張小琴,王友翠,謝俊霞

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病[1-9]。PD主要的病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元大量變性丟失，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA含量減少，而變性丟失的 DA能神經(jīng)元內(nèi)均出現(xiàn)α-突觸核蛋白積聚[10-13]。環(huán)狀RNA是一類不具有5′末端帽子和3′末端 poly(A)尾巴、以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的RNA分子。由于呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對核酸外切酶不敏感，因此環(huán)狀RNA比線性RNA更為穩(wěn)定，且具有物種保守性、組織時序性及疾病表達特異性[14-20]。有文獻報道，環(huán)狀RNA小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(CDR1as)可作為miR-7海綿調(diào)控miR-7靶基因的表達[21-22]。已有研究表明，α-突觸核蛋白基因的拷貝增加或點突變均可導(dǎo)致α-突觸核蛋白積聚，從而引發(fā)PD[23-24]。而miR-7可以與α-突觸核蛋白基因編碼 mRNA的3′UTR 區(qū)相互作用，從而抑制其翻譯[25-26]。這提示作為miR-7海綿的CDR1as基因可能參與了DA能神經(jīng)元的變性丟失。因此，闡明CDR1as基因在PD中發(fā)揮的作用至關(guān)重要。本研究旨在探討經(jīng)1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)處理的PD細胞模型中CDR1as基因的表達變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及其來源

MPP+(M0896)由美國Sigma公司提供，用雙蒸水稀釋至10 mmol/L，分裝，-20 ℃避光保存；DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液(01-052-1ACS)購自BI公司；TRIzol購自ambion公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11711)和SYBR Green(AG11702)購自艾科瑞生物公司；胎牛血清(澳洲源，F(xiàn)ND500)購自依科賽公司；青霉素和鏈霉素混合雙抗液(F1400)購自索萊寶公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

小鼠神經(jīng)母細胞瘤N2a細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.05胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混合雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞活力

將N2a細胞接種于96孔板中，每孔細胞懸液200 μL(細胞數(shù)為8×104個)，培養(yǎng)24 h后，棄上清，對照組直接加入新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)液，MPP+組加入終濃度為100 μmol/L的MPP+，分別處理3、6、9和12 h。細胞處理結(jié)束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板，棄上清，每孔加入100 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min。用酶標儀檢測波長570 nm處的吸光度(A)值，計算細胞存活率。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測CDR1as基因表達

將傳代N2a細胞接種于12孔板，分為對照組(A組)和100 μmol/L MPP+處理3、6、9、12 h組(B、C、D、E組)。采用TRIzol法冰上裂解各組細胞5 min。按照PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書操作，提取細胞總RNA。取1 μg的總RNA，加入1 μL gDNA Clean Reagent、2 μL 5×gDNA Clean Buffer，用RNA free water補至10 μL，42 ℃變性2 min；隨后向上述反應(yīng)體系中加入Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×RTase Reaction Buffer Mix Ⅰ 4 μL、RNA free water 4 μL，37 ℃作用15 min，繼以85 ℃、5 s逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法相對定量測定CDR1as基因的表達。RT-PCR 檢測所用引物及其序列見表1。應(yīng)用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量。

表1 RT-PCR檢測所用引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MPP+作用不同時間對N2a細胞存活率影響

與對照組相比較，經(jīng)100 μmol/L MPP+作用3、6、9和12 h的N2a細胞存活率均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.283～11.430，P<0.05)。見表2。

表2 MPP+處理不同時間對N2a細胞存活率的影響

2.2 MPP+作用不同時間后N2a細胞中CDR1as基因的表達變化

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D、E組N2a細胞中CDR1as基因的表達水平分別為1.070±0.338、0.207±0.034、0.290±0.039、0.354±0.121和0.368±0.137(n=6)。與對照組比，經(jīng)100 μmol/L MPP+作用3、6、9和12 h的N2a細胞CDR1as基因表達水平明顯降低，差異均具有顯著意義(F=10.010，q=7.003～8.609，P<0.05)。

3 討 論

PD是世界上第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，隨著人口老齡化加劇，發(fā)病人數(shù)逐年增加[1-9]。PD主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元進行性丟失，紋狀體DA含量降低。臨床上主要表現(xiàn)為肌僵直、靜止性震顫、姿勢不穩(wěn)、運動遲緩，影響了病人的生活質(zhì)量[27]。左旋多巴是治療PD的常用藥物，但大多數(shù)病人長期服用左旋多巴后出現(xiàn)不自主運動、認知障礙、癡呆等副作用[28]。因此，尋找新的治療靶點具有重要的意義。近期研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as參與PD的發(fā)病進程，但其確切的機制尚未闡明。

研究表明，CDR1as基因在人和小鼠腦組織中可有效地環(huán)化，而檢測不到線性CDR1as[29]。人源CDR1as基因序列含有74個miR-7結(jié)合位點，小鼠CDR1as基因序列含有130個miR-7結(jié)合位點，且在不同物種間高度保守[21-22,29]。CDR1as與miR-7共同高表達于腦組織神經(jīng)元的胞體和突起，在小腦、中腦、海馬、嗅球神經(jīng)元中均能檢測到CDR1as基因的表達[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as基因在興奮性神經(jīng)元中表達水平較高，CDR1as基因敲除小鼠表現(xiàn)出興奮性突觸誘發(fā)電位功能障礙[29]。在斑馬魚胚胎中過表達人源CDR1as會導(dǎo)致中腦體積縮小，其表型與miR-7缺失相似，且通過補充miR-7前體可部分恢復(fù)中腦體積，提示CDR1as可能是通過與miR-7相互作用，即作為miR-7海綿吸附miR-7而發(fā)揮作用[19]。有文獻報道，在PD病人和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的PD小鼠的中腦黑質(zhì)區(qū)，miR-7的表達均顯著降低，在小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)敲低miR-7，則會導(dǎo)致α-突觸核蛋白積聚并伴有DA能神經(jīng)元的變性丟失，同時紋狀體內(nèi)DA含量顯著下降，提示miR-7可能在α-突觸核蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[31-32]。此外，miR-7在調(diào)節(jié)PD發(fā)病進程中的神經(jīng)炎癥和DA能神經(jīng)元死亡中具有重要作用[33-36]。因此，CDR1as可能通過調(diào)節(jié)miR-7-α-突觸核蛋白軸調(diào)控PD的發(fā)展。本研究應(yīng)用濃度為100 μmol/L的MPP+處理N2a細胞構(gòu)建PD細胞模型，并檢測了CDR1as在不同時間點的變化，結(jié)果顯示，N2a細胞經(jīng)過MPP+處理3、6、9和12 h后CDR1as表達顯著降低，提示CDR1as基因可能間接參與了PD的發(fā)病。

有研究顯示，在CDR1as基因敲除小鼠大腦中，miR-7的表達減少而不是增加，這表明還有其他機制參與了miR-7表達的調(diào)節(jié)[29]。采用CLIP-Seq技術(shù)對miR-7-target RNA-Ago2嵌合體中的靶序列進行分析和排序發(fā)現(xiàn)，無論是在人類還是小鼠大腦中，排在第1位的都是CDR1as基因，排在第2位的是長鏈非編碼RNACyrano，提示Cyrano在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對miR-7具有重要的調(diào)控作用[29]。Cyrano高表達于腦神經(jīng)元的胞體和突起，含有1個與miR-7幾乎完全配對(除第9/10位外)的結(jié)合位點，且該位點高度保守[37]。然而，Cyrano是否通過miR-7在PD發(fā)病中發(fā)揮作用還需進一步探究。

研究表明，在人類和小鼠腦中，CDR1as基因也存在miR-671的結(jié)合位點，miR-671可以近乎完全與CDR1as基因互補配對，隨后與Ago2蛋白結(jié)合，最終實現(xiàn)對CDR1as基因的有效降解，且此相互作用在物種間高度保守，提示這種特異性的相互作用可能具有重要生物學(xué)功能[29,38]。本研究中，N2a細胞經(jīng)過MPP+處理3、6、9和12 h后CDR1as基因表達顯著降低，這一現(xiàn)象是否與miR-671有關(guān)還需進一步研究。

綜上所述，N2a細胞經(jīng)過MPP+處理3、6、9和12 h后CDR1as基因表達水平顯著降低，本文結(jié)果為研究CDR1as基因在PD發(fā)病中的作用提供了實驗依據(jù)。