韋松松，謝曉東，陳帥君，黃海東，楊紅澎，吳疆

河流弧菌B7-1羧肽酶基因的克隆與功能鑒定

韋松松，謝曉東，陳帥君，黃海東，楊紅澎，吳疆通信作者

（天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院，天津300392）

羧肽酶是一類外切酶，它能專一性地從肽鏈C末端逐一切下單個氨基酸，在生物體中多以酶原的形式存在。近年來無論是在生物界還是在醫(yī)學行業(yè)，羧肽酶越來越引起人們的關注。本研究從細菌中提取全基因組，設計上下游引物進行編碼羧肽酶基因的克隆，將擴增的羧肽酶基因轉入到TOP10大腸桿菌中進行質粒擴增，然后在BL-21大腸桿菌中進行目的蛋白的表達，通過對其表達的羧肽酶進行定性定量分析，可以確定重組的包含的羧肽酶基因在大腸桿菌中成功表達。

基因；羧肽酶；酶活；Folin-酚法

羧肽酶是一類肽鏈外切消化酶，它可以專一性地從肽鏈C末端逐一切下氨基酸，使切下的氨基酸成為游離狀態(tài)。根據(jù)羧肽酶活性中心含有的絲氨酸殘基、金屬離子、半胱氨基酸殘基的不同，可將羧肽酶分為絲氨酸羧肽酶、金屬羧肽酶以及半胱氨基酸羧肽酶[1]。

絲氨酸羧肽酶是一類屬于α/β水解酶家族的酸性羧肽酶，其家族成員眾多[2]，主要存在于植物或真菌的液泡以及動物的溶酶體中[3]。在酸性環(huán)境下，絲氨酸羧肽酶具有末端蛋白水解酶、酯酶和脫酰胺酶的活性，可同時參與多肽和蛋白質的加工、修飾與降解等重要環(huán)節(jié)[4]。金屬羧肽酶是一類在酸性或弱堿性條件下具有極大活性，能夠幫助蛋白質消化的一類細胞外羧肽酶，分為羧肽酶A、羧肽酶B、甘氨酸羧肽酶、賴氨酸羧肽酶、谷氨酸羧肽酶（又名羧肽酶G）。半胱氨酸羧肽酶多存在于動物的消化道及心臟、肝等組織的細胞液中，對C-末端氨基酸具有廣譜性，但是對C-末端Pro無活性，內(nèi)切酶活性較低[5-6]。

羧肽酶常常被用于醫(yī)藥、食品、飼料加工等行業(yè)，且用量較大。在生物技術領域，羧肽酶可用于多肽的合成以及多肽氨基酸序列測定[7]?，F(xiàn)階段羧肽酶主要來源于動物胰臟，但數(shù)量有限且價格昂貴，因此，羧肽酶的應用受到了一定的限制。在微生物中提純羧肽酶基因，并借助基因工程策略以微生物為宿主進行大量生產(chǎn)重組羧肽酶，來克服羧肽酶來源限制。本研究擬從河流弧菌B7-1菌株中克隆羧肽酶基因并對其活性進行研究，以期為羧肽酶基因工程生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

（B7-1）細菌全基因組、大腸桿菌。

1.1.2 酶

Mix、Fast DigestH I、Fast DigestⅠ、Repligation Mix（2×）。

1.1.3 引物

克隆羧肽酶基因（）所需引物：上游引物5'-atgaaatgccgttcaaaattatc-3'（下劃線為H I酶切位點）、下游引物5'-cgattgcttgatcatgtccacc-3'（下劃線為Ⅰ酶切位點）。

1.1.4 試劑與試劑盒

質粒小提純化試劑盒、普通DNA純化試劑盒、2×PCR Master Mix、DNA MarkerⅢ，TIANGEN公司；硫酸卡那霉素、Folin-酚蛋白定量試劑盒、L-Tyrosine和瓊脂粉，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、EDTA Na2·2H2O（二水乙二胺四乙酸二鈉），GENVIEW公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆

PCR總體系為25 μL。以25 μL PCR產(chǎn)物為模板進行200 μL體系的擴增和產(chǎn)物純化，擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，對擴增的目的基因進行驗證。

1.2.2 載體質粒pET28a提取

取5 mL培養(yǎng)12～16 h的菌液（pET-28a質粒），加入離心管中，按照質粒小提試劑盒操作步驟提取質粒。

1.2.3 基因與載體雙酶切和連接

為使目的基因和載體準確連接，先對目的基因和載體進行雙酶切，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。酶切體系為200 μL，包括酶（H I、Ⅰ）各2 μL、10×Fast Digest Buffer 20 μL、目的基因pET-28a質粒載體50 μL、去離子水126 μL。37 ℃酶切3 h，并對酶切產(chǎn)物進行純化回收，然后對回收產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，驗證完畢后進行保存。

連接體系10 μL，22 ℃放置20 min，獲得連接產(chǎn)物。采用熱激轉化法將連接產(chǎn)物轉入Top10感受態(tài)細胞中，并進行電泳驗證是否連接成功。連接成功后提取質粒并用同樣的熱激轉化法將質粒轉入BL-21大腸桿菌細胞中進行重組蛋白表達。

1.2.4 目標蛋白的表達

1.2.4.1 目標蛋白表達誘導劑（IPTG）濃度確定

取6個250 mL搖瓶，編號1～6，于每個搖瓶中加入10 mL培養(yǎng)12 h的菌液，分別加入IPTG，使終濃度梯度從0.05 mmol/L到0.50 mmol/L，28 ℃ 160 r/min搖床震蕩培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)好的菌液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以確定IPIG最佳濃度。

1.2.4.2 目標蛋白表達隨時間變化試驗

取1個250 mL搖瓶，加入100 mL菌液，每隔一定時間取出16 μL，加入4 μL SDS-Loading buffer，煮沸3 min，進行蛋白電泳，染色、脫色并拍照。

1.2.4.3 目標蛋白的分離純化

將已轉入BL-21的菌株擴大培養(yǎng)至200 mL，37 ℃培養(yǎng)12 h，加入最佳濃度的IPTG（0.2 mmol/ L），28 ℃誘導4 h，用His標簽蛋白純化試劑盒進行蛋白純化。試驗結束后，將流穿液與洗脫液進行SDS-PAGE凝膠電泳驗證，方法參照1.2.4.1。

1.2.5 羧肽酶活性鑒定

1.2.5.1 羧肽酶定性驗證

將目的菌株（未用IPTG誘導的基因工程菌株）與BL-21空菌分別稀釋梯度為10-1、10-2、10-3（加上原菌共4個稀釋梯度）。在超凈工作臺下，先在培養(yǎng)基上涂抹10 μL IPTG，待其風干后，向培養(yǎng)基中滴加不同濃度的稀釋菌液，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，待培養(yǎng)基中長出小菌落后，觀察對比，拍照記錄。

1.2.5.2 Folin-酚試劑測定酪氨酸含量

用脫脂奶粉配成1%酪蛋白溶液，取5支試管，其中1支試管中不加羧肽酶作為對照，另外4支試管標號1～4，分別代表反應1、4、6、10 min。每支試管取6 mL含1%酪蛋白的奶粉溶液和10 μL之前純化的羧肽酶于37 ℃水浴鍋中預熱，使其在37 ℃下分別反應1、4、6、10 min，每支試管反應完全后立即放入沸水中煮沸3 min。用Folin & Ciocalteu酚試劑進行定量分析，方法參照試劑盒說明書。

2 結果與分析

2.1 CPP基因的克隆

圖1中2、3、4孔是克隆的目的基因，由于已知的目的基因大小為2 001 bp，故根據(jù)購買的MarkerⅢ標準與圖1中的3條目的基因大小進行對比驗證，表明克隆的是目的基因。

圖1 CPP瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 pET-28a與CPP基因的雙酶切回收

圖2中第1個孔是Marker，第2個孔是pET-28a質粒酶切純化回收，第3個孔是pET- 28a質粒雙酶切（H I 、I），第4個孔是目的基因雙酶切點樣孔。經(jīng)過與Marker對比，可見條帶大小正確，表明質粒和基因雙酶切成功。

圖2 pET-28a質粒和目的基因酶切驗證

2.3 CPP基因與載體的連接轉化

對轉化的BL-21進行菌液PCR驗證，由圖3可見有明顯的條帶，證明轉化成功。

圖3 重組質粒轉化BL-21菌液PCR結果

2.4 CPP蛋白的誘導表達

對于此目的基因所編碼的蛋白質，根據(jù)計算結果（2001/3×110＝73 370 u≈73 ku，即在從上到下Marker帶的第一和第二條帶之間），在濃度驗證圖和時間驗證圖上都有正確的條帶，見圖4。在確定濃度時發(fā)現(xiàn)，CPP蛋白表達隨誘導劑濃度大小變化范圍不大，故在后續(xù)試驗時選用IPTG濃度為0.2 mmol/L。在確定最佳時間時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)表達4 h時CPP蛋白表達效果較好。因此，在后續(xù)純化回收蛋白時的最佳IPTG濃度為0.2 mmol/L，時間為4 h。

圖4 不同IPTG濃度和誘導時間的電泳結果

注：a為IPTG濃度驗證圖；b為時間驗證圖

使用鎳柱純化目標蛋白（從左至右依次為蛋白Marker、BL-21全菌誘導、BL-21全菌非誘導、流穿液、洗柱液、洗脫液），從圖5可以看出，全菌誘導液在相應位置有目標蛋白的表達，說明目標蛋白成功誘導表達，在洗脫液中看到純化的目標蛋白條帶，表明鎳柱純化成功。

圖5 目的蛋白純化結果

注：1為全菌誘導；2為全菌非誘導；3為流穿液； 4為洗柱液；5～13為洗脫液

2.5 CPP催化活性的鑒定

由圖6可見，平板左側4個菌落從上到下依次為100、10-1、10-2、10-3濃度的BL-21空菌落，右側與左側濃度對應，是轉化成功的BL-21菌株。

圖6 羧肽酶催化活性鑒定結果

從表1中菌落外內(nèi)直徑差進行比對發(fā)現(xiàn)，未進行轉化的空菌（左側菌落）分解蛋白質的能力弱于帶有目的基因的菌株（右側菌落）。說明轉化成功的BL-21菌株產(chǎn)羧肽酶能力強于BL-21空菌。

表1 不同菌液稀釋度對蛋白水解圈的影響 cm

指標菌液稀釋度 10010-110-210-3 左右左右左右左右 內(nèi)徑0.200.200.200.200.200.300.200.20 外徑0.400.500.450.500.500.550.300.40 外-內(nèi)0.200.300.250.300.300.250.100.20

2.6 反應時間對酶活的影響

在測量羧肽酶活力時，根據(jù)表2中的吸光度數(shù)值計算各個時間段的酶活。圖7為酪氨酸標準曲線，通過計算可知在反應1 min時吸光度值為負，可能是因為反應時間不夠充足，在以未加羧肽酶的試管為對照進行吸光度值測定時，數(shù)值為負，在4、6、10 min 時的值隨著時間的增長而增加，此時符合酶的特性。

圖7 Folin測酪氨酸標準曲線

表2 反應時間對樣品酪氨酸吸光度值的影響

測定時間/min14610 吸光度值0.0000.0100.056 0.210 酪氨酸含量/μg?mL-1-1.1246.29223.596 U-1.6806.29214.158

注：定義為10 μL羧肽酶在1 min產(chǎn)生1 μg酪氨酸；表中“-”表示未檢測到數(shù)值

3 討論與結論

羧肽酶基因在高等生物中分布非常廣泛, 是一個龐大的水解酶基因家族。本研究從實驗室分離得到的河流弧菌B7-1中克隆其羧肽酶基因，并連接至大腸桿菌表達載體pET-28a，利用IPTG誘導表達CPP融合蛋白。在純化融合蛋白時，采用Ni2＋層析柱進行親和純化，并用SDS-PAGE分析純化結果，最后對純化蛋白進行活性鑒定。

目前，大多數(shù)羧肽酶研究集中于其在動物疾病中的作用，也有研究表明羧肽酶基因及其啟動子在植物抗逆境脅迫中發(fā)揮著重要功能[8]。本研究從河流弧菌B7-1羧肽酶的催化功能入手，鑒定了其催化蛋白水解的催化能力，為進一步對其進行深入研究與應用奠定了基礎。在本試驗過程中，測得在1、4、6、10 min下的酶催化活性，可以看出除了反應開始的1 min外，催化活性均隨時間的增加而上升。由定量測定結果表明，轉入羧肽酶基因的比未轉化的具有更高的催化活性，從而明確了B7-1菌株羧肽酶基因的催化功能。

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Cloning and functional identification ofB7-1 carboxylpeptidase gene

Wei Songsong, Xie Xiaodong, Chen Shuaijun, Huang Haidong, Yang Hongpeng, Wu JiangCorresponding Author

（College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

Carboxypeptidase is a type of exonuclease that can specifically cleave individual amino acids one by one from the c-terminus of a peptide chain. In recent years, carboxypeptidase has attracted more and more attention in both biological and medical industry. In this study, the whole genome was obtained from bacterial, and an upstream primer and a downstream primer were designed to amplify the target gene encoding carboxypeptidase. The amplified target gene was transferred into TOP10for recombinant amplification, and then the target protein was expressed inBL-21. Qualitative and quantitative analysis of the carboxypeptidase expression revealed that the recombinant strain containing the carboxypeptidase gene ofhad strong capability of expressing carboxypeptidase and strong expressed enzyme activity.

gene; carboxypeptidase; enzyme activity; Folin-phenol method

1008-5394（2022）02-0018-04

10.19640/j.cnki.jtau.2022.02.004

Q786

A

2020-11-25

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202010061011）；天津市科技計劃項目（20ZYCGSN00390）

韋松松（2000—），男，本科在讀，主要從事植物基因工程方面的研究。E-mail：jcn30631191@126.com。

吳疆（1976—），男，副教授，博士，主要從事植物分子生物學方面的研究。E-mail：wujiangjack@tjau.edu.cn。

責任編輯：宗淑萍