閆冀煥 沈 軍 周新霞 蘇麗紅 張曉娜 河北國際旅行衛(wèi)生保健中心（石家莊海關(guān)口岸門診部）（河北，石家莊，050091）

陳 凱 江蘇國際旅行衛(wèi)生保健中心蘇州分中心（江蘇，蘇州，215128）

人感染了梅毒螺旋體后可產(chǎn)生兩類抗體，第一類為梅毒螺旋體的特異性抗體，通常在潛伏期或感染2 個星期左右時間產(chǎn)生，通過TP-ELISA、CMIA和TPPA 等實驗方法，可進行梅毒螺旋體特異性抗體的測定；另一類為梅毒螺旋體的非特異性抗體（抗脂質(zhì)抗體），較特異性抗體出現(xiàn)晚了2～3 周，可通過甲苯胺紅不加熱血清實驗 （toluidine red untreated serum test，TRUST）［1］來檢測。TRUST 廣泛應(yīng)用于人血清或血漿中反應(yīng)素的檢測，應(yīng)用于出入境健康體檢、梅毒病人輔助診斷及療效評價［2］。TRUST測定原理是利用性病實驗室玻片試驗抗原（VDRL抗原）與試驗抗體相結(jié)合，并重懸在特制的甲苯胺紅溶液中，假如待測血清中存在反應(yīng)素時，就能與VDRL 抗原產(chǎn)生凝集反應(yīng)，從而出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色凝塊進而判讀結(jié)果。由于在TRUST 實驗過程中所使用的心磷脂抗原并不是梅毒螺旋體本身或其菌體成分，故在檢測某些自身免疫性疾病或某些特定疾病時，可出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象［3-4］；并且當(dāng)血清抗體濃度過高時，還易產(chǎn)生前帶現(xiàn)象［5］，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。除去患者自身因素，在試驗過程中各綜合因素的影響，亦會使TRUST 結(jié)果出現(xiàn)假陽性［6-7］和假陰性［8-9］，比如實驗溫度、保存時間長短和溫度高低、試劑盒的平衡時間長短、抗原和抗體的振蕩反應(yīng)時間長短、pH 值高低［10］以及凝集反應(yīng)判讀的主觀差異等。為了更好地分析和研究外界影響因素所造成的TRUST 假陽性與假陰性的問題，本實驗室在嚴格進行質(zhì)量控制的前提下，深入探討了這些外界影響因素對TRUST 結(jié)果的影響，以期為TRUST 檢測的過程控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本來自于河北國際旅行衛(wèi)生保健中心2017年1 月至2021 年12 月期間出入境健康體檢人員，所有標(biāo)本均采用具有分離膠的采血管采集血液，以3 000 r/min 離心10 min 后，再分離出血清，并要求肉眼觀察血清中無脂血、黃疸和溶血現(xiàn)象，并剔除所有可能導(dǎo)致TRUST 測定出現(xiàn)假陽性結(jié)果的疾病標(biāo)本［3-4］。

1.2 主要儀器和試劑

50 μL 微量移液器、水平旋轉(zhuǎn)儀（轉(zhuǎn)速100±2 r/min）、TRUST 反應(yīng) 紙 卡、20 μL TRUST 專 用 滴管、高速離心機、4 ℃冷藏冰箱、-40 ℃冷凍冰箱；梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA）試劑盒購自日本富士瑞必歐株式會社，TRUST 檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，上述試劑均于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?，用前充分恢?fù)至室溫；pH 試紙購自上海三愛思公司。

1.3 影響測定結(jié)果的外界因素

1.3.1 保存溫度和時間

取TRUST 陰性標(biāo)本30 例，TRUST 滴度1∶1（20例）、1∶2（15 例）、1∶4（10 例）、1∶8（10 例）、1∶16（10 例）和1∶32（4 例）的陽性標(biāo)本（共計69 例，均經(jīng)TPPA確認為陽性）。將血清標(biāo)本分為3 份，依次分裝于2.0 mL 螺口凍存管中，分裝完立即將1 份血清放于常溫，1 份血清放于4 ℃冰箱，1 份血清放于-40 ℃冰箱，并分別在保存后的1 d、3 d、7 d、10 d 取出，再次進行TRUST 檢測并記錄滴度。

TPPA 和TRUST 檢測，必須嚴格按照試劑盒說明書進行手工操作，為避免實驗者的主觀干擾，要求所有實驗操作、結(jié)果判讀均由同一個人完成，質(zhì)控必須在控。

1.3.2 反復(fù)凍融

30 例TRUST 陰性標(biāo)本和69 例TRUST 陽性標(biāo)本，放于-40 ℃冰箱的標(biāo)本凍存時間達2 h，取出解凍后進行TRUST 測定，對TRUST 陽性者則繼續(xù)檢測滴度；測完后再立即凍存2 h，如此重復(fù)凍存4次，檢測4 次。最后，將不同凍融次數(shù)的TRUST 測定結(jié)果與原始結(jié)果進行比較研究。

1.3.3 水平旋轉(zhuǎn)儀振蕩時間

TRUST 試劑盒說明書要求水平旋轉(zhuǎn)儀振蕩反應(yīng)8 min 后立即觀察結(jié)果。將30 例TRUST 陰性標(biāo)本和69 例TRUST 陽性標(biāo)本振蕩時間延長至0.5 h，觀察結(jié)果。

1.3.4 試劑盒平衡時間

30 例TRUST 陰性標(biāo)本和69 例TRUST 陽性標(biāo)本，用從4 ℃冰箱取出后室溫平衡30 min 的試劑盒和室溫保存1 周的試劑盒，分別進行滴度測定。

1.3.5 pH 值

TRUST 陰性標(biāo)本30 例分別加入稀鹽酸或稀氫氧化鈉，配制成pH 1～14，再進行滴度檢測。

1.3.6 電解質(zhì)

以飽和氯化鈉鹽水代替說明書規(guī)定使用的生理鹽水稀釋標(biāo)本，記錄69 例TRUST 陽性標(biāo)本最終滴度，并與原始滴度對比分析；30 例陰性標(biāo)本分別稀釋成1∶1、1∶2、1∶4 和1∶8，再進行滴度檢測。

1.4 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和統(tǒng)計學(xué)分析

利用對TRUST 滴度取倒數(shù)的自然對數(shù)后的數(shù)值，即LN 值（1/TRUST 滴度）進行統(tǒng)計學(xué)分析，并以“幾何均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（G±SD）”的形式表達。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。組與組之間兩兩比較采用配對樣本t 檢驗，P＜0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 保存時間和溫度對TRUST 檢測結(jié)果的影響

69 例TRUST 陽性標(biāo)本，原始LN 值（1/TRUST 滴度）（G±SD）為1.17±1.06，在室溫、4 ℃冷藏和-40 ℃冷凍3 種儲存溫度下，3 d 內(nèi)，TRUST 檢測結(jié)果穩(wěn)定，均無顯著性變化（P>0.05）；但從第7 天開始，TRUST 滴度出現(xiàn)了明顯下降（P<0.05），并且標(biāo)本保存時間越長，TRUST 滴度下降的越多（見表1）。

表1 保存時間和溫度對TRUST 結(jié)果的影響

2.2 TRUST 陽性標(biāo)本隨保存時間和溫度的滴度降低率和轉(zhuǎn)陰率

在不同保存溫度下，TRUST 陰性標(biāo)本經(jīng)檢測后30 例仍為陰性結(jié)果；69 例TRUST 陽性標(biāo)本隨時間變化出現(xiàn)了滴度降低的現(xiàn)象。在相同保存溫度下，除1∶32 實驗組外，其他5 組，在相同保存天數(shù)下，滴度降低率最高的是1∶1 實驗組；另外，從1∶1 到1∶16實驗組，滴度降低率也呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。實驗結(jié)果表明，TRUST 陽性標(biāo)本保存時間越長，對TRUST滴度低的標(biāo)本的測定結(jié)果影響越大。在常溫和4 ℃的保存條件下，TRUST 測定結(jié)果由陽性轉(zhuǎn)成陰性，均出現(xiàn)于1∶1 和1∶2 實驗組；在-40 ℃保存條件下，7 d和10 d 分別有1 例和2 例TRUST 滴度為1∶4 的血清標(biāo)本轉(zhuǎn)為陰性（見表2）。

表2 TRUST 陽性標(biāo)本在不同保存溫度下隨時間滴度降低率和轉(zhuǎn)陰率[n（%）]

2.3 TRUST 陽性標(biāo)本反復(fù)凍融后滴度變化情況

反復(fù)凍融1～4 次，對30 例TRUST 陰性標(biāo)本無影響，復(fù)測仍為陰性。69 例TRUST 陽性標(biāo)本復(fù)測后，出現(xiàn)滴度下降的趨勢；與原始G±SD 比較，當(dāng)凍融次數(shù)為1～2 次時，TRUST 滴度無明顯變化 （P＞0.05）；但當(dāng)凍融次數(shù)在3 次及3 次以上時，TRUST滴度呈明顯下降趨勢 （P＜0.05），滴度降低率≥23.19%（見表3）。

表3 TRUST 陽性標(biāo)本反復(fù)凍融后滴度變化情況

2.4 水平旋轉(zhuǎn)儀振蕩時間對TRUST 檢測結(jié)果的影響

將振蕩時間由說明書規(guī)定的8 min 調(diào)整成0.5 h后，再重新讀取TRUST 測定結(jié)果時，發(fā)現(xiàn)69 例TRUST 陽性標(biāo)本復(fù)測后全部為陽性，而30 例TRUST 陰性標(biāo)本中，出現(xiàn)1 例復(fù)測結(jié)果為弱陽性。

2.5 試劑盒平衡時間對TRUST 檢測結(jié)果的影響

利用4 ℃冰箱至室溫平衡30 min 的試劑盒復(fù)測，30 例TRUST 陰性標(biāo)本和69 例陽性標(biāo)本復(fù)測結(jié)果均與初測相同；用室溫保存1 周的試劑盒復(fù)測，30 例TRUST 陰性標(biāo)本復(fù)測結(jié)果均與初測相同，69例陽性標(biāo)本中有2 例滴度為1∶1 的轉(zhuǎn)為陰性。

2.6 pH 值對TRUST 檢測結(jié)果的影響

將30 例TRUST 陰性標(biāo)本分別加入稀鹽酸或稀氫氧化鈉，配制成pH 1～14 的血清溶液，再進行TRUST 檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH≤3 時，初測TRUST 陰性標(biāo)本復(fù)測時會變成陽性。

2.7 電解質(zhì)濃度對TRUST 檢測結(jié)果的影響

利用飽和氯化鈉鹽水稀釋，69 例TRUST 陽性標(biāo)本的LN（1/TRUST 滴度）值G±SD 為1.71±1.00，相比原始的G±SD （1.17±1.06），TRUST 滴度明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.026，P＜0.05）。30 例TRUST 陰性標(biāo)本，經(jīng)飽和氯化鈉鹽水稀釋比例為1∶1 時，有18 例標(biāo)本TRUST 結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)為陽性；稀釋為1∶2 時，有24 例標(biāo)本TRUST 結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)為陽性；稀釋為1∶4 和1∶8 時，30 例TRUST 陰性標(biāo)本全部由陰性轉(zhuǎn)為陽性。

3 討論

本實驗室在檢測衛(wèi)生部臨檢中心梅毒抗體（非特異）室間質(zhì)評標(biāo)本時，多次出現(xiàn)檢測結(jié)果不易判定的情況。由于每年室間質(zhì)評標(biāo)本都是以一次快件形式全部寄達實驗室，需要在規(guī)定時限分兩次測定，在快遞運輸以及實驗室保存的待檢過程中，會經(jīng)過冷藏或冷凍儲存不同時間才能完成測定。為此，觀察保存時間和溫度、振蕩時間、反復(fù)凍融次數(shù)、試劑盒的平衡時間、pH 值及電解質(zhì)濃度等外界因素對TRUST 檢測結(jié)果是否具有影響，需深入探討。

本實驗結(jié)果表明，保存時間以及反復(fù)凍融次數(shù)對TRUST 結(jié)果穩(wěn)定性具有很大的影響。新鮮標(biāo)本在室溫、4 ℃冷藏和-40 ℃冷凍儲存，3 d 內(nèi)TRUST 滴度基本保持穩(wěn)定（P＞0.05）；第7 天后，TRUST 滴度出現(xiàn)下降趨勢（P＜0.05），并且隨著保存天數(shù)越長，滴度降低越多。這說明，血清反應(yīng)素在體外會發(fā)生逐日降解現(xiàn)象，導(dǎo)致滴度逐日降低。血清標(biāo)本凍融次數(shù)為1～2 次時，TRUST 結(jié)果穩(wěn)定（P＞0.05）；但凍融次數(shù)高達3 次及3 次以上時，TRUST 滴度出現(xiàn)明顯下降趨勢（P＜0.05）。實驗結(jié)果提示，在日常進行臨床檢測或室間質(zhì)評標(biāo)本檢測時，收到標(biāo)本后應(yīng)及時測定，盡量避免保存時間長短和反復(fù)凍融次數(shù)這些影響因素對TRUST 測定結(jié)果的影響，若遇特殊原因無法及時檢測時，收到樣本后，應(yīng)立刻放入2～8 ℃冰箱中保存，且保存時間盡量不要超過3 d，并且盡量避免反復(fù)凍融次數(shù)在3 次及3 次以上，否則可能會產(chǎn)生TRUST 檢測結(jié)果假陰性或者檢測滴度降低。

《梅毒非特異性抗體檢測操作指南》（WST491-2016）［11］中建議，TRUST 測定時水平旋轉(zhuǎn)儀應(yīng)振蕩8 min，并于3 min 內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果，在將水平旋轉(zhuǎn)儀的振蕩時間由8 min 延長至0.5 h 后，觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 例TRUST 陰性標(biāo)本中，有1 例出現(xiàn)假陽性結(jié)果，提示在檢測過程中一定要嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，超過8 min 后未讀取結(jié)果時必須重做TRUST檢測，以避免結(jié)果出現(xiàn)錯誤。

《梅毒非特異性抗體檢測操作指南》（WST491-2016）中建議，所有從4 ℃冰箱中取出的待檢標(biāo)本、檢測試劑、陰陽性對照、質(zhì)控血清等，均應(yīng)放置在室溫平衡30 min 后才可進行試驗檢測。將室溫放置1周的試劑盒，與從4 ℃冰箱取出后室溫平衡30 min的試劑盒分別進行TRUST 測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初測為TRUST 陰性的30 例標(biāo)本，復(fù)測仍為陰性；初測為TRUST 陽性的69 例標(biāo)本，復(fù)測后有2 例滴度為1∶1的轉(zhuǎn)為陰性。假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，說明TRUST 試劑盒在室溫條件下存放時間過長可造成TRUST 檢測試劑中的抗原滴度降低，進而影響TRUST 測定結(jié)果，尤其影響滴度低的陽性標(biāo)本。由此推測，如果TRUST 試劑保存時間過長或者已經(jīng)過期，也可能會造成抗原滴度降低，從而出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。建議各臨床實驗室在購買試劑前，盡量根據(jù)試劑的有效期計算好用量，以避免試劑存放時間過長而過期。假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn)，從另一方面也提醒各臨床實驗室，在TRUST 測定中必須要做好陰性和陽性對照以及質(zhì)控試驗，以便有效監(jiān)控試劑的質(zhì)量。

本實驗室還發(fā)現(xiàn)pH 值對TRUST 檢測結(jié)果有影響，尤其是在標(biāo)本pH≤3 時會導(dǎo)致TRUST 假陽性。假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)，提示各臨床實驗室，在TRUST 測定過程中，應(yīng)嚴格對試驗的每一個環(huán)節(jié)進行控制，以防止標(biāo)本被酸性試劑污染［10］。利用飽和氯化鈉鹽水代替生理鹽水稀釋標(biāo)本后，不但TRUST陽性標(biāo)本的滴度明顯升高，而且陰性標(biāo)本也變成了陽性。分析假陽性出現(xiàn)的原因，可能是由于飽和氯化鈉鹽水破壞了蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定性，而使蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析沉淀反應(yīng)，沉淀物黏附在抗原顆粒表面，從而產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。為此，各臨床實驗室在TRUST測定時，一旦高鈉血癥和嚴重脫水等病人出現(xiàn)了TRUST 結(jié)果陽性時，一定考慮到假陽性結(jié)果的可能，綜合分析，避免出現(xiàn)結(jié)果誤判。

綜上所述，雖然TRUST 廣泛應(yīng)用于出入境人員健康體檢、梅毒患者篩查和療效觀察，但存在一定的假陰性和假陽性現(xiàn)象。本實驗室通過一系列試驗，研究探討了引起TRUST 假陰性和假陽性結(jié)果的影響因素，并針對這些影響因素給出了自己實驗室的經(jīng)驗、意見和建議，旨在進一步提高TRUST 檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和正確性，以減少臨床上對梅毒相關(guān)疾病的漏診和誤診。