梁誠，滿江衛(wèi)，鄧然，楊立（蘭州大學第二醫(yī)院泌尿外科，甘肅 蘭州，730030）

臨床上日益增長的器官移植需求與供體短缺之間的矛盾嚴重制約了器官移植事業(yè)的發(fā)展，擴大供體來源并提高有限器官資源的利用率是全社會亟待解決的重大問題，目前最有希望的策略是提高邊緣移植物的利用率［1-2］。邊緣器官是指來自擴大標準供體（extended criteria donor，ECD）和心臟死亡器官捐獻（donation after circulatory death，DCD），而不是標準供體（standard criteria donor， SCD）。這些器官大多在獲取前均存在不同程度的原發(fā)性病理損傷（如脂肪變性）或經歷較長的缺血缺氧性損傷［3］。邊緣器官的納入雖然一定程度上緩解了器官資源的緊缺，但在實際臨床工作中常常因為考慮到移植物存活率和受者的安全性而放棄一些邊緣器官的移植，此外還有一部分邊緣器官由于沒有合理的保存、評估和維護措施而丟棄，造成一定的資源浪費［4］。因此，需要不斷探索更加先進的器官保存、評估和修復方法以滿足臨床需求。

由于低溫可以降低組織代謝水平，提高器官對缺血的耐受性，人們認識到最早的器官保存方法是將離體的器官放置在冰鹽水中以延長保存時間。此后不久，相繼開發(fā)出不同的器官保存液以優(yōu)化保存方案，直到今天這種靜態(tài)冷保存（static cold storage，SCS）的方案仍作為金標準在臨床廣泛使用［5］。雖然SCS 已經使來自標準供體的器官移植產生了良好的結果，但由于邊緣器官自身的問題，冷保存后的器官更容易早期移植物功障礙、原發(fā)性移植物無功能、移植物功能延遲恢復、缺血性膽管病等術后并發(fā)癥，影響移植預后［6］。器官資源短缺的現(xiàn)狀推動了新型、更先進的器官保存技術的發(fā)展，以增加這些次優(yōu)資源的可用性。基于機械灌注（machine perfusion， MP）的器官保存策略可以集保存、轉運、術前評估、修復于一體，目前已經受到移植領域的廣泛關注［7-10］。

1 亞常溫機械灌注的理念

目前，臨床上比較成熟的機械灌注方案多使用低溫機械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）和常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP），雖然已經明顯改善一些移植物的活力，但在實際應用中仍出現(xiàn)一定的弊端。HMP 作為最早的機械灌注方案，可以在保存過程中降低組織的代謝水平，同時通過循環(huán)灌注去除代謝廢物并保持血管內流體剪切力的穩(wěn)定和減輕內皮糖萼損傷［11］。然而，一個尚未解決的問題在于長時間的冷保存引起細胞對移植后溫差變化的敏感性，并由此導致器官實質細胞線粒體功能障礙和促凋亡信號轉導，這種“復溫性損傷”可能是導致器官再灌注損傷和移植物功能障礙的潛在誘發(fā)因素［12］。雖然NMP 可能比HMP的灌注效果有所改善，但它仍然使缺血后的器官暴露于快速升溫的環(huán)境，同時保存溫度的提高意味著器官更高的代謝水平，因此，需要特定供氧載體和灌注液來維持器官組織的有氧代謝，阻礙了其廣泛應用于臨床［13］。鑒于此，有學者提出亞常溫下的機器灌注模式（subnormothermic machine perfusion，SNMP），該方案克服了低溫下的器官代謝緩慢與生理溫度下高代謝引起的組織缺氧，可以在延長器官保存時間的同時使移植物維持相對較高的生理代謝水平［13］。

2 SNMP 的優(yōu)勢

作為一個有效的綜合性器官保存系統(tǒng)，SNMP可以通過以下方式擴大有限的供體庫：① 通過維持器官保存期間所需代謝物質的正常補給，延長器官保存時間；② 模擬體內灌注環(huán)境，清除器官中的微小血栓、去除有害代謝廢物、改善微循環(huán)，這在一定程度上對供體器官起到了修復作用；③ 可以在近生理狀態(tài)下對灌注液和器官排泄液的相關指標進行多組學分析，構建移植指數(shù)，更加精準地評估器官是否適合移植；④ 通過多維度的分析數(shù)據(jù)，對器官采取有針對性的干預措施，改善邊緣器官的質量；⑤ 室溫下的SNMP 通過消除對溫度控制的需要而提高了設備的便攜性，同時受益于亞生理溫度下較低的代謝需求，可以簡化甚至消除供氧系統(tǒng)，因此更加便捷技術的應用和推廣。

3 SNMP 的組成

SNMP 裝置提供了一個封閉保存環(huán)境，能夠在無菌條件和特定溫度下（廣義的亞常溫一般指溫度為20 ～30℃）通過灌注泵來模擬體內血供環(huán)境，其主要組成部件包括滾輪泵、氧合器、灌注液、器官保存室和循環(huán)回路檢測裝置等。灌注液作為機器灌注中的載體，通過對其成分進行分析或適當改造，還可以使SNMP 具備器官活力評估和修復的功能。

4 SNMP 在器官移植中的應用

作為最新的器官保存技術，體外SNMP 技術正在進行臨床轉化，并且已經在邊緣器官保存、評估和修復方面展現(xiàn)出一定優(yōu)勢。

4.1 邊緣器官保存：在DCD 動物腎移植模型中，Hoyer 及其同事評估了CS、低溫氧合機械灌注（oxygenated hypothermic machine perfusion，HMPox）和SNMP 3 種技術的短期保存效果，結果顯示，與HMPox 和SCS 相比，使用SNMP 保存7 h 后供腎血流量和尿量顯著增加，且與金標準CS 相比，SNMP組肌酐清除率增加了10 倍，組織學標本檢查也顯示出亞常溫機械灌注更好地保留了腎組織的結構完整性［14］。Ciria 等［15］將廢棄的人體肝臟應用于SNMP研究，雖然最終無法確定移植后效果，但反應肝臟活力的指標如乳酸水平的下降和膽汁排出量明顯改善已經說明SNMP 裝置在挽救嚴重邊緣肝臟方面的潛力。肝臟脂肪變性增加了肝臟對缺血/再灌注的敏感性，且和移植術后并發(fā)癥的發(fā)生率顯著相關。與金標準冷保存相比，SNMP 可以明顯改善中度脂肪變性肝細胞的氧化應激和組織炎癥［16］，降低肝酶水平，電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)SNMP 減輕了保存過程中的肝竇內皮細胞和肝細胞的線粒體損傷，成功保護中度脂肪肝免受保存/再灌注損傷［17］。在另一項基于大鼠肺移植模型的研究中，Arni 等［18］對冷缺血后的肺臟進行4 h 體外肺灌注（ex vivo lung perfusion，EVLP ）并進行移植，以探究亞常溫下的肺保存效果。與常溫灌注相比，亞常溫下的體外肺灌注改善了肺動態(tài)順應性和血管阻力，并減少了組織炎癥反應，從而說明亞常溫EVLP 具有減輕移植過程中缺血/再灌注損傷的作用。此外SNMP 和其他保存方案的聯(lián)合使用也展現(xiàn)出更好的潛力［19-20］。通過將臨床上判定為不適合移植的肝臟在-4℃下過冷儲存，在過冷的預處理和復溫階段使用SNMP，可以有效地將器官的體外保存時間延長到27 h，并可以達到移植的標準［21］。因為不同研究之間的器官質量和灌注方案存在差異，也導致一些研究得出了不同結果［22］。為此Huang 等［23］建立了一個體外劈離式肝臟灌注模型，該模型允許同時灌注左右葉，并將一個葉作為另一個的對照，有效避免了以往研究中因研究器官的異質性帶來的問題。目前研究發(fā)現(xiàn)，SNMP 可以通過改善保存期間器官微循環(huán)障礙，減輕炎癥反應，維持實質細胞線粒體功能穩(wěn)態(tài)和減輕氧化應激反應從而增加邊緣器官對缺血/再灌注過程的耐受。

4.2 邊緣器官的評估：除了提供良好的保存環(huán)境和減輕缺血/再灌注損傷外，SNMP 還為評估器官狀態(tài)提供了更加客觀可靠的平臺。以往判斷器官移植的適宜性是根據(jù)臨床經驗確定的評分體系，這些評分指標已被證明和移植物成活率和術后并發(fā)癥相關，每個移植中心都有自己的判斷標準，很難大范圍推廣使用［24］。而結合機械灌注參數(shù)的評估，如灌注流量和阻力參數(shù)、分析循環(huán)灌注液中的一系列生物標志物等，可以為臨床醫(yī)生提供更客觀的參考。在幾項研究中，器官灌注阻力顯示出在評估器官質量和功能的潛力，灌注期間較低的灌注阻力與再灌注期間的更好的功能相關［25］。然而，盡管這些灌注參數(shù)可以一定程度上反映器官的損傷程度，但它們確定移植后效果的可靠性有限。器官組織的代謝物可反映體內的生理和病理狀態(tài)，應用組學的研究方法對代謝產物中進行分析，既可以區(qū)分同種不同個體之間功能差異，同時還可以了解生物體在應激狀態(tài)下的代謝變化，以便改善器官的代謝情況。國外有學者通過對灌注液的代謝組學分析將具有相似代謝模式的器官進行聚類，從而篩選出更適合的器官進行移植［26］，有利于提高移植的成功率。在機器灌注期間，還可以通過對移植物代謝產物的組學數(shù)據(jù)分析可以更好地闡明器官保存和恢復中涉及的病理生理變化，探索這些機制將有助于發(fā)現(xiàn)新的干預靶點，從而用于在移植前進行精準器官治療［27-28］。器官學研究領域的未來工作可以結合機械灌注開發(fā)用于分析的多組學數(shù)據(jù)計算平臺，包括轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學數(shù)據(jù)，以更好地構建邊緣器官地移植指數(shù)，提高移植的成功率。

4.3 保護和修復邊緣器官：在體內，要實現(xiàn)對特定器官的治療往往需要借助全身給藥，特異性較低，同時在確保療效的同時又需要增加藥物的劑量，對其他器官也產生額外的損傷。而基于SNMP 平臺的藥物治療通過對灌注液的成分進行合理改造，如添加干細胞及其外泌體、基因治療、小分子抑制劑、代謝產物補充及有效載體等方法。直接將藥物遞送至靶器官，有效避免了全身治療帶來的不良反應，更好地發(fā)揮SNMP 的器官修復作用。

4.3.1 間充質干細胞及其外泌體：間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類來源廣泛、具有強大免疫調節(jié)和組織再生功能的一類干細胞，近年來在器官移植領域引起了廣泛關注［29-31］。最初認為 MSCs 分化為各種細胞類型的潛力對其治療效果起著關鍵作用，但后來的體內研究發(fā)現(xiàn)，通過靜脈輸注MSCs 后，只有少部分保留在靶器官中，且體內存活時間短，很難發(fā)揮其直接修復作用［32］；雖然增加劑量可以一定程度上解決這個問題，但微血管栓塞的風險和對其他器官的不良反應也會增加［33］。SNMP 可以為 MSCs 相關治療提供一個理想的平臺，通過在灌注液中加入MSCs，克服體內治療的特異度較低的問題，進而達到直接修復靶器官的目的［34］。近年來研究發(fā)現(xiàn) ，MSCs 還可以通過旁分泌調控機制在器官移植過程中發(fā)揮保護作用，其中細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是其分泌的主要功能單位［35］。EVs 包括外泌體和微泡，是一種由mRNA、miRNA、大量蛋白質和脂質等物質組成的囊泡狀物質，參與細胞間信號調控。作為細胞療法的新型替代品， EVs 可以長期存貯并維持其功能，且和灌注液具有更好的兼容性，因而未來具有更廣闊的應用前景。

4.3.2 基因治療：器官基因工程治療可以通過特異性調節(jié)移植物內基因來實現(xiàn)對移植物功能的調控。慢病毒載體作為一種成熟的基因調控手段，可以實現(xiàn)對細胞和組織的永久性基因改造，然而目前臨床應用中除了難以實現(xiàn)純化和引起全身不良反應的可能性，體內導入時因缺乏特異性并且產生脫靶效應也是一大技術障礙。而在離體器官灌注期間，慢病毒載體介導的基因調控可能提供一種可以穩(wěn)定生產基因工程器官的方法［36］。內皮系統(tǒng)參與并調節(jié)器官功能的多個過程，如炎癥或血栓形成等。腎血管內皮上的HLA 表達作為強烈的抗原刺激，同時是同種異體免疫應答的主要驅動因素和靶標。國外有學者在大鼠腎移植模型中使用RNA 干擾技術下調MHC-Ⅰ類和Ⅱ類轉錄序列，顯示攜帶特定RNA 序列的慢病毒成功誘導MHCI 類和MHCII 類轉錄產物持續(xù)穩(wěn)定下調［37］。作為一種降低移植物免疫原性的策略，該方法可以有效減少免疫抑制劑的用量，甚至誘導受體對移植物的免疫耐受性。

4.3.3 抑制劑干預：最近的研究已經注意到器官保存過程中產生的炎癥分子的存在，并且可能隨著灌注時間的延長而逐漸積累。有學者發(fā)現(xiàn)，在MP 期間炎癥細胞因子的積累歸因于組織常駐白細胞的釋放。此外，在保存過程中受損的移植細胞將各種損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）釋放到灌注液中，并與上調的模式識別受體（toll-like receptors， TLR）結合，啟動具有放大效應的炎癥反應［38］。未來可以通過去除循環(huán) DAMP 和細胞因子、抑制 TLR 信號傳導和選擇炎癥小體的特異性抑制劑來減輕這種炎癥反應。

4.3.4 代謝產物的補充：器官移植過程中伴隨著移植物代謝狀態(tài)的改變，而改善移植物功能的一種潛在方法應用代謝組學數(shù)據(jù)對其進行分析，并靶向其病理性代謝過程。通過對亞常溫機械灌注后的脂肪肝進行代謝組學分析，盡管接受SNMP 的脂肪肝能夠增加ATP 和能量電荷比率，然而脂肪肝表現(xiàn)出谷胱甘肽合成障礙［39］。作為體內重要的抗氧化劑，其合成受損可能增加脂肪肝的氧化應激水平。因此在灌注液中額外補充抗氧化劑，如谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸或維生素E，以緩沖再灌注期間的谷胱甘肽消耗，減輕氧化應激水平［40］。

4.3.5 氧氣載體：氧合在低溫機械灌注中表現(xiàn)出有利的效果，并且在常溫機器保存中是必需的，而對于在SNMP 中使用氧載體是否有益，目前還沒有達成一致的結論。有學者認為，隨著機械灌注溫度的升高，器官需氧量增加，因此，為了維持保存期間的代謝供應，有必要在保存系統(tǒng)中引入一個氧載體［41］。在部分研究已經看到含有攜氧載體灌注液的良好效果。最初的氧載體使用血液作為灌注液，但很快發(fā)現(xiàn)具有局限性，包括血型匹配、長時間的機械灌注導致的紅細胞破裂和潛在病原體的存在等缺點［13］，為此，研究者正在探索更加經濟高效的氧載體。Shonaka 等［42］將血紅蛋白囊泡作為氧載體加入到UW 溶液中，并對豬DCD 肝臟進行SNMP，這種方法改善再灌注期間肝臟的功能。還有部分研究采用了基于動物血紅蛋白設計的氧載體（hemoglobin oxygen carrier，HBOC）。HBOC 是聚合血紅蛋白，它與所有血型相容，不含任何傳染性病原體，并且在室溫下穩(wěn)定至少3 年。Fontes 等［43］在豬肝移植模型中研究了SNMP 與 HBOC 溶液組合方案的灌注效果，多組學分析的證據(jù)表明，該方案能明顯改善肝臟的炎癥表型，增強肝細胞再生能力，并使得肝細胞的代謝活動轉向正常。新型的全氟化碳氧載體（perfluorocarbon-based oxygen carriers，PFCOC）在生物學上是惰性的，在體內具有相對較短的半衰期（12 ～ 24 h），同時能夠溶解大量的氧氣，并且由于分子量小，對于最微小的毛細血管也可以達到良好的灌注效果，目前已被開發(fā)用于灌注體系內的氧氣運輸。搭載有PFCOC 的SNMP 體系顯著改善了肺組織通氣功能和氧合指數(shù)，降低炎癥相關標記物［44］。

4.3.6 適宜的灌注液：盡管威斯康星大學（UW）冷藏溶液是最常用的沖洗溶液，并且在亞常溫機械灌注的應用中也展現(xiàn)了良好的兼容性。但近年來發(fā)現(xiàn)其高黏度可能導致潛在的移植物灌注不良，此外，UW 中的羥乙基淀粉對紅細胞產生過度聚集作用，妨礙了器官中紅細胞的完全洗脫。因此未來仍需針對亞常溫機械灌注開發(fā)出更加適宜的灌注液［45-46］。

4.3.7 抗菌藥物：術后感染在器官移植中很常見，且已經成為術后患者死亡的主要原因［47］。在亞常溫下，器官保存溶液中的高細菌污染的風險進一步增加，可能與供體器官中的內源性細菌相關或在獲取過程中的外源性病原體引入［48］。除了在器官置入時的無菌操作外，同時需要選擇合適的抗菌藥物進行預防。理想的抗菌藥物除了具備有效抑制微生物生長，同時不會對器官造成額外的損害。有研究指出，1000 μg/ml 頭孢唑啉具有覆蓋灌注期間可能的機會性感染，在亞常溫保存期間具有殺菌作用，且可以維持較長時間［49］。更加科學的方法是留取器官灌注液進行的微生物培養(yǎng)，根據(jù)藥敏結果指導后續(xù)抗菌藥物的使用。

5 總 結

使用邊緣器官來擴大可用供體庫是一種有效的措施，可以在一定程度上緩解全球“器官資源”緊缺的現(xiàn)況，然而我們必須對這些資源進行妥善保存、精準評估和系統(tǒng)優(yōu)化，以實現(xiàn)最大化利用。機械灌注已經在邊緣器官保存過程中發(fā)揮重要的作用，基于亞常溫的機械灌注作為一種新的技術方案為移植醫(yī)生提供了更多的選擇，而更簡化的技術將有助于其推廣應用。未來還需要進一步開展更多的基礎和臨床研究，以優(yōu)化灌注程序，造福更多等待器官移植的患者。