歐志宇，苗蕓（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院器官移植科，廣東 廣州 510515）

腎移植通常是終末期腎病首選的治療方法［1-2］。然而，在全世界范圍內(nèi)，腎源短缺成為腎移植的主要障礙。為了滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求，越來(lái)越多擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)捐贈(zèng)者（expanded criteria donor，ECD）和心死亡后捐贈(zèng)者（donation after cardiac death，DCD）來(lái)源供腎被用于移植。然而，與標(biāo)準(zhǔn)捐贈(zèng)者（standard criteria donor，SCD）供腎相比，ECD 或DCD 供腎質(zhì)量較差，更容易遭受缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI），導(dǎo)致移植腎功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）、急性排斥風(fēng)險(xiǎn)增加以及移植物存活率降低。為減少I(mǎi)RI，提高供腎質(zhì)量，改善患者預(yù)后，需要采取更好的器官保存策略。機(jī)械灌注（machine perfusion，MP）技術(shù)的發(fā)展為器官保存帶來(lái)新的前景，其在多個(gè)方面顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)保存方法的優(yōu)勢(shì)，特別是在保存期間治療和修復(fù)器官的潛力［3］。多種治療干預(yù)措施已被用于MP 期間的器官，其中，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stromal cell，MSC）因其抗炎、再生和免疫調(diào)節(jié)作用而被認(rèn)為是一種很有潛力的治療策略［4］。本文總結(jié)了MP和MSC 在腎移植中的進(jìn)展，并強(qiáng)調(diào)了這兩者聯(lián)合在未來(lái)改善實(shí)體器官移植結(jié)果的潛力。

1 機(jī)械灌注

隨著大量ECD 和DCD 供腎被使用，器官保存策略逐漸從傳統(tǒng)的靜態(tài)冷儲(chǔ)存（static cold storage，SCS）向MP 轉(zhuǎn)變。MP 系統(tǒng)由泵、管道回路、灌注液、熱量和氧氣交換器以及控制系統(tǒng)等多部分組成［5］。將器官血管連接到MP 系統(tǒng)上，可以持續(xù)灌注離體器官以提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并及時(shí)帶走代謝廢物。在這過(guò)程中，可以往系統(tǒng)中加入不同藥物對(duì)器官進(jìn)行治療干預(yù)，以及多次抽取樣本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。根據(jù)溫度的不同，MP 可以分為低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP，4℃）和常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP，37℃）。

1.1 HMP：目前，HMP 是腎移植中運(yùn)用最廣泛的MP 技術(shù)，其通過(guò)可控的方式向離體器官持續(xù)灌注冷保存液［6］。HMP 的作用機(jī)制與SCS 相似，通過(guò)低溫降低器官的新陳代謝和需氧量來(lái)最大程度減少I(mǎi)RI。此外，HMP 還有助于維持eNOS 等關(guān)鍵基因的表達(dá)來(lái)保護(hù)血管內(nèi)皮［7］，改善再灌注期間的循環(huán)。國(guó)內(nèi)外多個(gè)臨床研究已證實(shí)，HMP 較SCS 可有效降低DGF 的發(fā)生率，改善腎移植的結(jié)果［8-10］。一項(xiàng)包含15 個(gè)臨床研究的薈萃分析顯示，無(wú)論是DBD 還是DCD 來(lái)源的供腎，HMP 均能降低DGF 的風(fēng)險(xiǎn)［11］。在另一項(xiàng)回顧性研究中也得到了有關(guān)DGF 的類(lèi)似結(jié)論［12］。部分研究還顯示，HMP 組具有更高的移植物存活率［8-10］，但這種益處尚未在其他研究中發(fā)現(xiàn)。

1.2 NMP：為了進(jìn)一步改善器官的功能，體外器官保存由降低新陳代謝向模擬細(xì)胞正常的生理環(huán)境轉(zhuǎn)變，這導(dǎo)致了NMP 的出現(xiàn)。與HMP 相比，NMP 對(duì)技術(shù)要求更高，并且由于SCS 和HMP 較好的保存效果，人們一度失去對(duì)NMP 的關(guān)注。近年來(lái)，由于邊緣器官的大量使用，DGF 的發(fā)病率不斷升高，同時(shí)NMP 技術(shù)不斷發(fā)展，使得人們重新重視起NMP。NMP 可向器官灌注常溫含氧保存液來(lái)維持細(xì)胞正常新陳代謝，從而避免了冷缺血損傷，更好保存了器官功能。目前，NMP 已成功運(yùn)用到臨床肝臟、腎臟和肺移植中，并顯示出改善移植物功能的潛力。Nasralla 等［13］在2018 年報(bào)道了第一個(gè)有關(guān)NMP 在肝移植中運(yùn)用的國(guó)際性多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NMP 較SCS 能顯著改善肝移植的結(jié)果，并降低了等待肝移植患者的病死率。這項(xiàng)研究說(shuō)明NMP 是一種切實(shí)可行的技術(shù)，對(duì)其轉(zhuǎn)化為其他固體器官移植具有重要意義。Hosgood 等［14］于2011 年報(bào)道了NMP 在腎移植中的首次運(yùn)用，并在隨后發(fā)表了第一個(gè)單中心臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示NMP 在降低DGF 發(fā)生率方面優(yōu)于SCS（5.6%比36%）［15］。另外，該小組還提出了一個(gè)基于NMP 的評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)估移植前DCD 腎臟的質(zhì)量，將一些原本會(huì)被丟棄的腎臟成功用于移植，這有助于提高邊緣供腎使用率，緩解器官短缺［16］。更重要的是，NMP 接近常溫的微環(huán)境為細(xì)胞治療提供了一個(gè)靶向器官的平臺(tái)。NMP 可將治療用的細(xì)胞直接輸送到器官，減少全身暴露的不良反應(yīng)。在眾多細(xì)胞療法中，MSC 具有抗炎、再生和免疫調(diào)節(jié)的潛力，其與NMP 聯(lián)合使用有望進(jìn)一步改善腎移植結(jié)果。

2 MSC

MSC 是一群具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的異質(zhì)性成體干細(xì)胞，最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后人們?cè)谥窘M織和臍帶組織中也分離出MSC［17］。目前使用的MSC 主要來(lái)源于骨髓，但脂肪和臍帶組織來(lái)源的MSC 因其數(shù)量多、創(chuàng)傷小也被廣泛使用，同時(shí)也使用來(lái)自肌肉、牙齒的MSC［18］。不同來(lái)源的MSC 之間存在微小差別，尚不清楚這是否對(duì)治療效果產(chǎn)生影響［19］。鑒于MSC 來(lái)源和分離方法的多樣性，國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)在2006 年制定了MSC 體外鑒定的標(biāo)準(zhǔn)［20］：① 貼壁生長(zhǎng)；② CD105、CD73 和CD90 陽(yáng)性率大于95%，CD45、CD34、CD14、CD79和HLA-DR 陽(yáng)性率小于2%；③ 具有向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。此外，MSC 不表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子，低表達(dá)MHC-Ⅰ類(lèi)分子和共刺激分子，這使得MSC 具有很好的低免疫原性，不易被受者的免疫系統(tǒng)識(shí)別［21］。

MSC 的治療作用及機(jī)制：MSC 因其獨(dú)特的抗炎、促進(jìn)組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)特性，在腎移植及其它實(shí)體器官移植領(lǐng)域有著廣泛的運(yùn)用，該過(guò)程有賴(lài)于MSC 強(qiáng)大的旁分泌能力。MSC 可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)局部的免疫微環(huán)境從而影響離體器官的炎癥、組織再生和免疫反應(yīng)過(guò)程［22］。另外，MSC 與免疫、內(nèi)皮等細(xì)胞間的直接接觸也是發(fā)揮作用的關(guān)鍵。細(xì)胞間接觸形成的納米管隧道可作為細(xì)胞間的通訊方式，促進(jìn)線粒體、離子和RNA等物質(zhì)的交換［23］。

在大鼠腎移植模型中已證實(shí)，動(dòng)脈注射MSC可以減少免疫細(xì)胞在腎臟的浸潤(rùn)、降低炎癥基因表達(dá)和改善早期腎功能［24-25］。MSC 減少I(mǎi)RI 的抗炎能力與其通過(guò)分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等介質(zhì)來(lái)抑制巨噬細(xì)胞激活以及促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 極化有關(guān)［26］。MSC 還可以向受損組織遷移，通過(guò)分泌可溶性因子來(lái)刺激附近細(xì)胞進(jìn)行組織修復(fù)，這些因子具有抗凋亡、抗纖維化和促血管生成的作用［27］。另外，MSC 來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（extracelluar vesicle，EV）也被認(rèn)為是一種特殊的旁分泌因子。EV 中含有多種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、miRNA 和mRNA，這些物質(zhì)釋放到靶細(xì)胞后可以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，并且EV 還可通過(guò)轉(zhuǎn)移細(xì)胞器來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活［28］。

除了減少I(mǎi)RI，MSC 在腎移植中的另一個(gè)重要作用是調(diào)節(jié)受者免疫系統(tǒng)。動(dòng)物移植模型顯示，MSC 可以抑制T、B 細(xì)胞的增殖、抑制樹(shù)突細(xì)胞的成熟、促進(jìn)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的增殖來(lái)治療急性排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受［29］。目前，臨床上開(kāi)展了Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)來(lái)評(píng)估MSC 的安全性和有效性。Perico 等［30］報(bào)道了在2 例活體腎移植受者術(shù)后第7 天靜脈輸注自體骨髓來(lái)源MSC（bone marrow-MSC，BM-MSC）的效果，發(fā)現(xiàn)2 例患者的Treg 百分比逐漸增加，而CD8+T 細(xì)胞增殖減少。在后續(xù)長(zhǎng)期隨訪中1 例患者停用了免疫抑制劑，且沒(méi)有出現(xiàn)排斥反應(yīng)［31］，這為單次使用MSC 誘導(dǎo)長(zhǎng)期免疫耐受提供了證據(jù)。一項(xiàng)前瞻性研究顯示了MSC減少免疫抑制劑的作用，供體來(lái)源MSC 聯(lián)合低劑量他克莫司的效果與標(biāo)準(zhǔn)劑量他克莫司方案類(lèi)似，急性排斥發(fā)生率、移植物功能和移植物存活率沒(méi)有差異［32］。此外，Reinders 等［33］報(bào)道了自體BM-MSC 治療亞臨床排斥的效果，發(fā)現(xiàn)大部分受者的T 細(xì)胞功能受到抑制，并且組織學(xué)上觀察到小管炎癥的消退。

總的來(lái)說(shuō)，MSC 在腎移植中的運(yùn)用主要集中在減少I(mǎi)RI、降低急性排斥發(fā)生率以及減少免疫抑制劑用量甚至免疫耐受，而介導(dǎo)這些過(guò)程的機(jī)制包括，MSC 旁分泌多種可溶性因子和EV 以及細(xì)胞間直接接觸互作。

3 機(jī)械灌注聯(lián)合MSC

盡管MSC 在腎移植領(lǐng)域取得了一些令人鼓舞的結(jié)果，但是靜脈輸注MSC 具有一定的局限性，這限制了MSC 在臨床上進(jìn)一步使用。首先，靜脈輸注會(huì)使MSC 主要駐留在肺的毛細(xì)血管中，不向受損的腎臟遷移，有導(dǎo)致肺栓塞的風(fēng)險(xiǎn)［34］。其次，靜脈給藥會(huì)增加全身暴露的風(fēng)險(xiǎn)，引起不必要的不良反應(yīng)。最后，靜脈輸注對(duì)MSC 數(shù)量的可控性較小，數(shù)量少容易不起作用，數(shù)量多時(shí)易造成肺栓塞。而將MP 與MSC 結(jié)合可有效避免以上問(wèn)題，MP 在體外可繞開(kāi)肺屏障將MSC 靶向輸送到腎臟，以及更加自由地控制灌注系統(tǒng)中MSC 的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)局部給藥優(yōu)化治療效果。

為了探究MP 聯(lián)合MSC 的可行性，Parraga 等［35］率先研究了NMP 條件對(duì)MSC 的影響。研究發(fā)現(xiàn)，懸浮狀態(tài)和凍融過(guò)程都會(huì)不同程度降低人MSC 和豬MSC的存活率。并且凍融過(guò)程還會(huì)增加氧化應(yīng)激，降低MSC 與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力。盡管NMP 所需的條件對(duì)MSC 產(chǎn)生了一些負(fù)面影響，但MSC 分泌的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子卻未受到明顯影響，這為MSC 在NMP期間輸注的可行性提供了重要證據(jù)［35］。

Pool 等［36］則研究了NMP 期間向豬腎灌注人源MSC 的可行性。豬腎在常溫下灌注7 h，并在灌注液中加入人脂肪組織來(lái)源的MSC（adipose tissue-MSC，AT-MSC）以及熒光標(biāo)記的人BM-MSC。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMP 期間所有腎臟均有功能（消耗葡萄糖和氧氣，產(chǎn)生尿液），并且在部分腎小球中檢測(cè)到結(jié)構(gòu)完整的MSC。這說(shuō)明NMP 期間MSC 可以到達(dá)并駐留在腎臟，且保留潛在的生物活性。該小組隨后發(fā)現(xiàn)，在豬腎NMP 期間加入人MSC 可降低損傷標(biāo)記物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL） 和 乳 酸 脫 氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平，提高肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）水平［37］。這為MP 聯(lián)合MSC 可減少腎臟IRI 提供了進(jìn)一步證據(jù)。另外，據(jù)報(bào)道，MP 期間MSC 還能通過(guò)重編程能量代謝所需的關(guān)鍵酶來(lái)保護(hù)腎臟免受IRI［38］。

Lohman 等［39］在豬腎自體移植模型中進(jìn)一步評(píng)估NMP 聯(lián)合MSC 治療的腎臟用于移植的可行性、安全性和潛在獲益。豬腎先后經(jīng)歷熱缺血和HMP來(lái)模擬IRI，然后在常溫下灌注240 min，并加入人或豬來(lái)源的AT-MSC。該腎臟用于自體移植，并監(jiān)測(cè)移植后14 d 內(nèi)潛在的MSC 治療相關(guān)的腎臟改善情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMP 期間加入MSC 不影響血流動(dòng)力學(xué)，對(duì)移植早期結(jié)果也沒(méi)有產(chǎn)生不良影響。在14 d 內(nèi)，MSC 不影響血肌酐、腎小球?yàn)V過(guò)率、NAGL 和組織學(xué)損傷評(píng)分。這說(shuō)明，在腎臟離體NMP 期間輸注MSC 是安全可行的，盡管在移植后早期尚未發(fā)現(xiàn)MSC 治療的獲益。

除了臨床前動(dòng)物模型，MP 聯(lián)合MSC 在人類(lèi)腎臟中的運(yùn)用也有報(bào)道。Brasile 等［40］評(píng)估了MP聯(lián)合MSC 加速I(mǎi)RI 腎臟修復(fù)的潛力。該研究采用的是一種類(lèi)似NMP 的無(wú)血代謝支持（exsanguinous metabolic support，EMS）平臺(tái)，對(duì)5 對(duì)丟棄的DCD供腎進(jìn)行24 h 灌注，其中配對(duì)腎臟添加MSC。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSC 治療可以導(dǎo)致腎臟合成炎癥因子減少，ATP 及生長(zhǎng)因子合成增加，細(xì)胞骨架正?；?。更重要的是，與單獨(dú)EMS 灌注相比，MSC 處理的腎臟顯示出有絲分裂的細(xì)胞顯著增加，這首次證明了人類(lèi)IRI 腎臟在離體灌注下是可以實(shí)現(xiàn)再生的［40］。另外一個(gè)小組也報(bào)道了在NMP 期間使用多能成體祖細(xì)胞（multipotent adult progenitor cell，MAPC）對(duì)人類(lèi)DCD 腎臟進(jìn)行修復(fù)的證據(jù)［41］。MAPC 與MSC 非常相似，本質(zhì)上是不同培養(yǎng)和擴(kuò)增方案的產(chǎn)物［42］。研究結(jié)果顯示，接受MAPC 治療的腎臟尿量生成增加，損傷標(biāo)志物NGAL 減少，并且超聲造影提示MAPC 組的腎臟微循環(huán)和灌注得到了改善［41］。這種有益的結(jié)果可能得益于促炎因子向抗炎因子轉(zhuǎn)變。

4 總 結(jié)

目前關(guān)于MP 聯(lián)合MSC 在腎移植領(lǐng)域運(yùn)用的研究較少，大部分研究集中在可行性和安全性上。盡管部分研究展示了兩者聯(lián)合在治療和修復(fù)器官上的潛力，但其臨床相關(guān)性和治療效果的具體機(jī)制仍未明確。另外，關(guān)于MP 期間使用MSC 的最佳劑量、灌注時(shí)間以及MSC 的種類(lèi)（自體或異體），在這些問(wèn)題上人們還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)。此外，使用MSC 有潛在的過(guò)度免疫抑制以及惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，但目前還未發(fā)現(xiàn)MSC相關(guān)的直接毒性、惡性腫瘤和感染的報(bào)道。因此，未來(lái)還需要更多的研究來(lái)證實(shí)兩者聯(lián)合運(yùn)用的益處和潛在機(jī)制。總的來(lái)說(shuō)，MP 提供了一個(gè)靶向治療、修復(fù)和再生的器官保存平臺(tái)，而基于MSC 的抗炎、再生和免疫調(diào)節(jié)作用，這兩者的聯(lián)合對(duì)于治療器官、提高器官質(zhì)量和增加供體器官使用率具有重要意義。