物質(zhì)，有一定的毒性，大量使用有害健康、污染環(huán)境，不適合規(guī)模化、常規(guī)化使用。加熱煮沸法利用高溫破碎細(xì)菌，并使蛋白質(zhì)變性而收集DNA，方法簡單、快速、成本低，但是DNA 純度在很大程度上會受到樣本種類的影響，產(chǎn)物中會含有大量的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)［1］。Chelex-100 提取法是一種聚苯乙烯基體離子交換樹脂，該樹脂懸液可以在堿性、100 ℃下破碎細(xì)胞并使蛋白質(zhì)變性，從而釋放DNA。Chelex-100 法可螯合金屬離子，在煮沸的過程中保護(hù)DNA 并且減少抑制PCR 反應(yīng)的物質(zhì)［1］，操作簡單，提取時間短，但是提取的DNA 濃度和純度不如商品試劑盒法，且提取的核酸保存時間短，只能用于短期檢測，核酸的重復(fù)性不穩(wěn)定，不能滿足一線需求。試劑盒提取法獲得的DNA 純度、濃度都相對比較高且質(zhì)量穩(wěn)定，但是試劑盒價格昂貴，在實際的現(xiàn)場和口岸實驗室檢測中，對成本的限制較大，同時操作比較繁瑣，耗費人工太多，不適用于大規(guī)模樣本的提?。?］。堿液裂解法是一種簡單的細(xì)菌基因組DNA 提取方法，其原理是在強(qiáng)堿性和一定溫度下能迅速破碎細(xì)胞膜和核膜，使核酸酶變性并釋放DNA。雖然此方法獲得的DNA 濃度和純度不如試劑盒法，但是能夠滿足PCR 的擴(kuò)增反應(yīng)，既能減少試劑的使用，又可以在短時間內(nèi)完成對樣本的有效提取，具有簡便、高效、快速和成本低的特點，特別適合同時處理大量樣本的口岸一線實驗室使用，為高效提取腸道致病菌DNA 提供了一個參考依據(jù)。

本研究選擇水煮法、堿液加熱裂解法、Chelex-100 提取法、商品DNA 提取法分別提取3 株腸道病原菌基因組DNA。經(jīng)PCR 驗證，4 種方法中，水煮法成本最低且效率最低；商品試劑盒DNA 提取法效率最高但成本最高；Chelex-100 法獲得的小片段最多，核酸易降解；堿液加熱裂解法相對成本低、操作快、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，獲得的核酸能夠滿足腸道致病菌檢測的特異性要求，核酸提取的靈敏度達(dá)到1×102CFU/mL。以堿液加熱裂解法作為基礎(chǔ)，研究在短時間內(nèi)獲得大量的、高效的細(xì)菌基因組DNA的提取方法，以滿足口岸一線的快速通關(guān)、準(zhǔn)確檢測的要求，有著重要的指導(dǎo)意義。