何宇，余雙進，阮和歡，李昉聰，陳海威，黃煬，吳國彬，張逸民，戚芳澤，陳潔，錢行，劉彥含，楊雨瀅，陳彤，張濤，陳宏琿，陳傳寶，趙強，郭志勇，陳國棟，邱江，何曉順（.中山大學附屬第一醫(yī)院器官移植中心，廣東 廣州，50080；.中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州 50080）

在世界范圍內，標準的供體腎臟保存方法是靜態(tài)冷藏。由于供腎來源的減少以及腎臟疾病終末期人群的逐年增加，人們越來越多的使用質量不佳的供腎［1-2］。這些供腎主要來源于擴大 標 準 供 體（extended criteria donors， ECD） 以及心臟死亡捐獻供體（donors after cardiac death，DCD）［3-4］，其對缺血的耐受性低下，常規(guī)的靜態(tài)冷保存導致的缺血/再灌注損傷進一步增加了移植后原發(fā)性無功能（primary nonfunction， PNF）和移植物功能延遲恢復（delayed graft function，DGF）等并發(fā)癥的發(fā)生率，降低了移植腎的存活率［5-6］。因此急需優(yōu)化的策略來保存、改善甚至逆轉受損的供腎。最近，常溫機械灌注（normothermic mechine perfusion，NMP）越來越引起大家的重視［7-9］，相比經(jīng)典冷保存以及低溫機械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）［10-11］，NMP 有其獨特的優(yōu)勢：NMP 能在體外為器官提供接近生理條件的常溫、有氧血流供應，維持接近正常的代謝狀態(tài)，使其既能評估器官活力，亦可減輕或避免冷缺血損傷，甚至修復器官損傷［12-14］。目前有許多移植中心已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了常溫機械灌注的潛力并開展了相應的探索研究，目前該技術還在探索階段，最佳的灌注策略尚無明確共識，相關研究報道較少。因此我們中心進行了9 例的豬腎常溫機械灌注以及1 例的豬肝腎聯(lián)合常溫機械灌注，本文將分享我們中心在腎臟常溫機械灌注中的經(jīng)驗，旨在進一步優(yōu)化NMP 灌注方案，并為進一步的常溫機械灌注相關研究的設計與實施提供指導思路與理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 腎臟和血液的獲取：豬腎和血液的收集來自當?shù)赝涝讏觯◤V州禺山肉類食品有限公司）。按照正常的屠宰場程序放血。采集自體血加入500 ml乳酸鈉林格溶液以及3 支肝素鈉注射液（2 ml：1.25 萬U）抗凝。豬死亡后迅速取出全腹臟器進行冷保存，因屠宰程序導致器官獲取期間無可避免地經(jīng)歷約20 min 熱缺血損傷。隨后在4℃環(huán)境下打開腹主動脈后壁，找到左腎動脈分支處和右腎動脈分支，插入準備好的動脈插管進行冷灌注，這標志著冷缺血（cold ischemic，CI）的開始。冷灌注液為乳酸鈉林格溶液（每1000 ml 乳酸鈉林格溶液加入1 支肝素）或者高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（每500 ml高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液加入半支肝素）。單腎和肝腎聯(lián)合在獲取上的區(qū)別主要是：肝腎聯(lián)合在動脈灌注前需要先經(jīng)腸系膜上靜脈進行冷灌注，在冷灌注準備完成并分離肝腎組織保留右腎和肝后，需要對膽道及輸尿管進行插管并固定。

1.2 體外NMP：我們中心采用體外機械灌注系統(tǒng)（Organ Assist， Groningen， The Netherlands）對離體腎臟進行NMP。具體操作細節(jié)可參考本中心過往的研究［15-16］。NMP 灌注液成分：豬自體全血500 ml，乳酸鈉林格溶液500 ml，3 支肝素，羥乙基淀粉500 ml，甲硝唑注射液100 ml，復方氨基酸注射液100 ml，甘露醇100 ml，葡萄糖酸鈣注射液10 ml，甲強龍40 mg，頭孢哌酮舒巴坦2 g。開始灌注前將灌注液加入灌注管路，排除管路中氣泡，調節(jié)恒溫水浴箱水溫為38 ℃，開啟灌注機灌注模式，待循環(huán)充分后檢測灌注液的電解質、酸堿水平并將之調整至生理范圍。隨后將冷保存的腎臟轉移至灌注器官盆，迅速將動脈插管置入腎動脈并固定，將灌注壓力調整至70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），開始常溫機械灌注。灌注過程中，根據(jù)NMP 灌注液生化電解質水平變化補以適量的氯化鈣溶液、氯化鉀溶液；根據(jù)NMP 灌注液中的葡萄糖濃度和酸堿度補以適量的5%葡萄糖溶液和碳酸氫鈉溶液；給予等量的乳酸鈉林格溶液-滅菌水混合液補充每小時丟失尿量，乳酸鈉林格液-滅菌水混合液的比例根據(jù)尿量及灌注液的電解質水平進行調整。

1.3 灌注時長以及觀察指標：我們統(tǒng)一選取灌注9 h 作為灌注終點，分析9 h 的灌注數(shù)據(jù)；若在灌注過程中發(fā)現(xiàn)灌注情況良好，則會延長灌注時間直至無尿，但在統(tǒng)一分析時仍分析灌注9 h 內的數(shù)據(jù)。根據(jù)制定的試驗方案對灌注的壓力、流速、尿量以及每小時灌注液和1、3、6、9 h 尿液的血氣生化數(shù)據(jù)進行了記錄分析。留取了腎外觀以及尿液外觀照片，并在實驗零點和終點對腎臟穿刺并行HE 病理染色分析。灌注過程中，外觀上觀察腎臟的顏色質地變化以及尿液的顏色變化；納入分析的主要灌注參數(shù)包括：腎動脈流速、腎動脈灌注壓、每小時尿量以及灌注時長、氧分壓（oxygen partial pressure，PaO2）、二氧化碳分壓（partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、PH 值、乳 酸（lactate，LAC）、葡萄糖水平以及鈉、鉀、鈣等離子濃度。病理穿刺標本則采取HE 染色觀察腎小球及腎小管急性炎癥與損傷程度。

1.4 生理生化指標［14-15］：表1 為豬的生理生化指標。

表1 豬的生理生化指標

2 結 果

共進行了10 例腎臟灌注，對10 例腎臟灌注按實驗開展順序予以1 ～10 編號，其中4 號腎臟為肝腎聯(lián)合灌注。對灌注情況進行描述性分析。

2.1 尿量變化（圖1）：每小時分段收集尿液進行分析。所有的腎臟均產生尿液，外觀從透明到淡紅不等。其中6 號豬腎灌注全程無明顯肉眼血尿。6 號豬腎灌注時長最長，第14 小時的每小時尿量為30 ml。大多數(shù)腎臟灌注尿量在3 h 左右達到峰值，隨后逐漸降低。本中心在臨床上開展的3 例無缺血腎移植的體外NMP 結果也顯示灌注第3 小時尿量有所下降。各組之間尿量差異較大。8 號豬腎灌注3 h 后出現(xiàn)異常高值且無規(guī)律，且尿液顏色為深紅血色，考慮可能存在穿刺導致血管-小管瘺。肝腎聯(lián)合灌注組尿量較單腎灌注組尿量少，考慮可能是肝臟容量大導致灌注液總量相對偏少，循環(huán)灌注不足所致。

圖1 腎臟灌注期間每小時尿量（ml）

2.2 腎臟灌注前、后的外觀（圖2）：10 例腎臟體外常溫機械灌注中，6 號腎臟灌注時長最長為16 h，該例腎臟灌注全程無明顯肉眼血尿。6 號腎臟豬腎灌注情況良好，上機5 min 后可見豬腎表面均勻紅色充盈，腎臟表面富有張力。6 h 后腎外觀顏色變暗，呈暗紫色，結合血氣分析指標以及尿液分析指標考慮腎的保鈉排鉀排酸功能下降，腎功能開始下降。同時發(fā)現(xiàn)灌注液顏色也變暗，因此不排除灌注液顏色變化導致的腎外觀變化。16 h 下機后的腎臟剖面顯示腎盂腎盞出血明顯，腎皮髓質有輕微血色，考慮出血；腎皮髓質質感軟綿疏松，結合病理考慮腎損傷情況較為明顯。選取9 號豬腎代表灌注時長為9 h的腎外觀情況，可以看見腎臟灌注9 h 后普遍出現(xiàn)腎盂腎盞出血現(xiàn)象，腎皮髓質出血點較為明顯，質地明顯變差。而肝腎聯(lián)合灌注9 h 后腎臟剖面顯示腎盂腎盞出血不明顯，腎皮髓質無血色，質地較為正常。

圖2 腎臟灌注外觀及灌注終點剖面觀

2.3 腎動脈壓力和流速（圖3）：腎動脈壓力通過改變泵速來調節(jié)，灌注過程的動脈壓保持在65 ～70 mmHg。正常灌注流速在灌注初始階段逐漸升高，并在第2 小時達到峰值，隨后保持穩(wěn)定水平。這與本中心發(fā)表的一篇關于人棄腎長時間體外常溫機械灌注經(jīng)驗探索的文章的結果相符合。多數(shù)豬腎灌注流速穩(wěn)定后的平均水平為100 ml/min 左右。2 號豬腎流速穩(wěn)定后維持在150 ml/min 左右。肝腎聯(lián)合灌注流速迅速升高，第30 分鐘到達頂峰190 ml/min 左右，第2 小時開始逐漸下降，考慮可能因肝臟容量較大，間接導致循環(huán)容量不足進而使腎臟灌溉不足有關。

圖3 腎臟NMP 期間流速

2.4 灌注液血氣變化（圖4）：在NMP 過程中，PaO2基本穩(wěn)定維持在350 ～ 450 mmHg；而PaCO2各組間差別較大，且部分腎臟灌注期間PaCO2的波動范圍也較大。在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)PaO2和PaCO2的變化主要受制氧機的供氧流量與濃度的影響，后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)根據(jù)pH 值變化相應地調節(jié)制氧機供氧流量就可以將pH 值控制在相對生理范圍。灌注液pH 在灌注初始階段大都持續(xù)上升，部分豬腎灌注液pH 則在灌注早期出現(xiàn)pH 下降，并均在第2 小時后逐漸趨于穩(wěn)定而隨著實驗的方案的改進，現(xiàn)在已經(jīng)可以將腎臟pH 控制在正常生理范圍。肝腎聯(lián)合組pH 基本波動在正常范圍。根據(jù)PaCO2以及堿剩余可以發(fā)現(xiàn)多數(shù)灌注腎臟呈代謝性或呼吸性堿中毒；而肝腎聯(lián)合、2 號豬腎出現(xiàn)代謝性酸中毒。

圖4 灌注液氧分壓、二氧化碳分壓與酸堿水平

我們對灌注液中Na+/K+/Ca2+離子水平進行了動態(tài)檢測。多數(shù)豬腎灌注Na+逐漸升高，3 ～ 4 h開始逐漸下降，隨后達到穩(wěn)定水平，穩(wěn)定期基本上接近正常值范圍；肝腎聯(lián)合組的Na+波動較小，穩(wěn)定后濃度位于正常范圍。灌注半小時內Ca2+于1.5 下降至1，隨后開始升高，后穩(wěn)定維持在1.5 ～2 mmol/L?；€K+濃度偏低，通過人為干預基本可維持在正常水平。少數(shù)偏離值出現(xiàn)均是因為額外補鉀所致（圖5）。

圖5 灌注液電解質水平

灌注過程中血糖逐漸升高，灌注2 h 后達到峰值，隨后逐漸下降，提示常溫灌注過程中持續(xù)有能量消耗。2 號豬腎、3 號豬腎血糖偏離值產生的原因是臨時補充葡萄糖。肝腎聯(lián)合組的血糖較單腎灌注組的高，可能原因是1 h 時補了葡萄糖酸鈣。單腎灌注的乳酸水平呈升高趨勢，肝腎聯(lián)合的乳酸水平逐漸降低（圖6）。

圖6 乳酸與葡萄糖水平

2.5 病理變化（圖7）：對灌注零點、灌注1 h、灌注3 h、灌注6 h、灌注終點的腎穿刺組織標本進行HE 病理染色。由于腎臟為受過嚴重熱缺血損傷的AKI 腎臟，腎臟零點病理普遍存在腎小管上皮細胞腫脹，腎小球體積稍增大；腎臟灌注終點病理普遍存在輕度腎小球炎以及急性輕-中度腎小管損傷改變。染色病理結果顯示小球及小管的損傷在灌注過程中緩慢加重，這提示常溫機械灌注可能延緩了小球及小管損傷的進展。有趣的是，9 號腎臟的病理結果顯示腎小管上皮刷狀緣脫落的程度逐漸減輕，這提示NMP 可能對AKI 腎臟存在一定的修復作用。

圖7 腎臟穿刺組織切片HE 染色（HE×200）

3 灌注過程遇到的問題以及解決方法

由于NMP 腎臟灌注還處于探索階段，具體的方案流程還需要逐步完善，現(xiàn)在將實驗中遇到的問題以及解決辦法進行匯報。第1 例腎臟灌注預試驗人員操作不熟練，沒有尿液生成。因此我們建立了標準化的灌注流程，減少人為操作帶來的誤差；調整血氣基線水平，使基線值維持在生理范圍。在灌注過程這個，我們還遇到pH 持續(xù)偏堿無法調節(jié)的情況。通過調節(jié)制氧機流量，使pH維持在生理范圍。若冷灌注過程中發(fā)現(xiàn)腎臟冷灌注情況不佳，結合腎臟外觀考慮腎可能出現(xiàn)微血栓時，可以通過提高腎修整速度，減少熱缺血時間；若腎臟血管情況復雜可直接從主動脈灌入冷灌注液，從而減少熱缺血時間。在灌注過程中若發(fā)現(xiàn)腎動脈流速持續(xù)偏低，且腎外觀疑似血栓，可以注入尿激酶溶栓處理。

4 討 論

常溫機械灌注技術已經(jīng)較為成熟，但是在腎臟方面的應用還比較少，臨床上的腎移植術前供腎保存方法基本上還是傳統(tǒng)的冷保存，在臨床腎移植中NMP 的應用鮮有報道，缺乏多中心的隨機對照試驗［16-18］。NMP 在腎移植領域應用遠遠落后于肝移植的原因可能是因為傳統(tǒng)的冷保存技術非常成熟便捷，且從長遠預后來看，NMP 比起冷保存并無明顯優(yōu)勢［8，13，19-20］。但有研究證實NMP 可以在邊緣供腎的修復和保存發(fā)揮作用［1，21-23］，這提示NMP 有望擴大供腎來源，提高終末期腎病患者的腎移植率以獲得更好的預后和生活質量。而且NMP 灌注腎臟非常有研究前景，在穩(wěn)定模擬人體正常腎臟生理活動的情況下，NMP 腎臟灌注可以成為器官體外干預、器官體外評估或體外藥物試驗平臺。然而腎臟NMP 目前仍處于早期摸索階段，為此需要盡可能延長NMP體外灌注腎臟時長，這也是本研究的主要目的之一。

整體灌注質量分析。根據(jù)10 例的腎臟灌注，初步得到以下經(jīng)驗小結。腎臟觀測指標的基線水平對腎臟灌注的影響較大。因此在灌注前需要將腎臟各項觀測指標的水平調整至正常的生理范圍。本研究結果顯示，大多數(shù)腎臟灌注時長可以穩(wěn)定在9 h 左右；灌注液的血氣水平可以通過人為干預維持在相對正常水平。肝腎聯(lián)合組灌注液比起其他組顯示出更為正常且穩(wěn)定的生化指標，但是尿量較少，可能需要增加灌注液的容積，并監(jiān)測腎小球動脈壓以確保腎臟能擁有足夠的灌注。隨著灌注方案的完善以及實驗人員操作熟練程度的提高，目前灌注可以通過以下兩個方面的處理使血氣生化維持在相對正常生理范圍：根據(jù)尿量補充等尿量的林格-滅菌水混合液以維持灌注系統(tǒng)容量電解質平衡。通過調節(jié)制氧機氧氣管夾調節(jié)氧流量，從而使pH 穩(wěn)定在相對正常范圍。通過人工調節(jié)灌注液血氣生化以及電解質可以使灌注液維持在一個正常的生理濃度，但同時也導致無法單純通過灌注液的生化水平直接反應腎臟代謝功能，這需要結合尿液的血氣電解質水平來綜合判斷腎臟功能。同時，若想探究影響腎臟灌注的具體因素，可能需要通過更多的灌注例數(shù)來尋找相關因素。

評估腎臟情況除了觀察灌注流速、尿量、腎外觀、尿液性狀外，還應根據(jù)灌注液和尿液的血氣結果綜合分析。我們嘗試了1 例肝腎聯(lián)合灌注，發(fā)現(xiàn)在同樣的實驗方案以及實驗人員下，肝腎聯(lián)合灌注過程中的生化指標更正常且穩(wěn)定，肝腎聯(lián)合LAC 水平逐漸降低，符合肝臟對乳酸的代謝作用，而單腎灌注中LAC 水平不斷升高。但我們發(fā)現(xiàn)肝腎聯(lián)合的灌注時長以及尿量對比單腎灌注并沒有明顯優(yōu)勢，提示乳酸可能對腎臟沒有明顯影響；此外，灌注液中的乳酸水平比尿液中的略高，提示腎臟能夠排泄部分乳酸。觀察灌注中流速的變化趨勢可以得知一般灌注流速均逐漸升高，在第2 小時到達頂峰，隨后穩(wěn)定在100 ml/min 水平。同時我們還發(fā)現(xiàn)，雖然流速可以在灌注前期反映腎臟的灌注情況，但是在后期流速會逐漸升高且穩(wěn)定在一個水平，通過腎臟剖面與病理分析提示其并不能反映腎臟即時的灌注情況。我們發(fā)現(xiàn)，多數(shù)灌注腎臟尿量在3 h 左右到達頂峰，隨后逐漸降低，結合灌注液以及尿液中的血氣生化電解質水平，考慮腎臟的排泄功能在灌注3 h 后開始下降。這也提示無尿作為單一研究終點可能存在不合理性，對我們后期灌注的研究終點選定提供了依據(jù)。現(xiàn)階段的實驗為探索性實驗，常溫機械灌注為心死亡離體腎臟提供接近生理狀態(tài)的環(huán)境，與生理狀態(tài)還存在一定差異。在灌注過程中腎臟所需要的能量主要通過補充葡萄糖維持，其余一些腎臟存活工作所需的關鍵因子及能量營養(yǎng)物質還在探索過程當中。

后續(xù)實驗應針對影響灌注時長的具體因素進行設計，同時因為實驗用豬為商品化豬。在本研究中，每頭豬的熱缺血程度不一致，因此每例腎臟灌注的情況差異較大。但是豬的雙側腎為天然的對照，這為我們進行嚴謹?shù)膶嶒灧桨冈O計提供了可能性。接下來的研究重點將關注對腎臟灌注影響關鍵因素的探索，以及探究尿激酶對血栓腎臟的作用情況探究，同時也可以對腎臟進行腎祖干細胞灌注，觀察腎祖干細胞對AKI 腎臟的修復作用。

綜上所述，NMP 對AKI 腎臟可能具有一定的修復作用，其有望擴大供腎來源，提高終末期腎病患者的腎移植率以獲得更好的預后和生活質量。結果顯示肝腎聯(lián)合的腎外觀以及LAC 水平較單腎結果好，但是灌注時長、尿量以及病理結果并無優(yōu)勢。進一步的結論需要更多的例數(shù)進行支持。目前國內的腎臟體外常溫機械灌注仍處于起步階段，各種實驗細節(jié)仍需完善。我們團隊通過對豬腎體外常溫機械灌注的初步探索，為后續(xù)的實驗設計奠定了基礎，提供了依據(jù)，也為國內同行提供一些新的研究思路。