于 婧 馮丹丹 趙 靖 潘文森△

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，河北 石家莊 050017)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)通?？捎啥喾N疾病觸發(fā)，包括休克、敗血癥、肺炎、胰腺炎、輸血、藥物過量、嚴(yán)重創(chuàng)傷和外科手術(shù)等，是臨床常見的危重癥疾病之一。ALI這一名詞雖然至今未在中醫(yī)學(xué)中有所記載，但關(guān)于ALI的癥狀已在多部中醫(yī)古籍中描述。如《素問·咳論》載 “肺咳之狀，咳而喘息有音，甚則唾血”，又如《靈樞·五閱五使》載“故肺病者，喘息鼻張”，《靈樞·本臟》“肺高則上氣，肩息咳”。同時(shí)，有學(xué)者將ALI癥狀總結(jié)為“喘”“昏”“滿”“熱”四證[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ALI患者可能出現(xiàn)胸痛、胸悶、氣短，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)咯血、呼吸窘迫、呼吸衰竭、嗜睡甚至昏迷等癥狀。對(duì)于ALI的治療，盡管目前呼吸支持及重癥監(jiān)護(hù)患者管理技術(shù)的發(fā)展取得了進(jìn)步，但死亡率仍然高達(dá)40%以上[2]。近年來，隨著人們對(duì)中醫(yī)藥治療ALI的不斷探索，發(fā)現(xiàn)單味中藥或者復(fù)方制劑在清熱解毒、通腑瀉肺、活血化瘀、益氣扶正等多方面對(duì)ALI的治療取得一定療效[3]。桑黃素(Morin)(2',3,4',5,7-五羥基黃酮)是從多種植物中分離得到的天然活性物質(zhì)，屬于黃酮類化合物。已有大量研究表明，Morin具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等多種特性[4-5]，且有證據(jù)表明氧化應(yīng)激(oxidative stress)是參與ALI病理進(jìn)展的關(guān)鍵事件之一[6-7]。

本研究通過使用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞極化，模仿LPS誘導(dǎo)的ALI發(fā)生時(shí)巨噬細(xì)胞的變化，旨在觀察Morin對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，為尋找ALI有效治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(Procell CL-0190)，購自武漢普諾賽生命科技有限公司；RAW 264.7細(xì)胞株，培養(yǎng)于含有青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，吸走部分培養(yǎng)基，然后用無菌細(xì)胞刮將細(xì)胞刮落，吹打后接種到新的裝有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。放置于37 ℃、含5%二氧化碳(CO2)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 Morin、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、二甲基亞砜(methyl sulfoxide，DMSO)、細(xì)胞裂解液和四唑鹽(MTT)，均購自美國Sigma公司，貨號(hào)分別為M4008、L2880、D2650、R0278和M2003；還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶1(NADPH oxidase 1, NOX1)抗體、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4, NOX4)抗體、核因子2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)抗體、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)抗體和β-actin抗體，均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為17772-1-AP、14347-1-AP、16396-1-AP、10701-1-AP和66009-1-Ig；Total RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司，貨號(hào)R6934)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ThermoFisher公司，貨號(hào)K1622)；SYBR Green Master Mix(美國Invitrogen公司，貨號(hào)A25778)；臺(tái)盼藍(lán)(美國Invitrogen公司，貨號(hào)T10282)。

1.1.3 儀器 NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀及電泳槽(美國Bio-Rad公司)；電化學(xué)發(fā)光儀(法國Vilber Lourmat公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組和處理 預(yù)先使用12.5 μmol/L和25.0 μmol/L 2種濃度的Morin單獨(dú)作用或與LPS(1 mg/L)共同處理巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞活力均未造成影響，實(shí)驗(yàn)中我們選用25.0 μmol/L作為Morin的處理濃度。巨噬細(xì)胞RAW 264.7分為DMSO組(DMSO)、LPS組(LPS 1 mg/L)、Morin組(Morin 25.0 μmol/L)、LPS+Morin組(LPS 1 mg/L + Morin 25.0 μmol/L)。觀察Morin對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的作用。取對(duì)數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按所需密度接種于6孔板或細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至密度約為80%～90%時(shí)，用Morin(25.0 μmol/L)預(yù)處理RAW 264.7細(xì)胞后，予LPS(1 mg/L)刺激24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑溴鹽(MTT)比色法 按照1×104個(gè)/孔的細(xì)胞濃度將RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板上，待細(xì)胞充分貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)予細(xì)胞刺激24 h。隨后，將培養(yǎng)基更換為100 μL無血清DMEM，并加入MTT染色液10 μL，放回培養(yǎng)箱中避光37 ℃培養(yǎng)4 h。設(shè)置全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長為490 nm，并放置細(xì)胞進(jìn)行吸光度值檢測(cè)。每個(gè)處理樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 蛋白免疫印跡(western blot，WB)檢測(cè) 收取各組細(xì)胞于離心管中，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入合適劑量的蛋白裂解液，充分震蕩后超聲裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)法定量，加入上樣緩沖液(稀釋5倍)充分混勻后沸水浴5 min。10%分離膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉、一抗孵育4 ℃過夜、二抗孵育后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。Image J圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè) 將各組細(xì)胞收集于EP管中，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入適量Trizol處理液，總RNA提取按照Total RNA提取試劑盒說明書的步驟進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。加入引物和熒光PCR染料法混合物SYBR mix配置RT-PCR反應(yīng)體系，每組樣本設(shè)置3個(gè)副孔，反應(yīng)條件為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，循環(huán)39次。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 Morin對(duì)巨噬細(xì)胞活力影響 Morin在12.5 μmol/L和25.0 μmol/L 濃度劑量下，單獨(dú)作用或與LPS(1 mg/L)共同處理巨噬細(xì)胞24 h，均未對(duì)巨噬細(xì)胞活力造成顯著影響(P>0.05)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用25.0 μmol/L作為Morin的處理濃度。MTT比色法檢測(cè)不同處理對(duì)巨噬細(xì)胞活力影響見圖1。

圖1 MTT比色法檢測(cè)不同處理對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

2.2 Morin對(duì)LPS刺激下巨噬細(xì)胞NOX1 mRNA、NOX4 mRNA表達(dá)水平影響 與DMSO組比較，LPS處理組巨噬細(xì)胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA水平較DMSO處理顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，單獨(dú)予Morin處理對(duì)巨噬細(xì)胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA水平影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS處理組比較，Morin給藥組巨噬細(xì)胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA水平顯著降低(P<0.05)。各組巨噬細(xì)胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA表達(dá)情況見圖2。

與DMSO組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS組比較，△P<0.05

2.3 Morin對(duì)LPS刺激下巨噬細(xì)胞NOX1和NOX4蛋白表達(dá)水平的影響 與DMSO組比較，LPS組巨噬細(xì)胞中NOX1和NOX4蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.01)，單獨(dú)予Morin處理對(duì)巨噬細(xì)胞中NOX1和NOX4 蛋白水平影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS組比較，Morin組巨噬細(xì)胞中NOX1和NOX4的蛋白水平顯著降低(P<0.01)。各組巨噬細(xì)胞中NOX1和NOX4蛋白表達(dá)情況見圖3。

與DMSO組比較，**P<0.01；與LPS組比較，△△P<0.01

2.4 Morin對(duì)LPS刺激下巨噬細(xì)胞中Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響 與DMSO組比較，LPS處理或Morin處理后巨噬細(xì)胞中抗氧化應(yīng)激指標(biāo)Nrf2和HO-1蛋白水平顯著增加(P<0.01，P<0.001)。與LPS處理組比較，LPS+Morin處理組Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加(P<0.01)。各組巨噬細(xì)胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)情況見圖4。

與DMSO組比較，**P<0.01，***P<0.001;與LPS組比較，△△P<0.01

2.5 Morin緩解LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的示意圖 見圖5。

圖5 Morin緩解LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的示意圖

3 討論

ALI是一種以彌漫性肺泡損傷、炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡上皮屏障破裂、肺泡水腫、肺氣體交換受損為特征的嚴(yán)重、多因素的肺部病變，具有高發(fā)病率、高致死率等特點(diǎn)。目前，大多數(shù)ALI患者的治療效率低，治療方案主要集中在控制肺部炎癥、小潮氣量機(jī)械通氣，液體管理及體外肺氧合等，尚缺乏有效的藥物進(jìn)行防治[8-9]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ALI屬暴喘、喘脫范疇，主要由內(nèi)傷或外感后肺不主氣或腎不納氣進(jìn)而導(dǎo)致肺氣上逆或氣不歸元所致。中醫(yī)治療ALI主要包括清熱解毒、宣肺通腑、活血化瘀、扶正祛邪、通里攻下、肺腸同治、益氣利血等。已有多項(xiàng)研究表明，中藥在治療呼吸系統(tǒng)疾病中收到良好功效。如中藥制劑蓮花清瘟膠囊聯(lián)合常規(guī)抗病毒西藥治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)感染患者安全有效，并且可預(yù)防與感染者密切接觸后COVID-19進(jìn)展[10-11]。此外，研究顯示痰熱清注射液、參麥注射液等多種中藥制劑均能通過抑制過氧化作用，減輕氧化應(yīng)激所致肺損傷[12]。Morin是一種在水果、蔬菜中發(fā)現(xiàn)的生物類黃酮，最初是從?？浦参镏蟹蛛x出來，作為黃酮類化合物的一種，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及治療糖尿病等多種生物學(xué)活性。有研究表明，在LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型中，Morin能有效緩解ALI 導(dǎo)致的肺泡水腫與肺組織纖維化形成，同時(shí)降低ALI模型大鼠外周血清中炎癥因子表達(dá)水平[13]。此外，Morin還可降低支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細(xì)胞數(shù)量，顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肺組織中性粒細(xì)胞浸潤[14]。

氧化應(yīng)激是影響ALI發(fā)展和進(jìn)程的重要機(jī)制之一。在ALI條件下，氧化應(yīng)激顯著誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的激活及一氧化氮(NO)的分泌，進(jìn)一步促進(jìn)了更強(qiáng)氧化劑的產(chǎn)生和氧化損傷的發(fā)展[15]。并且氧化應(yīng)激損傷可通過炎癥對(duì)肺泡上皮細(xì)胞間接誘導(dǎo)，進(jìn)一步加速肺泡上皮細(xì)胞的壞死和凋亡[16]。紅系衍生的Nrf2是各種細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子[17]。有研究表明，Nrf2能參與巨噬細(xì)胞代謝和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，并且Nrf2的激活對(duì)包括急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)在內(nèi)的各種肺部疾病均具有保護(hù)作用[18-19]。HO-1是Nrf2依賴性抗氧化防御基因之一，同樣Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激并對(duì)ALI發(fā)揮抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用[20]。Morin可作為Nrf2的外源性激動(dòng)劑，促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的生物學(xué)作用[21]。

本研究采用LPS刺激巨噬細(xì)胞，以Morin為干預(yù)手段。首先觀察到，當(dāng)巨噬細(xì)胞給予LPS刺激后，作為ROS主要來源的NOX1、NOX4的表達(dá)水平較正常DMSO組明顯升高，說明LPS能夠激活巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用。其次觀察了不同組別中Nrf2及其下游產(chǎn)物HO-1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LPS+Morin組中Nrf2、HO-1的表達(dá)較DMSO組、LPS組及Morin組均升高。這可能是由于Nrf2激活作為對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，一旦細(xì)胞受到LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的挑戰(zhàn)，Nrf2的激活就開始了。然而，它無法完全克服LPS的刺激作用，而適應(yīng)性刺激的Nrf2可能會(huì)減輕或延遲LPS的刺激作用。在Morin組中Nrf2及其下游產(chǎn)物HO-1的表達(dá)明顯增加，表明Morin給藥可增強(qiáng)這種作用。因此，這支持了Morin通過Nrf2途徑在預(yù)防和治療LPS誘導(dǎo)的ALI中可能發(fā)揮作用。

綜上所述，Morin可通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，下調(diào)NOX1和NOX4的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過研究Morin對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為尋找ALI的有效治療靶點(diǎn)提供了新思路，并為Morin藥理學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。