康楠偉,薛雁,劉翠,陳蕾

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

Apelin是由長(zhǎng)度為77個(gè)氨基酸的前體肽被血管緊張素酶2切割成的不同亞型的生物活性肽，根據(jù)其C末端氨基酸數(shù)量可分為apelin-13、apelin-17和apelin-36等[1-2]。apelin受體屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族[3]。apelin及其受體系統(tǒng)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，apelin與機(jī)體運(yùn)動(dòng)調(diào)控密切相關(guān)[5-6]。丘腦底核是基底神經(jīng)核間接通路和超直接通路中的關(guān)鍵核團(tuán)，在軀體運(yùn)動(dòng)調(diào)控中發(fā)揮重要功能[7]。丘腦底核深部腦刺激可以增強(qiáng)與運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的振蕩活動(dòng)，降低丘腦底核神經(jīng)元的興奮性，改善運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知能力[8]。形態(tài)學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，丘腦底核表達(dá)apelin及其受體，然而內(nèi)源性apelin對(duì)丘腦底核神經(jīng)元放電頻率的影響目前尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)用apelin受體阻斷劑ML221阻斷丘腦底核內(nèi)源性apelin，利用在體電生理記錄方法觀察內(nèi)源性apelin是否參與調(diào)控丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電活動(dòng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。大鼠每籠5只飼養(yǎng)在(22±1)℃的溫控室內(nèi)，給予人工光照(12 h光暗循環(huán))，正常標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。在開始實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品 ML221購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司，烏拉坦購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，滂胺天藍(lán)和乙酸鈉溶液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

腹腔注射烏拉坦1 g/kg麻醉大鼠，將大鼠放置在立體定向框架中，水平固定頭部，切牙桿位于雙耳線下方3.3 mm處。定位丘腦底核(前囟后3.1～4.2 mm，旁開2.0～3.0 mm，顱骨外表面下7.2～9.0 mm)并進(jìn)行開顱手術(shù)。三管玻璃微電極的記錄電極管內(nèi)注入含有20 g/L滂胺天藍(lán)的0.5 mol/L乙酸鈉溶液，其余兩管則分別注入無菌生理鹽水和10 μmol/L的ML221[9]。使用液壓推進(jìn)器將玻璃微電極尖端推至丘腦底核，記錄到神經(jīng)元放電并穩(wěn)定5 min后，通過生物細(xì)胞納升精密注射器將生理鹽水或ML221注射到記錄的細(xì)胞表面。放大器和數(shù)模轉(zhuǎn)換器將生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)后傳輸至計(jì)算機(jī)，用Spike 2軟件進(jìn)行記錄和分析。

以加藥前120 s的平均放電頻率為基礎(chǔ)放電頻率，加藥后反應(yīng)高峰處50 s的平均放電頻率為藥物反應(yīng)頻率。如果藥物反應(yīng)頻率大于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差或小于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)-2倍標(biāo)準(zhǔn)差，則認(rèn)為神經(jīng)元對(duì)藥物有反應(yīng)，否則認(rèn)為神經(jīng)元對(duì)藥物無反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 丘腦底核微量注射ML221對(duì)大鼠神經(jīng)元放電頻率的影響

在記錄到的6個(gè)丘腦底核神經(jīng)元中，微壓力注射生理鹽水后，其放電頻率由(7.44±2.39)Hz變?yōu)?7.56±2.49)Hz(t=-0.346，P>0.05)，放電頻率變化百分?jǐn)?shù)為(4.15±4.77)%。另外記錄到的18個(gè)丘腦底核神經(jīng)元，其基礎(chǔ)放電頻率為(5.39±0.94)Hz。微壓力注射10 μmol/L的ML221可使其中8個(gè)神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率由(7.44±1.41)Hz降低至(1.81±0.32)Hz(t=4.263，P<0.01)；其放電頻率降低百分?jǐn)?shù)為(72.34±6.10)%，與生理鹽水對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.098，P<0.01)。在另外5個(gè)神經(jīng)元中，ML221使細(xì)胞自發(fā)放電頻率由(2.80±0.90)Hz升高至(5.06±2.12)Hz(t=-1.697，P>0.05)，雖然差異無顯著意義，但單獨(dú)分析這5個(gè)細(xì)胞，其加藥后放電頻率均大于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差，故認(rèn)為ML221增加其放電頻率；這5個(gè)神經(jīng)元放電頻率增加的百分?jǐn)?shù)為(64.85±19.86)%，與生理鹽水對(duì)照組比較差異有顯著性(Z=2.739，P<0.01)。在剩余的5個(gè)丘腦底核神經(jīng)元中，注射ML221后，其自發(fā)放電頻率由(3.08±1.51)Hz變?yōu)?3.24±1.56)Hz(t=-2.390，P>0.05)，加藥后放電頻率均小于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差且大于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)-2倍標(biāo)準(zhǔn)差，放電頻率變化的百分?jǐn)?shù)為(8.82±4.38)%。見圖1。

2.2 ML221對(duì)丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率調(diào)控與基礎(chǔ)放電頻率及神經(jīng)元放電模式的關(guān)系

上述ML221引起放電頻率降低的8個(gè)丘腦底核神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率為(7.44±1.41)Hz，而ML221引起放電頻率增加的5個(gè)丘腦底核神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率為(2.80±0.90)Hz，兩組神經(jīng)元自發(fā)放電頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.392，P<0.05)。ML221引起的放電頻率降低(r=-0.409，P>0.05)和增加(r=0.620，P>0.05)與基礎(chǔ)放電頻率沒有相關(guān)性。

根據(jù)放電間隔直方圖和自相關(guān)圖分析，丘腦底核神經(jīng)元分為規(guī)則放電、不規(guī)則放電和簇狀放電3種放電模式。在ML221引起放電頻率降低的8個(gè)神經(jīng)元中，這3種放電模式所占比例分別為12.5%、25.0%和62.5%；而在ML221引起放電頻率增加的5個(gè)丘腦底核神經(jīng)元中，這3種放電模式所占比例分別為20.0%、20.0%和60.0%。

A、B：典型頻率直方圖顯示ML221使不同丘腦底核神經(jīng)元的放電頻率降低(A)或增加(B)；C：柱狀圖顯示ML221和生理鹽水對(duì)丘腦底核神經(jīng)元放電頻率的影響。**P<0.01。

3 討 論

基底神經(jīng)核是包括紋狀體、蒼白球、黑質(zhì)及丘腦底核等核團(tuán)在內(nèi)的皮質(zhì)下一系列核團(tuán)的總稱，其中紋狀體是其輸入結(jié)構(gòu)，蒼白球內(nèi)側(cè)部和黑質(zhì)網(wǎng)狀帶是其輸出結(jié)構(gòu)。輸入、輸出結(jié)構(gòu)之間核團(tuán)的信息交流構(gòu)成兩大經(jīng)典環(huán)路，即直接通路和間接通路[10]。此外，丘腦底核也可直接接受來自興奮性皮質(zhì)和丘腦的纖維投射(即超直接通路)[11]。直接通路提高大腦皮質(zhì)的興奮性，而間接通路和超直接通路則具有相反的作用，三條通路相互協(xié)調(diào)、相互制約以保證運(yùn)動(dòng)的平衡性[12]。

丘腦底核是基底神經(jīng)核最主要的核團(tuán)之一，也是唯一的興奮性核團(tuán)，其神經(jīng)元電活動(dòng)變化在調(diào)節(jié)皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性方面具有重要作用[12]。ARON等[13]于2007年利用功能性磁共振成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)運(yùn)動(dòng)計(jì)劃被終止時(shí)，丘腦底核顯著激活。因此，丘腦底核也被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)中起“制動(dòng)”作用的主要核團(tuán)之一。由此推測(cè)，丘腦底核神經(jīng)元基礎(chǔ)放電頻率的改變，可能通過基底神經(jīng)核內(nèi)的直接通路、間接通路或超直接通路來調(diào)控皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)神經(jīng)元興奮性，最終參與運(yùn)動(dòng)的調(diào)控。

Apelin及其受體系統(tǒng)在大腦、心臟、胃、脂肪組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞等器官組織中均有表達(dá)，具有廣泛而重要的生理功能。KASAI等[5]發(fā)現(xiàn)，apelin缺乏加速肌萎縮側(cè)索硬化癥的病理進(jìn)展。apelin-13能抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)脊髓損傷動(dòng)物的感覺功能恢復(fù)，并增加其運(yùn)動(dòng)行為[6]。本研究觀察到，丘腦底核微量注射apelin受體阻斷劑ML221可改變神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率，提示丘腦底核內(nèi)源性apelin參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性。以往也有研究觀察到內(nèi)源性apelin發(fā)揮重要功能。例如，鞘內(nèi)單次注射apelin受體拮抗劑ML221，可暫時(shí)減少慢性壓榨損傷引起的疼痛過敏[9]；急性應(yīng)激可引起下丘腦室旁核內(nèi)apelin受體mRNA的水平升高，而慢性反復(fù)應(yīng)激則可誘導(dǎo)apelin受體表達(dá)的持久上調(diào)[14]。

本研究觀察到，丘腦底核內(nèi)源性apelin對(duì)神經(jīng)元自發(fā)放電具有雙向效應(yīng)。丘腦底核給予ML221可以引起大部分神經(jīng)元放電頻率降低，提示內(nèi)源性apelin增加神經(jīng)元的興奮性；而在少部分神經(jīng)元，ML221可增加其放電頻率，提示內(nèi)源性apelin抑制其興奮性。之前也有關(guān)于apelin雙向效應(yīng)的相關(guān)報(bào)道。DAI等[15]運(yùn)用膜片鉗技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，apelin-13對(duì)穹隆下器神經(jīng)元具有除極化和超極化的雙向效應(yīng)，這些效應(yīng)似乎分別是由非選擇性陽離子通道和鉀通道的激活而引發(fā)。本研究結(jié)果表明，ML221產(chǎn)生抑制和興奮效應(yīng)的兩組神經(jīng)元的基礎(chǔ)放電頻率存在差異，推測(cè)可能與丘腦底核神經(jīng)元的種類不同有關(guān)。近期的形態(tài)學(xué)研究揭示丘腦底核確實(shí)存在有軸突側(cè)支和無軸突側(cè)支兩種不同類型神經(jīng)元[16]。雖然該文獻(xiàn)同時(shí)報(bào)道了這兩類不同形態(tài)神經(jīng)元的膜電阻、膜電容、動(dòng)作電位幅度和興奮閾值等電生理特性無顯著差異，但是并沒有報(bào)道這兩類神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率是否存在差異。因此，就目前的研究尚不能確定丘腦底核是否存在具有不同自發(fā)放電頻率的神經(jīng)元亞群。但之前有文獻(xiàn)報(bào)道，與丘腦底核有緊密形態(tài)和功能聯(lián)系的蒼白球，其兩類神經(jīng)元(小清蛋白陽性神經(jīng)元和PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1陽性神經(jīng)元)的自發(fā)放電頻率有差異[17]。本實(shí)驗(yàn)室最近的電生理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，apelin-13對(duì)蒼白球神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率調(diào)控亦具有興奮和抑制的雙向效應(yīng)[18]。由上述研究可見，ML221對(duì)丘腦底核神經(jīng)元興奮性的雙向效應(yīng)可能因?yàn)椴煌愋蜕窠?jīng)元介導(dǎo)的信號(hào)通路和離子通道機(jī)制不同。既往研究表明，在不同的細(xì)胞apelin可以激活不同的信號(hào)通路而發(fā)揮不同的作用。例如，激活apelin受體/緩激肽1受體異源二聚體促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化并導(dǎo)致Gαq介導(dǎo)的PKC信號(hào)通路活性顯著增加[19]。而在轉(zhuǎn)染apelin受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中，apelin抑制forskolin誘導(dǎo)的環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)生，提示apelin受體與Gαi有功能性聯(lián)系[20]。apelin在表達(dá)apelin受體的293T細(xì)胞中誘導(dǎo)Akt/PKB的磷酸化，但在沒有表達(dá)apelin受體的293T細(xì)胞中則沒有該效應(yīng)[21]。此外，還有研究觀察到apelin對(duì)血壓也可以發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。apelin-13與其受體結(jié)合，能夠拮抗血管緊張素Ⅱ?qū)ρ艿氖湛s作用，從而舒張血管、降低血壓[22]。而在慢性腎病病人中，apelin-13可以直接引起人臍靜脈血管平滑肌細(xì)胞肌球蛋白輕鏈的增多，從而升高血壓[23-24]。

綜上所述，內(nèi)源性apelin可雙向調(diào)節(jié)丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率，以興奮效應(yīng)為主。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討丘腦底核內(nèi)apelin及其受體系統(tǒng)可能作為運(yùn)動(dòng)相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。